专利名称：用稀有鮈鲫基因表达评价PBDEs类雌激素效应的方法
技术领域：
本发明涉及水体环境的评价，尤其涉及水体环境污染对水生生物影响的评价。
背景技术：
多溴联苯醚(polybrominateddiphenyl ethers, PBDEs)属于溴系阻燃剂 (brominated flame retardants, BFRs)的一种，由于其阻燃效率高，热稳定性好，添加量 少，对材料性能影响小，价格便宜，因而作为一种添加型阻燃剂被广泛地应用在电子、电器、 化工交通、建材、纺织、石油、采矿等领域中(Alaee M et al.，2003)。PBDEs亲脂性强，化学 性质稳定，可以随着食物链生物富集和放大。PBDEs在使用和报废过程中通过蒸发和渗漏而 进入环境。另外，焚化含有PBDEs的废弃物也是PBDEs进入环境的主要途径。进入大气中 的PBDEs会通过大气干湿沉降作用向水体和土壤中转移。除此之外，阻燃剂生产厂也直接 排放一些PBDEs。已在空气、水、土壤、灰尘和沉积物的多种环境介质、以及水生动物和海鸟 体内检测出PBDEs。自PBDEs使用以来，环境中PBDEs的水平在不断升高，已有的实验研究 发现PBDEs可能具有肝脏毒性、内分泌干扰作用、神经发育毒性及生殖毒性，其对人类健康 造成潜在威胁将越来越大。最近的研究证实，这类溴化物会干扰甲状腺激素，妨碍人类和动 物脑部与中枢神经系统的正常发育。鉴于PBDEs对生物可能产生的负面效应，有关PBDEs的 污染监控及其生态环境安全评价及生物学效应已成为当今科学研究的前沿和热点(Zhouet al. ,2002 ；Ueno et al.，2004)。类雌激素效应是指一些与雌激素作用类似，作用于靶器官 而产生的生理改变或结构变化，特别是发生一些雌性化现象，例如精细胞变少，精卵成熟所 需时间变长等等，目前研究一般通过卵黄蛋白原来评价生物受环境毒物类雌激素效应的程 度(Li et al.，2005)，还未见用鱼类评估PBDEs类雌激素效应的报道。芳香化酶是细胞色素P450家族中重要的一员，在激素代谢过程中起着重要的作 用，是生物体体内进行雄激素转化为雌性激素的重要催化酶，对于动物性腺发育和性别分 化有着决定性的作用。研究表明，在大多数哺乳动物中发现的芳香化酶基因都是由CYP19 基因编码的。研究还发现斑马鱼(Danio rerio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等均具有 2种以上的芳香化酶，分别为性腺型P450aromA和脑型P450aromB，经试验证实这2种分子 的存在形式和活性都存在着明显的差异(Kishida et al.，2001 ；Dalla et al.，2002)。半 定量反转录-聚合酶链反应是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA 反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对 数量。稀有鉤鲫(Gobiocyprisrarus Ye et Fu)属鲤科(Cyprinidae)丹亚科 (Danioninae)鲫属(Gobiocypris)，分布于四川省汉源县、彭州市等地，是我国特有的一种 小型鱼类，已经在一些生物学研究和环境生物学研究中得到广泛应用。稀有鉤鲫与国际实 验动物委员会推荐的国外常用的斑马鱼、青鏘、黑头软口鲦等实验鱼类有许多相似之处，因 此，它可能成为我国的一种实验鱼类。稀有鉤鲫作为一种新的实验动物具有以下优点(1) 成体全长38-85mm，饲养方便；(2)在饲养条件下，孵出后3个月部分个体性腺成熟，4个月
4左右即可产卵繁殖；(3)稀有鉤鲫在14°C -30°C间可自然产卵，在实验室的控温条件下，一 年四季均可繁殖，卵、苗的获取不受季节限制；(4))稀有鉤鲫属连续产卵类型的鱼类，同一 尾鱼相隔4天左右就能产卵一次，每次产卵数百粒，短期内可获得同一亲本的大量后代； (5)卵粘性，卵膜径1. 25-1. 70mm，较斑马鱼、青鏘卵大，卵膜透明，可清楚地观察胚胎发育， 也便于核移植等实验操作；(6)胚胎发育温度适应范围广，在13°C -30°C胚胎发育正常，可 通过控制温度来控制发育速度；(7)对温度、二氧化碳、溶氧的耐受能力强。有文献比较研 究了环境雌激素EE2对斑马鱼和稀有鉤鲫的影响，指出稀有鉤鲫可能比斑马鱼更敏感，同 时指出稀有鉤鲫在评价雌激素污染时可作为一种理想的实验模型(钟雪萍等2005 ；廖涛等 2005)。