专利名称：：一种获得转基因棉花的方法
技术领域：
：本发明属于植物转基因
技术领域：
，涉及一种获得转基因棉花的方法，具体涉及一种以棉花茎尖为受体、通过农杆菌介导获得转基因棉花植株的新方法。
背景技术：
：棉花是一种重要的经济作物，在国民经济中占有重要地位。棉花转基因技术在遗传改良方面已取得重大进展，成为生物技术在作物遗传改良中成功应用的范例。目前，转基因植物的遗传转化方法以农杆菌介导转化法应用最为广泛。由农杆菌介导基因转化技术具有不受季节限制、目的基因多为单拷贝或低拷贝、插入边界多为T-DNA左右边界，重排率低、容易排除冗余的质粒DNA序列、容易获得无选择标记的转基因植株等优点而倍受青睐。自从1987年Umbeck等首次报道了通过农杆菌介导法将NPTII基因导入棉花，1994年陈志贤等也利用此法获得导入2，4-D抗性基因的陆地棉植株，随之Bt基因、CPTI基因也相继导入棉花，这种由农杆菌介导基因转化技术迅速发展起来。根据棉花遗传转化受体的类型，棉花以农杆菌介导的细胞核遗传转化主要技术体系有以胚性愈伤组织为受体的转化体系、以下胚轴为受体的转化体系、以茎尖分生组织为受体的转化体系。以胚性愈伤组织和下胚轴为受体的两种转化体系都必须要经过体细胞胚胎发生和植株再生，由于在诱导愈伤组织过程中要经过分化、再分化过程，能产生很多遗传变异和体细胞变异，植株再生困难，转化周期长，目前报道最短的植株再生所用的时间在五个月以上；基因型对棉花体细胞胚胎发生和植株再生具有决定性作用，同一棉属不同棉种之间、同一棉种不同品种之间体细胞胚胎发生和植株再生的能力不同，只有少数品种离体培养的材料可以诱导出胚性愈伤组织，限制了遗传转化的品种范围。以茎尖分生组织为受体的农杆菌转化法不经过脱分化、再分化过程，遗传变异和体细胞变异程度低；受棉花基因型限制的影响较小，许多未能实现体细胞胚胎发生和植株再生的棉花品种也可以成功进行遗传转化。自从Renfroe等报道利用棉花茎尖分生组织获得再生植株以来，国内外很多学者都利用茎尖或茎尖分生组织获得了转基因再生植株。但通常转化率低，且由于不定芽起源于多细胞，嵌合体比较多等因素的限制影响再生苗的获得。
发明内容本发明的目的是提供一种获得转基因棉花的方法。本发明提供的获得转基因棉花的方法，包括如下步骤(1)切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留0.8-3cm的长度(可为0.8-2cm,如0.8-1.5cm,1.5_2cm)，得到待侵染组织；然后25-30°C(如25-28°C，28-30°C)、相对湿度40%-60%(如40%-50%,50%-60%),暗培养2-3天(如2-2.5天，2.5-3天)；所述子叶苗为子叶半展开、下胚轴伸长至4-6cm(如4-5cm，5-6cm)的无菌苗；(2)将暗培养后的待侵染组织双面划伤，划伤范围为从茎尖顶部至下胚轴基部，伤4口深0.8-1.2mm(如0.8-lmm,1-1.2mm)；(3)将划伤的待侵染组织在溶液A中浸染15-45分钟(如15_30分钟，30-35分钟)；所述溶液A中含有携带外源基因的重组农杆菌；(4)侵染完成后共培养2-4天(如2-3天，3-4天)，然后进行抗性筛选，得到抗性棉花苗；(5)将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。相对湿度，表示空气中的绝对湿度与同温度下的饱和绝对湿度的比值，得数是一个百分比(也就是指在一定时间内，某处空气中所含水汽量与该气温下饱和水汽量的百分比)。步骤(3)中，所述溶液A的pH为5.3-5.8(如5.3-5.6,5.6-5.8)，由溶质和水组成；所述溶液A的溶质及其浓度如下乙酰丁香酮40-120illL—1(如40-80u180-120u1I71)，2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)65-85mM(如65_75mM，75_85mM)、葡萄糖2-3%(w/w,质量百分含量)(如2-2.5%，2.5-3%)、激动素(KT)0.08-0.12mgL—1(如0.08-0.lmglAO.1-0.12mgL—1)、含有外源基因的重组农杆菌OD600=0.6-0.8。步骤(4)中，所述抗性筛选可在筛选培养基上进行。所述筛选培养基具体可由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素(KT)、卡那霉素(Kan)和头孢霉素(Cef)组成；筛选培养基中，琼脂的终浓度为7.5g化―1，甘氨酸的终浓度为2mg化―1，激动素的终浓度为0.lmg卡那霉素的终浓度为50-100mgL-1(如50-75mgL-1，75-100mgL-1)，头孢霉素的终浓度为250-500mgI71(如250_375mgL-1，375_500mg。步骤(4)中，所述共培养可在共培养基上进行。所述共培养基具体可由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5g^―1，甘氨酸的终浓度为2mgL—1，激动素的终浓度为0.lmgL—1。