专利名称：一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术：
近年来，随着现代医疗水平的提高，癌症、艾滋病、器官和骨髓移植等病人的存活 率大大上升，但是这些患者由于经常使用大剂量抗生素、抗肿瘤药物、激素、免疫抑制剂等 药物，以及化疗和静脉插管、血液透析等介入性治疗，造成免疫力下降，极易被本来不显病 原性的条件致病真菌侵入造成深部真菌病(Systemic fungal infection)。近年来这种严 重威胁生命的真菌感染呈快速增长趋势，患者人数不断增加。在临床上，随着真菌感染率的上升，对抗真菌药物的使用率提高了，随之而来耐药 菌株也不断增多，给临床的治疗带来一定的困难。而抗真菌新药相对于抗细菌感染药而显 得滞后，因此寻找安全、高效、低毒、广谱的新型抗真菌物质已越来越引起人们的重视。造成深部真菌病的病原菌主要为念珠菌属和曲霉属，其中白色念珠菌(Candida albicans)是一类主要的病源真菌，可感染人体许多部位，包括内脏及中枢神经。它是造成 医院血液感染的主要原因，在伤口和体液中感染时具有很强的致死性，而且临床研究发现 其致死率并不随常规抗真菌药物的使用而下降。侵入性真菌感染现象尽管相对较为少见，但其总发病率在过去的20年内节节攀 升。据Datamonitor预测，到2010年，在900万高危疾病患者中，有120万患者将面临真菌 感染的威胁。过去，真菌感染一般只发生在特定的亚群患者中，然而随着化疗、移植、HIV/ ADIS感染或糖尿病等免疫受损患者数量的增多，尤其对接受长期治疗的患者来说，真菌感 染的高发危险使抗真菌治疗受到了越来越广泛的关注。由于侵入性真菌感染(IFIs)的预 防和治疗领域正逐渐向接受化疗、移植以及HIV/ADIS或糖尿病患者等人群扩展，这也预示 了抗真菌药物市场潜力的巨大。抗真菌药物市场是一个成熟的市场，然而从产品的类别和数量来看，抗真菌药 却远不如其他抗菌药物那样多而全面。世界上第一种抗真菌药是于20世纪50年代 问世的，然而一直到1978年，市场上可用于治疗全身性真菌感染的药品仅为两性霉素 B (amphotericins B, Am B)、制霉菌素(nystatin)和氟胞嘧啶(flucytosine)等 3 种。在 其后的几十年里，虽然也有数十种抗真菌药上市，但是真正占市场主导地位的广谱抗真菌 药却只有为数不多的几种。近10年来(1996 2005)，各国报道的新抗真菌抗生素约有174 种，化学结构多达30余个类型，其中有一部分抗生素专抗植物真菌，而大多数抗动物真菌 的抗生素或因抗真菌谱过窄，体内活性微弱，或因细胞毒性较强等，天然物本身与经过结构 修饰的产物，具有发展前景者不多。目前临床上常用的抗真菌药物按其作用机理可分为三大类1)干扰真菌核酸合 成药物，如灰黄霉素和氟胞嘧啶等，这类药物由于毒性大，抗菌谱窄、复发率高等问题，目 前已很少使用。2)干扰真菌细胞膜麦角固醇合成的药物，如多烯类抗生素(两性霉素B、 制霉菌素等)、唑类化学合成药(如伊曲康唑、氟康唑等)和丙稀胺类抗生素(特比萘芬
3(Terbinafine)和萘替芬(Naftifine)等)。然而，两性霉素B抗菌效果好，抗菌谱广，是最 常用的抗真菌药物，但由于具有肾毒性而大大限制其应用；唑类药物也是有效的抗真菌药 物，该类药物的开发从第一代的克霉唑已经到了第三代的氟康唑和伊曲康唑等，毒性较小， 有较宽的抗菌谱，但其抗菌活性明显低于两性霉素且易产生耐药性；特比萘芬对深部真菌 感染无效。3)抑制i3-(l，3)-D葡聚糖合成酶的药物，如Meck公司2001年上市的新药卡泊 芬净(Caspofimgin)以及藤泽药品2002年上市的米卡芬净(Micafungin)等，这类药物能 抑制真菌细胞壁合成必需的β-(1，3)- 葡聚糖合成酶，有很好的应用前景。此外，外用疗 法已能治愈大多数浅部真菌病患者，但是能治疗深部真菌病的药物还很少，有些病仍然没 有有效的治疗方法。芽孢杆菌(Bacillus sp.)是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，能产生多种 抗真菌和细菌的代谢物，其中脂肽类、肽类、磷脂类为主要类型，它们对致病菌和内源性感 染的条件致病菌都具有明显的抑制作用。