作为推荐的受试生物，稀有鉤鲫已被列入行业标准《国家环境保护局合格实验室准 则(1996)》、《水和废水监测分析方法》(第四版)，最近，中国环境科学出版社出版的《化学 品测试方法》也将稀有鉤鲫列为推荐的供试生物。到目前还未发现利用稀有鉤鲫以及CYP19 基因作为评价溴系阻燃剂(PBDEs)类雌激素效应的方法的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用稀有鉤鲫基因表达评价PBDEs类雌激素效应的方 法。该方法通过检测养殖在不同剂量PBDEs水体中稀有鉤鲫脑组织和性腺组织CYP19b基 因的表达量，说明水体中PBDEs的含量越高，雌激素效应也越明显，从而得到PBDEs类雌激 素效应的评价方法。为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案用稀有鉤鲫基因表达评价PBDEs类雌激素效应的方法，该方法包含如下步骤a、设立清水养鱼池，以及多个PBDEs浓度不同的养鱼池；b、将孵化2-3天的稀有鉤鲫鱼苗分别放入各个养鱼池中饲养3-5个月；c、从稀有鉤鲫样本中提取脑组织总RNA ；
d、将脑组织总RNA反转录为脑组织cDNA ；e、加入脑组织cDNA 3-5倍体积的水作为反应模板，进行RT-PCR扩增；RT-PCR 扩增引物采用 F GCCATCCTGGTGACCCTGTT, R GGGCTGCCATAGACTCCCAT,得到 的产物为脑组织CYP19b基因的RT-PCR扩增产物。f、在步骤 e 中 RT-PCR 扩增弓丨物采用 F TATCCTATTGAGCACGGTATTG, R CCTGTTGGCTTTGGGATTC，得到的产物为脑组织3 -actin基因的RT-PCR扩增产物。g、将脑组织CYP19b基因的RT-PCR扩增产物电泳、染色，在紫外灯下拍摄电泳图， 用图像处理软件得到电泳图条带的灰度值；脑组织CYP19b基因RT-PCR扩增产物电泳图的 灰度值表示CYP19b基因在稀有鉤鲫脑组织中的表达量。h、在步骤g中脑组织CYP19b基因采用脑组织0-actin基因，得到0-actin基因 在稀有鉤鲫脑组织中的表达量。i、从稀有鉤鲫样本中提取性腺组织总RNA，按照步骤d、e和步骤g的方法，其中的 脑组织采用性腺组织，即可得到CYP19b基因在稀有鉤鲫性腺组织中的表达量。j、步骤i中的CYP19b基因采用0-actin基因，得到0-actin基因在稀有鉤鲫性 腺组织中的表达量。k、在各个PBDEs浓度不同的养鱼池中分别选取数量相同的稀有鉤鲫样本，按照步
5骤c、d、f、h和步骤j的方法，对每一条稀有鉤鲫调节步骤e中加入脑组织cDNA的水量，使 得所有稀有鉤鲫的日-actin基因在脑组织中扩增的电泳条带灰度值相同，即所有稀有鉤 鲫样本脑组织cDNA浓度一致，以此为依据确定每条稀有鉤鲫在步骤e中加入其脑组织cDNA 的水量。1、加入每一条稀有鉤鲫脑组织cDNA的水量以步骤k为准，再按照步骤c、d、e和步 骤g的方法，得到每条稀有鉤鲫CYP19b基因在脑组织中的表达量。m、对步骤k中的稀有鉤鲫样本，按照步骤j的方法，对每一条稀有鉤鲫调节步骤e 中加入性腺组织cDNA的水量，使得所有稀有鉤鲫的0 -actin基因在性腺组织中扩增的电 泳条带灰度值相同，即所有稀有鉤鲫样本性腺组织cDNA浓度一致，以此为依据确定每条稀 有鉤鲫在步骤e中加入其性腺组织cDNA的水量。n、加入每一条稀有鉤鲫性腺组织cDNA的水量以步骤m为准，再按照步骤i的方 法，得到每条稀有鉤鲫CYP19b基因在性腺组织中的表达量。0、水体中PBDEs含量越高，用其养殖的稀有鉤鲫在脑组织和性腺组织中的CYP19b 基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带灰度值越高，表明类雌激素效应也越明显；稀有鉤鲫在 脑组织和性腺组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带灰度值越高，表明用其 养殖的水体中PBDEs的含量越高。本发明的优点是该方法通过检测养殖在不同剂量PBDEs水体中稀有鉤鲫脑组织 和性腺组织CYP19b基因的表达量，说明水体中PBDEs的含量越高，类雌激素效应也越明显， 给出了 PBDEs类雌激素效应的评价方法。
