专利名称：一种链霉菌及利用该菌发酵制备抗霉素类抗生素的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种能产生抗霉素类抗生素 (antimycins)抗霉素 Al (antimycin Al)、de i soval ery lb lastmyc in > 柱晶白霉素 A(kitamycin Α)和抗霉素 A9 (antimycin A9)的链霉菌 SCSIO 1635 (Streptomyces sp. SCSIO 1635)及利用该菌发酵制备抗霉素类抗生素的工艺。
背景技术：
抗霉素类化合物，具有广泛的生物活性，如抗细菌活性，抗真菌活性，抗蠕虫活性 和线粒体呼吸抑制活性等等。抗霉素Al (antimycin Al)，其结构如式(1)所示，该化合物具有抑制血管再生的 活性，应用于细胞凋亡的研究，还在鱼类的规模养殖中用于除去杂鱼。
NHCHO
3
OH0 1I0 ^12 1crir^11O
1a 1b
R1 R2 Me H H Me
20
式(1)deisovalerylblastmycin，其结构如式(2)所示，该化合物对细菌和真菌有一定 抑制活性。柱晶白霉素AGdtamycinA)，其结构如式(2)所示，该化合物能够抑制植物生长。
NHCHO
R
Kitamycin AR=CH2CH3
Deisovalerylblastmycin R=H
式(2) 抗霉素A9 (antimycin A9)，其结构如式(3)所示，该化合物具有潜在的杀线虫和 昆虫活性。
3
NHCHO
式(3)
发明内容
本发明的第一目的是提供一种能产生抗霉素类抗生素(抗霉素)抗霉素 Al (antimycin Al)、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素 A (kitamycin A)禾口 抗霉素 A9 (antimycin A9)的链霉菌 SCSIO 1635 (Streptomyces sp. SCSIO 1635)，该菌于 2010 年 8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编 号为 CCTCC NO :M2010212o本发明的链霉菌SCSIO 1635是从我国南海北部(E 113° 44.320'，N 21° 14.773')水深65米的海底沉积物中分离获得。通过常规方法PCR扩增该菌的16S rDNA，并测序，其序列如SEQ ID NO. 1所示，提交到GenBank中，得到序列号HM116843。16S rDNA基因序列分析结果显示该菌株与链霉菌S. violascens ISP 5183，S. hydrogenans NBRC 13475τ, S. odorifer DSM 40347τ 和 S. albidoflavus DSM 40455τ 具有较高相似性，分 别为99. 7%，99. 4%，99. 2%和99. 2%。如
图1所示，通过邻接法清晰地揭示了该菌株与一 组链霉菌属物种的系统进化关系，表明该菌属于链霉菌属的一种。将此菌命名为链霉菌 SCSIO 1635 (Streptomyces sp. SCSIO 1635)，该菌于 2010 年 8 月 31 日保藏于中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)Jiyi 中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO :M2010212。本发明的另外一个目的是提供从本发明的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中制 备式(1)、式(2)和式(3)所示的抗霉素 Al (antimycin Al)、deisovalerylblastmycin、柱 晶白霉素A (kitamycin A)和抗霉素A9 (antimycin A9)的工艺。该工艺优选通过以下步骤制备抗霉素Al、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素 A和抗霉素A9 a)制备链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分 离开，发酵液经丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A ；菌丝体先用丙酮浸提，浸取液 回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B ；b)将浸膏A和浸膏B合并，经硅胶柱层析，以体积比100 0 0 100的氯 仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比100 1 100 2的梯度下洗脱下 来的馏分Fr. 1和氯仿-甲醇体积比100 2 100 4的梯度下洗脱下来的馏分Fr. 2，； 馏分Frl经凝胶柱层析，以体积比为1 1的氯仿_甲醇作为流动相洗脱，再经制备薄层层 析，展开剂为体积比为10 1的氯仿-甲醇，收集Rf值为0.75的馏分，得到化合物1，即 为抗霉素Al ；馏分Fr. 2经硅胶柱层析，以体积比8 1 1 1的石油醚-乙酸乙酯作为流动相梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比4 1 3 1的梯度下洗脱下来的馏分 Fr.2-1，收集石油醚-乙酸乙酯体积比2 1 1 1的梯度下洗脱下来的馏分Fr. 2_2 ；馏 分Fr. 2-1经凝胶柱层析，以体积比为1 1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，再经制备薄层 层析，展开剂为体积比为10 1的氯仿-甲醇，收集Rf值为0.55的馏分，得到化合物2，即 为deisovalerylblastmycin ；馏分Fr. 2-2经凝胶柱层析，以体积比为1 1的氯仿-甲醇 作为流动相洗脱，再经制备薄层层析，展开剂为体积比为10 1的氯仿-甲醇，收集Rf值 为0. 6的馏分，得到化合物3，即为柱晶白霉素A，收集Rf值为0. 7的馏分，得到化合物4，即 为抗霉素A9。所述的a)步骤的制备链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物优选通过以下方法制备 的，将活化的链霉菌SCSIO 1635接入种子培养基中，280C，180rpm,培养48h制得种子液，将 种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，28°C，180rpm，振荡培养144h，而制得发酵培 养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有大豆粉20g，蛋白胨 2g，葡萄糖20g,可溶性淀粉5g，酵母膏2g，K2HPO4 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，碳酸钙2g，粗海 盐30g，余量为水，pH 7.4。