发明内容
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌菌株，从该菌株发酵液可以分离得到一种抗菌物 质，该物质经ESI/MS^H-NMR及13C-NMR等分析，发现其为分子量402. 5Da的大环内酯类物质。一种枯草芽孢杆菌菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJU007，保藏 于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏 管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo. 4140，保藏时间2010年9月03日。上述菌株主要生物学特征为菌落颜色是灰色，边缘为白色，菌落形态较圆整，表 面有褶皱突起，直径大小为中型(约2mm左右)，菌株产芽孢的时间在培养3天达到高峰，4 天完全成熟。本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌在生产如式(1)所示化合物中的应用。
(1) 本发明菌株产生的抗菌物质对白色念珠菌的抑制作用十分强烈，比目前常用的制 霉菌素有更好的抑菌效果。该抗菌物质不仅对白色念珠菌等酵母类真菌有强烈的抑菌效 果，而且对黑曲霉等丝状真菌也有很好的效果，同时对大肠杆菌等细菌也有较好的抑菌效^ ο
图Ia为本发明菌株的光镜图；图Ib为本发明菌株的电镜图；图2a为温度对发酵液代谢产物抗白色念珠菌效价的影响曲线图；图2b为pH值对发酵液代谢产物抗白色念珠菌效价的影响曲线图；图2c为装液量对发酵液代谢产物抗白色念珠菌效价的影响曲线图；图2d为接种量对发酵液代谢产物抗白色念珠菌效价的影响曲线图；图2e为摇床转速对发酵液代谢产物抗白色念珠菌效价的影响曲线图；图2f为发酵时间对发酵液代谢产物抗白色念珠菌效价的影响曲线图；图3为本发明抗真菌物质HPLC图谱；图4为本发明抗真菌物质ΕΙ/MS分析图谱；图5为本发明抗真菌物质13C-NMR图谱；图6为本发明抗真菌物质1H-NMR图谱。
具体实施例方式培养基(I)LB斜面培养基(％)酵母粉0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0. 5，琼脂2. 0，调ρΗ7· 4 7. 6。(2)种子培养基(% )葡萄糖 1. 5，酵母粉 1. OjK2HPO4O. LMgSO4O. 05,FeSO4O. 001， 调 pH7. 0 后加 CaCO3O. 04。(3)发酵培养基(% )黄豆粉0. 6，可溶性淀粉3. 0，酵母粉1.0, K2HPO4O. 1，NaCl 0. 2，MgSO4O. 005，FeSO4O. 002，pH 6. 5。(4)白色念珠菌培养基(％)葡萄糖2.0，蛋白胨1.0，琼脂2.0。菌株分离纯化土壤样品在浙江东海划定的区域内进行五点交叉采样，每点采取土样10g，放入锥 形瓶内，混勻后取土壤样品10g，加到一个装有90mL无菌水的锥形瓶中，置于摇床上振荡 30min，使土样中的菌体充分分散于水中，即为ICT1菌液。接种环火焰灭菌冷却后蘸取一环 稀释度为KT1菌液，在LB培养基平板上作四区划线接种，30°C培养48h，然后挑取单菌落 划线，进一步纯化。将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，移入无培养基 平皿，30°C培养4d后移入涂布白色念珠菌的平板，琼脂块中心间隔距离为4cm，培养过夜， 根据抑制圈大小选择单菌落进行复筛。复筛采用摇瓶培养法进行，取初筛得到50株菌种， 接入到种子瓶中，250mL锥形瓶中装25mL培养基，初始pH 7. 0，30°C下200r/min培养24h。 再将种子液以8% (ν/ν)的接种量接入到发酵培养基中，250mL三角瓶中装40mL培养基， 28°C、pH6. 5下200r/min培养36h，比较50株菌种所产抗真菌物质抑制白色念珠菌的程度， 最终获得1株最高效抑制白色念珠菌的菌株，编号为ZJU007。LB斜面培养基保藏菌株于 4°C冰箱中，长期保藏采用甘油管保藏法于-20°C冻存。