图la为各类稀有鉤鲫在脑组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带， 从左到右分别为对照、第一、第二、第三样本类在脑组织中的CYP19b基因扩增产物的电泳 图条带。图lb为各类稀有鉤鲫在性腺组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条 带。从左到右分别为对照、第一样、第二、第三样本类在性腺组织中的CYP19b基因扩增产物 的电泳图条带。图2为各类稀有鉤鲫CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带用ImageJ 1. 42 图像处理软件分析得到的条带灰度值。
具体实施例方式1、设立四个相同环境的养鱼池，在第一养鱼池中放入多溴联苯醚 (polybrominated diphenyl ethers，简称PBDEs)浓度为lppb的水，称为第一样品池，在第 二养鱼池中放入PBDEs浓度为lOppb的水，称为第二样品池，在第三养鱼池中放入PBDEs浓 度为lOOppb的水，称为第三样品池，在第四养鱼池中放入不添加任何药物的清水，称为对 照组样品池；2、将孵化2-3天的稀有鉤鲫鱼苗分别放入四个养鱼池中，在相同的养殖条件下饲 养；3、饲养3-5个月，从四个养鱼池中分别捞出数量相同的稀有鉤鲫，一般为30-200条；4、所有在第一样品池捞出的稀有鉤鲫称为第一样本类，所有在第二样品池捞出的 稀有鉤鲫称为第二样本类，所有在第三样品池捞出的稀有鉤鲫称为第三样本类，所有在第 四样品池捞出的稀有鉤鲫称为对照样本类；5、每个样本类设置4个该样本类的RT-PCR扩增产物放置管；稀有鉤鲫CYP19b基因的表达包含下列步骤1、从稀有鉤鲫样本中提取脑组织总RNA ；2、将脑组织总RNA，用Invitrogen公司的产品lx反应缓冲液4微升，DTT 2微升， dNTP 1微升，200U RevertidTM H-MMLV逆转录酶1微升，以及脑组织总RNA 3微升，2iimol/ L随机引物NNNNNC，N = A/T/G/C 1微升，水8微升；25°C保温10分钟，42°C反应1小时，将 总RNA反转录为脑组织cDNA ；3、加入脑组织cDNA 3-5倍体积的水作为反应模板，用Invitrogen公司的产品lx PCR 缓冲液 1. 5 微升，0. 2iimol/L RT-PCR 扩增引物 0. 6 微升，200 ii mol/L dNTPs 1 微升， 0. 5U Taq DNA聚合酶0. 2微升，以及cDNA反应模板2微升，水14. 7微升进行RT-PCR扩增， 扩增程序预变性94°C 3分钟；重复扩增30个循环，每个循环包括94°C变性30秒，55°C退 火30秒，72°C延伸40秒；72 °C终延伸5分钟；RT-PCR 扩增引物采用 F GCCATCCTGGTGACCCTGTT, R GGGCTGCCATAGACTCCCAT,得到 的产物为脑组织CYP19b基因的RT-PCR扩增产物。4、在步骤 3 中 RT-PCR 扩增弓丨物采用 F TATCCTATTGAGCACGGTATTG, R CCTGTTGGCTTTGGGATTC，得到的产物为脑组织3 -actin基因的RT-PCR扩增产物。5、将脑组织CYP19b基因的RT-PCR扩增产物用1 %琼脂糖电泳，再用溴化乙锭染 色，在紫外灯下拍摄两个RT-PCR扩增产物的电泳图，用ImageJ 1.42图像处理软件得到电 泳图条带的灰度值；脑组织CYP19b基因RT-PCR扩增产物电泳图的灰度值表示CYP19b基因 在稀有鉤鲫脑组织中的表达量。6、在步骤5中脑组织CYP19b基因采用脑组织0-actin基因，得到0-actin基因 在稀有鉤鲫脑组织中的表达量。7、从稀有鉤鲫样本中提取性腺组织总RNA，按照步骤2、3和步骤5的方法，其中的 脑组织采用性腺组织，即可得到CYP19b基因在稀有鉤鲫性腺组织中的表达量。8、步骤7中的CYP19b基因采用0_actin基因，得到0-actin基因在稀有鉤鲫性 腺组织中的表达量。由步骤1到步骤8可得到一条稀有鉤鲫CYP19b基因和0 -actin基因在脑组织及 在性腺组织中的表达量。9、在第一、第二、第三、第四4个样本类中分别选取数量相同的稀有鉤鲫样本，数 量为30-200条，按照步骤1、2、4、6和步骤8的方法，对每一条稀有鉤鲫调节步骤3中加入 脑组织cDNA的水量，使得所有稀有鉤鲫的0 -actin基因在脑组织中扩增的电泳条带灰度 值相同，即所有稀有鉤鲫样本脑组织cDNA浓度一致，以此为依据确定每条稀有鉤鲫在步骤 3中加入其脑组织cDNA的水量。10、加入每一条稀有鉤鲫脑组织cDNA的水量以步骤9为准，再按照步骤1、2、3和 步骤5的方法，得到每条稀有鉤鲫CYP19b基因在脑组织中的表达量。