所述MS基本培养液的溶剂是水、具体溶质可如表1所示。表1MS基本培养液的溶质大量元素培养基中浓度(gL—1)nh4no31.65kno31.9kh2po40.17MgS047H200.37CaCl20.44微量元素培养基中浓度(mgL—1)5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所述外源基因具体可为抗虫基因Cry2A\AGP启动子或GFP基因；所述抗虫基因Cry2A*的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述AGP启动子的核苷酸序列如序列表的序列2所示；所述GFP基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述重组农杆菌可为用携带所述外源基因的重组质粒转化农杆菌得到的重组农杆菌。所述重组农杆菌具体可为如下(a)或(b)或(c)(a)用重组质粒pTiB0542转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；(b)用重组质粒pBIa⑶S转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；所述重组质粒pBIaGUS是将pBI121的HindHI和XbaI酶切识别位点之间的小片段取代为序列2所示的DNA得到的重组质粒；(c)用重组质粒pBIaGFP转化农杆菌LBA4404得到重组农杆菌；所述重组质粒pBIaGFP是将pBIa⑶S的XbaI和SacI酶切识别位点之间的小片段取代为序列3所示的DNA得到的重组质粒。所述棉花具体可为棉花品种冀丰197或棉花品种鄂抗棉12。以上任一所述方法在可应用于棉花育种。本发明针对目前棉花遗传转化中植株再生困难、遗传变异率高、基因型限制性强和转化周期长，提出一种以棉花茎尖为受体通过农杆菌介导棉花遗传转化的新方法。该方法通过调整茎尖生长状态、确定农杆菌转化的茎尖侵染合适深度、加入乙酰丁香酮并调整适宜的PH值，提高转化效率。利用本发明的方法可以快速获得转基因植株且具有较高的转基因效率。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、应用本发明的方法获得转基因棉花一、重组农杆菌的获得重组质粒pTiB0542中国农业大学保证向公众提供；参考文献重组质粒详细MiifMJALChenH^(2005)ife^"Transgenicindicariceplantsharboringasyntheticcry2A*geneofBacillusthuringiensisexhibitenhancedresistanceagainst1印idopteranricepests.”中第1131至1132页；该重组质粒中携带序列表的序列1所示的抗虫基因Cry2A*。农杆菌EHA105中国农业大学保证向公众提供；参考文献TorregrosaL.，et.al.InfluenceofAgrobacteriumStrain,CultureMedium,andCultivarontheTransformationEfficiencyofVitisviniferaL.Am.J.Enol.Vitic,53,3:183-190。用重组质粒pTiB0542转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。二、转基因棉花的获得鄂抗棉12湖北省种子集团公司，是湖北省农作物品种审定委员会审定品种，品种审定编号为鄂审棉2005010。(一)子叶苗的获得1、棉花种子脱绒50g棉花(鄂抗棉12)种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水中和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。2、将脱绒种子经20%(体积百分含量)双氧水溶液消毒并在摇床上以130转/分摇动5小时，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，放在28°C环境下培养24小时，获得萌发种子。3、将萌发种子在无菌环境下将种壳剥下，将去种壳的棉花种胚种植在发芽培养基上，黑暗培养，温度28°C；获得子叶半展开、下胚轴伸长至4cm的子叶苗。(二)转基因棉花的获得71、相关溶液和培养基的配方溶液A由溶质和水组成，PH5.3；溶质及其浓度如下乙酰丁香酮40iU/L、2-N-吗啉乙烷磺酸65mM、葡萄糖2%(w/w，质量百分含量)、激动素0.08mgL—1、步骤一的重组农杆菌0D6(1(1=0.6-0.8。共培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5gL—1，甘氨酸的终浓度为2mgL—1，激动素的终浓度为0.lmgL—1。