菌株鉴定该菌株主要生物学特征为菌落颜色是灰色，边缘为白色，菌落形态较圆整，表面 有褶皱突起，直径大小为中型(约2mm左右)，菌株产芽孢的时间在培养3天达到高峰，4天完全成熟。在LB平板上培养三天后，挑取单菌落，在光学显微镜以及扫描电镜下观察，具体 如图Ia和图Ib所示。根据孢杆菌16S rRNA保守序列设计下列引物，并由上海生工生物工程公司合成上游引物5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，，利用上述引物对该菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR体系为PCR扩增反应体系 20 μ Lddw14. 25 μ L10XPCR Buffer 2. 0 μ LdNTP mixture 0. 5 μ LTaq 聚合酶0· 25 μ L引物 l(16f)l.OyL引物 2(16R2)l.OyLDNA模板1· 0 μ L (根据浓度定量)PCR反应条件为PCR循环条件95°C预变性5min，循环参数95°C变性lmin，52°C 复性45s，72°C延伸1.5min，重复35个循环后，72°C再延伸lOmin，最后4°C保温。用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。选用条带清晰的产物进行纯化。扩增产物经凝胶电泳回收，并连接到T载体后进行测序，获得了该菌株16s rDNA 一级结构的1513bp特征序列(如SEQ ID NO. 1所示)。通过在Genebank数据库中进行相 似性搜索(blast)，结果发现其与枯草枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis isolate C8-4的 16s rDNA序列同源性为97% (Genebank的登记号为EU257436. 1)。根据上述特征命名该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ZJU007，保藏于 位于北京市朝阳区北辰西路1号3号院中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管 理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4140，保藏时间2010年9月03日。发酵条件优化取1环经活化的上述菌种，接入到种子瓶中，250mL锥形瓶中装25mL培养基，初始 pH值7. 0，300CT 200r/min培养24h，制得种子液。将种子液接种到含发酵培养基的250mL锥形瓶中，摇床振荡培养，测量在不同发 酵培养温度、培养基PH值、装液量、接种量、摇床转速和发酵时间下发酵液中抗白色念珠菌 的代谢产物的含量(以制霉菌素的效价表示)，其影响曲线分别图2a、图2b、图2c、图2d、图 2e和图2f所示。具体方法如下以白色念珠菌(Candida albicans ATCC 64548)为指示菌，管碟法测量不同效价 的制霉菌素溶液下抑菌圈大小，得到标准曲线方程r2 = 1. 2331g(u)-l. 5926，R2 = 0. 9927。 其中U 制霉菌素效价(U/mL)，r 抑菌圈半径(cm)。然后管碟法测量不同条件下获得的发酵液的抑菌圈大小，通过标准曲线换算成制 霉菌素的效价。通过分析各影响曲线，最佳发酵条件为温度28°C，pH 6.5，摇床转速2001·/ min，接种量8%，装液量40mL/250mL，发酵时间36h。管碟法具体如下将37°C恒温培养2d的白色念珠菌斜面，用30mL无菌生理盐水洗下制成菌悬液，取2mL至IOOmL于50°C的沙氏固体培养基中，混合均勻后吸取20mL至直 径9cm的培养皿中，冷却后放置牛津杯于培养基表面，取150 μ L待测液加入牛津杯中，37°C 培养18h，测量透明抑菌圈直径。设置发酵培养参数如下温度28°C，pH 6. 5，摇床转速200r/min，接种量8%，装液 量4(^17250!^，发酵时间36h，发酵3个批次，得到发酵液抗白色念珠菌的效价分别为第一批发酵效价为7060U/mL ；第二批发酵效价为7250U/mL ；第三批发酵效价为 7120U/mL，抗白色念珠菌的效价平均值为7143U/mL。