11、对步骤9中的稀有鉤鲫样本，按照步骤8的方法，对每一条稀有鉤鲫调节步骤3 中加入性腺组织cDNA的水量，使得所有稀有鉤鲫的0 -actin基因在性腺组织中扩增的电 泳条带灰度值相同，即所有稀有鉤鲫样本性腺组织cDNA浓度一致，以此为依据确定每条稀 有鉤鲫在步骤3中加入其性腺组织cDNA的水量。12、加入每一条稀有鉤鲫性腺组织cDNA的水量以步骤11为准，再按照步骤7的方 法，得到每条稀有鉤鲫CYP19b基因在性腺组织中的表达量。13、水体中PBDEs含量越高，用其养殖的稀有鉤鲫在脑组织和性腺组织中的 CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带灰度值越高，表明类雌激素效应也越明显；稀有 鉤鲫在脑组织和性腺组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带灰度值越高，表 明用其养殖的水体中PBDEs的含量越高。CYP19b基因在脑组织或性腺组织的表达产物是芳香化酶，芳香化酶是细胞色素 P450家族中重要的一员，在激素代谢过程中起着重要的作用，是生物体体内进行雄激素转 化为雌性激素的重要催化酶，对于动物性腺发育和性别分化有着决定性的作用。CYP19b基 因在脑组织或性腺组织的表达量越大，说明稀有鉤鲫脑组织或性腺组织中芳香化酶的含量 越多，造成雌激素的量越大，PBDEs类雌激素效应也越明显。图la为对照样本类、第一样本类、第二样本类、第三样本类稀有鉤鲫在脑组织中 的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带。由图la可知，第一样本类、第二样本类、 第三样本类稀有鉤鲫在脑组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带均比对照 样本类在脑组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带的亮度要高，且第三样本 类比第二样本类、第二样本类比第一样本类在脑组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的 电泳图条带的亮度要高，而对照样本类的样品是取自用清水养殖的对照组样品池中的稀有 鉤鲫，第一样本类的样品是取自用PBDEs浓度为lppb的养鱼池中的稀有鉤鲫，第二样本类 的样品是取自用PBDEs浓度为lOppb的养鱼池中的稀有鉤鲫，第三样本类的样品是取自用 PBDEs浓度为lOOppb的养鱼池中的稀有鉤鲫；由此可知，水体中含有PBDEs对鱼类的类雌 激素效应是明显的，且PBDEs含量越高类雌激素效应越明显。图lb为对照样本类、第一样本类、第二样本类、第三样本类稀有鉤鲫在性腺组织 中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带。与图la类似，由图lb可以进一步说明 水体中含有PBDEs对鱼类的类雌激素效应是明显的，且PBDEs含量越高类雌激素效应越明显。图2为对照样本类、第一样本类、第二样本类、第三样本类稀有鉤鲫CYP19b基因 RT-PCR扩增产物的电泳图条带用ImageJ 1. 42图像处理软件分析得到的条带灰度值。由图 2可知，对照样本类、第一样本类、第二样本类、第三样本类稀有鉤鲫在脑组织中的CYP19b 基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带平均灰度值分别为110. 90、156. 63、198. 33,214. 27 ； 对照样本类、第一样本类、第二样本类、第三样本类稀有鉤鲫在性腺组织中的CYP19b基因 RT-PCR扩增产物的电泳图条带平均灰度值分别为94. 34、133. 18、165. 73、170. 58 ；这些灰 度值将CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带数值化，量化地说明了水体中PBDEs含 量增高与稀有鉤鲫CYP19b基因在脑组织和性腺组织中的表达量之间的关系，水体中PBDEs 的含量越高，类雌激素效应也越明显。