经本方法制备的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中抗霉素Al、 deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9的含量比较高。所述的a)步骤中的发酵液经丁酮萃取，其优选为发酵液用丁酮萃取4次，所加溶 剂的量为发酵液的2倍体积。通过结构分析，对本发明的从链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中制备4个化合 物一化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的鉴定结果如下化合物1 无色油状，ESI-MS data (m/z 571 [M+Na]+and m/z 547 [Μ-ΗΓ)，其二维核 磁数据如表1所示，该化合物的核磁数据与文献(J Am Chem Soc, 1999,121 =4902-4903)报 道的抗霉素Al基本一致，因此化合物1鉴定为抗霉素Al。表1 化合物 1 的二维核磁数据(500MHz in CDCl3) ( δ ppm，JHz)
权利要求
链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635)，其保藏编号为CCTCC NOM2010212。
2.一种制备抗霉素Al、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A或抗霉素A9的工艺， 其特征在于，抗霉素Al、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A或抗霉素A9是从权利要 求1所述的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中制备得到的。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述的从权利要求1所述的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中制备抗霉素Aldeisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A或抗霉素A9， 具体工艺步骤为a)制备链霉菌SCSIO1635的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开， 发酵液经丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A ；菌丝体先用丙酮浸提，浸取液回收丙 酮后剩余的水混合液用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B ；b)将浸膏A和浸膏B合并，经硅胶柱层析，以体积比100 O O 100的氯仿-甲 醇作为流动相梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比100 1 100 2的梯度下洗脱下来的 馏分Frl和氯仿-甲醇体积比100 2 100 4的梯度下洗脱下来的馏分Fr. 2 ；馏分 Fr. 1经凝胶柱层析，以体积比为1 1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，再经制备薄层层析， 展开剂为体积比为10 1的氯仿-甲醇，收集Rf值为0.75的馏分，得到化合物1，即为 抗霉素Al;馏分Fr. 2经硅胶柱层析，以体积比8 1 1 1的石油醚-乙酸乙酯作为 流动相梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比4 1 3 1的梯度下洗脱下来的馏分 Fr.2-1，收集石油醚-乙酸乙酯体积比2 1 1 1的梯度下洗脱下来的馏分Fr. 2_2 ；馏 分Fr. 2-1经凝胶柱层析，以体积比为1 1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，再经制备薄层 层析，展开剂为体积比为10 1的氯仿-甲醇，收集Rf值为0.55的馏分，得到化合物2，即 为deisovalerylblastmycin ；馏分Fr. 2-2经凝胶柱层析，以体积比为1 1的氯仿-甲醇 作为流动相洗脱，再经制备薄层层析，展开剂为体积比为10 1的氯仿-甲醇，收集Rf值 为0. 6的馏分，得到化合物3，即为柱晶白霉素A，收集Rf值为0. 7的馏分，得到化合物4，即 为抗霉素A9。
4.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述的a)步骤的制备链霉菌SCSIO1635 的发酵培养物是通过以下方法制备的，将活化的链霉菌SCSIO 1635接入种子培养基中， 280C，ISOrpm,培养48h制得种子液，将种子液以10 %的接种量接入到发酵培养基中，28°C， ISOrpm,振荡培养144h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为 每升培养基中含有大豆粉20g，蛋白胨2g，葡萄糖20g，可溶性淀粉5g，酵母膏2g，K2HPO4 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，碳酸钙 2g，粗海盐 30g，余量为水，ρΗ7· 4。
5.根据权利要求3或4所述的工艺，其特征在于，所述的a)步骤中的发酵液经丁酮萃 取，是发酵液用丁酮萃取4次，所加溶剂的量为发酵液的2倍体积。
全文摘要
本发明公开了一种链霉菌及利用该菌发酵制备抗霉素类抗生素的工艺。该菌为链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635)，于2010年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NoM2010212。从链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中的还可制备抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A或抗霉素A9。因此为抗霉类抗生素抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9的生产制备提供了一种新的方法。
文档编号C12N1/20GK101974464SQ201010520348
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月18日 优先权日2010年10月18日
发明者张偲, 张文军, 张长生, 李苏梅, 牛四文, 田新朋, 鞠建华 申请人:中国科学院南海海洋研究所