抗菌物质的分离纯化及分析将第一批发酵液5000r/min离心15min ；清液用IN的HCl调pH3. 0，然后用等体 积乙酸乙酯萃取3次；乙酸乙酯部分采用硅胶(Merck，USA)柱色谱(Φ2. 5X20cm)进行分 离，乙酸乙酯/甲醇为流动相，采用阶跃增加乙酸乙酯/甲醇(100 0,80 20,60 40， 40 60,20 80,0 100)体积比的方法洗脱；收集100 % (ν/ν)乙酸乙酯洗脱液，上 Sephadex LH20 (GE Healthcare Life Sciences)柱(Φ 2 X 97cm，流动相甲醇 / 氯仿(ν/ν =4 1))，流速为lcm/min，收集体积比(洗脱体积/总流动相)在0. 65 0. 8之间的部 位；洗脱液减压蒸干，采用C18制备高效液相色谱(OSD，08X250cm,5um)进行纯化(流动 相甲醇/水(70 30，ν/ν)；流速1. 5mL/min, 254nm检测)，得到抗真菌物质。(2)抗真菌代谢物HPLC分析采用Agilent-IlOO (Agilent Technologies，USA)高效液相色谱分析。分析柱 Agilent ZORBAX SB-C18 柱(5 μ m，Φ4. 6讓X25(kim)；流动相A 甲醇；B 水；梯度洗脱(ν/ ν) :5 35% Α(0 30min)，35 45% A(30 60min)；流量lmL/min ；检测波长254nm ； 柱温25 °C，结果如图3所示。(3) EI-MS 分析采用APEX III傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(Bruker Daltonics,USA)进行样 品的电喷雾质谱(ESI/MS)分析，条件为电离电压32V ；喷雾电压5kV ；样品温度320°C ；扫 描荷质比(m/z)范围150 600Da ；检测方式正离子，分析结果如图4所示。由图谱分析可知，[M+NH4+] = 420，[M+Na+] = 425，说明化合物的分子量Mr = 402. 5。质核比(m/z)为385的离子峰为其脱水产物。(4) NMR (1H 和 13C)分析采用unitINOVA 500型核磁共振仪(Varian，USA)进行样品氢谱(1H-NMR)和碳谱 (13C-NMR)的测定，条件振动频率500MHz ；溶剂氘代氯仿；化学位移(δ )定标试剂四甲 基硅烷，分析结果如图5和图6所示。化学位移在166. 289处的峰表示该物质含有内环酯基(R1-COO-R2)，19. 901处表示 含有一个CH3, 20-40处表示含有6个CH2,120-140处含有双键。总计24个碳原子，其中2 个季碳，16个CH，6个CH2,1个CH3。氢原子34个，含有3个0H。由此可知该物质为一大环 内酯类物质，分子式为C24H34O5,结构如下所示
权利要求
一种枯草芽孢杆菌，其特征在于命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJU007，保藏号为CGMCC No.4140。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在生产如式(1)所示化合物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用，该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJU007，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.4140，保藏时间2010年9月03日。本发明菌株产生的抗菌物质对白色念珠菌的抑制作用十分强烈，比目前常用的制霉菌素有更好的抑菌效果。该抗菌物质不仅对白色念珠菌等酵母类真菌有强烈的抑菌效果，而且对黑曲霉等丝状真菌也有很好的效果，同时对大肠杆菌等细菌也有较好的抑菌效果。
文档编号C12N1/20GK101974465SQ201010521030
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者吴绵斌, 张书衍, 贺娟, 陈华 申请人:浙江大学