筛选培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素(KT)、卡那霉素(Kan)和头孢霉素(Cef)组成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；筛选培养基中，琼脂的终浓度为7.5gL—1，甘氨酸的终浓度为2mgL—1，激动素的终浓度为0.lmgL—1，卡那霉素的终浓度为50mgL—1，头孢霉素的终浓度为250mgL—1。2、转基因棉花的获得(1)培养子叶苗，去除子叶、叶柄和部分下胚轴，保留下胚轴0.8cm左右；25°C、相对湿度40%、暗培养2天(茎尖伸长变直)。(2)用尖锐带1mm弯钩的解剖针将茎尖双面划伤，划伤范围从茎尖的顶部到下胚轴基部，划出深0.8mm左右的伤口，获得划伤茎尖。(3)将划伤的茎尖在溶液A中浸染15分钟；用灭菌滤纸吸干茎尖表面菌液，再将茎尖放置在共培养基上培养2天，获得共培养的侵染茎尖。(4)将侵染茎尖转移到筛选培养基上，筛选3次，每约四周更换一次新鲜的筛选培养基，获得抗性棉花幼苗。(5)将抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，获得再生植株(数目为N)。(三)计算转化效率整个步骤二约3个月时间，将步骤2的(5)得到的再生植株(数目为N)进行PCR验证，获得转基因植株(数目为n)。转化效率=n/NX100%。PCR验证所用的引物如下5'-CTCGCTCGTGTCAATGCT-3‘；5'-CTCTGGGTTTGCTGTGGG-3‘。转化效率达到6.2%。实施例2、应用本发明的方法获得转基因棉花一、重组农杆菌的获得1、合成序列表的序列2所示的种子特异表达启动子AGP。2、重组质粒(pBIa⑶S)的获得①用限制性内切酶Hindlll和XbaI双酶切pBI121(北京拜尔迪生物技术有限公司，产品货号MP-091)，回收大片段；②用限制性内切酶Hindlll和XbaI双酶切步骤1的种子特异表达启动子AGP，回收酶切产物；③将步骤①回收的大片段和步骤②回收的酶切产物连接，得到重组质粒pBIa⑶S(用序列2所示的种子特异表达启动子AGP取代了pBI121中的组成型表达启动子CaMV35S)。重组质粒pBIa⑶S中，⑶S基因为种子特异表达。3、重组农杆菌的获得用重组质粒pBIa⑶S转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。二、转基因棉花的获得冀丰197购自河北冀丰种业有限公司，为河北省农作物品种审定委员会审定品种，品种审定编号为冀审棉2004007号。(一)子叶苗的获得1、棉花种子脱绒50g棉花(冀丰197)种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水中和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。2、将脱绒种子经20%(体积百分含量)双氧水溶液消毒并在摇床上以130转/分摇动5小时，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，放在28°C环境下培养24小时，获得萌发种子。3、将萌发种子在无菌环境下将种壳剥下，将去种壳的棉花种胚种植在发芽培养基上，黑暗培养，温度28°C；获得子叶半展开、下胚轴伸长至5cm的子叶苗。(二)转基因棉花的获得1、相关溶液和培养基的配方溶液A由溶质和水组成，PH5.6；溶质及其浓度如下乙酰丁香酮80iUI71、2-N-吗啉乙烷磺酸75mM、葡萄糖2.5%(w/w，质量百分含量)、激动素0.lmg化―1、步骤一的重组农杆菌0D6(1(1=0.6-0.8。共培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5gL—1，甘氨酸的终浓度为2mgL—1，激动素的终浓度为0.lmgL—1。筛选培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素、卡那霉素和头孢霉素组成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；筛选培养基中，琼脂的终浓度为7.5gL—1，甘氨酸的终浓度为2mgL—1，激动素的终浓度为0.lmgL—1，卡那霉素的终浓度为75mg头孢霉素的终浓度为375mgL—1。2、转基因棉花的获得(1)培养子叶苗，去除子叶、叶柄和部分下胚轴，保留下胚轴1.5cm左右；28°C、相对湿度50%、暗培养2.5天(茎尖伸长变直)。(2)用尖锐带1mm弯钩的解剖针将茎尖双面划伤，划伤范围从茎尖的顶部到下胚轴基部，划出深1mm左右的伤口，获得划伤茎尖。(3)将划伤的茎尖在溶液A中浸染30分钟；用灭菌滤纸吸干茎尖表面菌液，再将茎尖放置在共培养基上培养3天，获得共培养的侵染茎尖。(4)将侵染茎尖转移到筛选培养基上，筛选3次，每约四周更换一次新鲜的筛选培养基，获得抗性棉花幼苗。(5)将抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，获得再生植株(数目为N)。(三)计算转化效率整个步骤二约3个月时间，将步骤2的(5)得到的再生植株进行PCR验证，获得转基因植株(数目为n)。转化效率=n/NX100%。PCR验证所用的引物如下5'-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3‘；5'-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3‘。9将转基因植株进行⑶S染色，均显示阳性。转化效率达到5.9%。实施例3、应用本发明的方法获得转基因棉花一、重组农杆菌的获得1、合成序列3所示的GFP基因。2、重组质粒(pBIaGFP)的获得①用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切实施例2的步骤二的2得到的ρΒΙα⑶S，回收大片段；②用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切步骤1的GFP基因，回收酶切产物；③将步骤①回收的大片段和步骤②回收的酶切产物连接，得到重组质粒pBIaGFP(用序列3所示的GFP基因取代了ρΒΙα⑶S中的⑶S基因)。3、重组农杆菌的获得农杆菌LBA4404中国农业大学保证向公众提供；参考文献TorregrosaL.，et.al.InfluenceofAgrobacteriumStrain,CultureMedium,andCultivarontheTransformationEfTiciencyofVitisviniferaL.Am.J.Enol.Vitic,53,3:183-190。用重组质粒pBIαGFP转化农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。二、转基因棉花的获得冀丰197购自河北冀丰种业有限公司，为河北省农作物品种审定委员会审定品种，品种审定编号为冀审棉2004007号。(一)子叶苗的获得1、棉花种子脱绒50g棉花(冀丰197)种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水中和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。2、将脱绒种子经20%(体积百分含量)双氧水溶液消毒并在摇床上以130转/分摇动5小时，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，放在28°C环境下培养24小时，获得萌发种子。3、将萌发种子在无菌环境下将种壳剥下，将去种壳的棉花种胚种植在发芽培养基上，黑暗培养，温度28°C；获得子叶半展开、下胚轴伸长至6cm的子叶苗。(二)转基因棉花的获得溶液A由溶质和水组成，pH5.8；溶质及其浓度如下乙酰丁香酮120μ1/L、2-Ν-吗啉乙烷磺酸85mM、葡萄糖3%(w/w，质量百分含量)、激动素0.12mg·L—1、步骤一的重组农杆菌OD6tltl=0.6-0.8。共培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L—1，甘氨酸的终浓度为2mg·L—1，激动素的终浓度为0.Img·L—1。筛选培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素、卡那霉素和头孢霉素组成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；筛选培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L—1，甘氨酸的终浓度为2mg·L—1，激动素的终浓度为0.Img·L—1，卡那霉素的终浓度为IOOmg·L—1，头孢霉素的终浓度为500mg·IA(1)培养子叶苗，去除子叶、叶柄和部分下胚轴，保留下胚轴2cm左右；30°C、相对湿度60%、暗培养3天(茎尖伸长变直)。(2)用尖锐带Imm弯钩的解剖针将茎尖双面划伤，划伤范围从茎尖的顶部到下胚轴基部，划出深1.2mm左右的伤口，获得划伤茎尖。(3)将划伤的茎尖在溶液A中浸染45分钟；用灭菌滤纸吸干茎尖表面菌液，再将茎尖放置在共培养基上培养4天，获得共培养的侵染茎尖。(4)将侵染茎尖转移到筛选培养基上，筛选3次，每约四周更换一次新鲜的筛选培养基，获得抗性棉花幼苗。(5)将抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，获得再生植株(数目为N)。(三)计算转化效率整个步骤二约3个月时间，将步骤2的(5)得到的再生植株进行PCR验证，获得转基因植株(数目为η)。转化效率=n/NX100%。PCR验证所用的引物如下5'-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3‘；5'-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3‘。将转基因植株进行GFP荧光检测，均显示阳性。转化效率达到5.3%。权利要求一种获得转基因棉花的方法，包括如下步骤(1)切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留0.8-3cm的长度，得到待侵染组织；然后25-30℃、相对湿度40％-60％、暗培养2-3天；所述子叶苗为子叶半展开、下胚轴伸长至4-6cm的无菌苗；(2)将暗培养后的待侵染组织双面划伤，划伤范围为从茎尖顶部至下胚轴基部，伤口深0.8-1.2mm；(3)将划伤的待侵染组织在溶液A中浸染15-45分钟；所述溶液A中含有携带外源基因的重组农杆菌；(4)侵染完成后共培养2-4天，然后进行抗性筛选，得到抗性棉花苗；(5)将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述溶液A的pH为5.3-5.8，由溶质和水组成；所述溶液A的溶质及其浓度如下乙酰丁香酮40-120u1厂1，2-N-吗啉乙烷磺酸65-85mM、葡萄糖2_3%(质量百分含量)、激动素0.08-0.12mgL_\含有外源基因的重组农杆菌0D6(1c1=0.6-0.8。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(4)中，所述抗性筛选在筛选培养基上进行；所述筛选培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素、卡那霉素和头孢霉素组成；筛选培养基中，琼脂的终浓度为7.5g化―1，甘氨酸的终浓度为2mg化―1，激动素的终浓度为0.lmg.L—1，卡那霉素的终浓度为50-100mg.L—1，头孢霉素的终浓度为250_500mg.L—1。4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于步骤(4)中，所述共培养在共培养基上进行；所述共培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5gL—1，甘氨酸的终浓度为2mgL—1，激动素的终浓度为0.lmgL—1。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述外源基因为抗虫基因Cry2A*、AGP启动子或GFP基因；所述抗虫基因Cry2A*的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述AGP启动子的核苷酸序列如序列表的序列2所示；所述GFP基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组农杆菌为用携带所述外源基因的重组质粒转化农杆菌得到的重组农杆菌。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述重组农杆菌为如下(a)或(b)或(c)(a)用重组质粒pTiB0542转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；(b)用重组质粒pBIa⑶S转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；所述重组质粒pBIaGUS是将pBI121的HindHI和XbaI酶切识别位点之间的小片段取代为序列2所示的DNA得到的重组质粒；(c)用重组质粒pBIaGFP转化农杆菌LBA4404得到重组农杆菌；所述重组质粒pBIaGFP是将pBIa⑶S的XbaI和SacI酶切识别位点之间的小片段取代为序列3所示的DNA得到的重组质粒。9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述棉花为棉花品种冀丰197或棉花品种鄂抗棉12。10.权利要求1至9中任一所述方法在棉花育种中的应用。全文摘要本发明公开了一种获得转基因棉花的方法。本发明的方法包括如下步骤(1)切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留1-3cm，得到待侵染组织；25-30℃、相对湿度40％-60％、暗培养2-3天；(2)从茎尖顶部至下胚轴基部双面划伤，伤口深0.8-1.2mm；(3)在溶液A中浸染15-45分钟；溶液A中含携带外源基因的重组农杆菌；(4)共培养2-4天，然后进行抗性筛选，得到抗性棉花苗；(5)将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。本发明通过调整茎尖生长状态、确定农杆菌转化的茎尖侵染合适深度、加入乙酰丁香酮并调整适宜的pH值，提高转化效率。利用本发明的方法可以快速获得转基因植株且具有较高的转基因效率。文档编号A01H5/00GK101831459SQ20101016855公开日2010年9月15日申请日期2010年5月4日优先权日2010年5月4日发明者刘正杰,华金平,熊敏,王彦霞,王玉美申请人:中国农业大学