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权利要求
用稀有鮈鲫基因表达评价PBDEs类雌激素效应的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤a、设立4个相同环境的养鱼池，在第一养鱼池中放入PBDEs浓度为1ppb的水，在第二养鱼池中放入PBDEs浓度为10ppb的水，在第三养鱼池中放入PBDEs浓度为100ppb的水，在第四养鱼池中放入清水；b、将稀有鮈鲫鱼苗分别放入4个养鱼池中，在相同条件下饲养3-5个月；c、从稀有鮈鲫样本中提取脑组织总RNA；d、将脑组织总RNA，用Invitrogen公司的产品1x反应缓冲液4微升，DTT 2微升，dNTP 1微升，200U RevertidTM H-MMLV逆转录酶1微升，以及脑组织总RNA 3微升，2μmol/L随机引物NNNNNC，N＝A/T/G/C 1微升，水8微升；25℃保温10分钟，42℃反应1小时，将总RNA反转录为脑组织cDNA；e、加入脑组织cDNA 3-5倍体积的水作为反应模板，用Invitrogen公司的产品1x PCR缓冲液1.5微升，0.2μmol/L RT-PCR扩增引物0.6微升，200μmol/L dNTPs 1微升，0.5U Taq DNA聚合酶0.2微升，以及cDNA反应模板2微升，水14.7微升进行RT-PCR扩增，扩增程序预变性94℃3分钟；重复扩增30个循环，每个循环包括94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒；72℃终延伸5分钟；RT-PCR扩增引物采用FGCCATCCTGGTGACCCTGTT，RGGGCTGCCATAGACTCCCAT，得到的产物为脑组织CYP19b基因的RT-PCR扩增产物；f、在步骤e中RT-PCR扩增引物采用FTATCCTATTGAGCACGGTATTG，RCCTGTTGGCTTTGGGATTC，得到的产物为脑组织β-actin基因的RT-PCR扩增产物；g、将脑组织CYP19b基因的RT-PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳，再用溴化乙锭染色，在紫外灯下拍摄两个RT-PCR扩增产物的电泳图，用ImageJ 1.42图像处理软件得到电泳图条带的灰度值；h、在步骤g中脑组织CYP19b基因采用脑组织β-actin基因，得到β-actin基因在稀有鮈鲫脑组织中的表达量；i、从稀有鮈鲫样本中提取性腺组织总RNA，按照步骤d、e和步骤g的方法，其中的脑组织采用性腺组织，得到CYP19b基因在稀有鮈鲫性腺组织中的表达量；j、步骤i中的CYP19b基因采用β-actin基因，得到β-actin基因在稀有鮈鲫性腺组织中的表达量；k、在第一、第二、第三、第四4个养鱼池中分别选取数量相同的稀有鮈鲫样本，按照步骤c、d、f、h和步骤j的方法，对每一条稀有鮈鲫调节步骤e中加入脑组织cDNA的水量，使得所有稀有鮈鲫的β-actin基因在脑组织中扩增的电泳条带灰度值相同，以此确定每条稀有鮈鲫在步骤e中加入其脑组织cDNA的水量；1、加入每一条稀有鮈鲫脑组织cDNA的水量以步骤k为准，再按照步骤c、d、e和步骤g的方法，得到每条稀有鮈鲫CYP19b基因在脑组织中的表达量；m、对步骤k中的稀有鮈鲫样本，按照步骤j的方法，对每一条稀有鮈鲫调节步骤e中加入性腺组织cDNA的水量，使得所有稀有鮈鲫的β-actin基因在性腺组织中扩增的电泳条带灰度值相同，以此确定每条稀有鮈鲫在步骤e中加入其性腺组织cDNA的水量；n、加入每一条稀有鮈鲫性腺组织cDNA的水量以步骤m为准，再按照步骤i的方法，得到每条稀有鮈鲫CYP19b基因在性腺组织中的表达量；o、水体中PBDEs含量越高，用其养殖的稀有鮈鲫在脑组织和性腺组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带灰度值越高，表明类雌激素效应也越明显；稀有鮈鲫在脑组织和性腺组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带灰度值越高，表明用其养殖的水体中PBDEs的含量越高。
全文摘要
本发明公开了一种用稀有鮈鲫基因表达评价PBDEs类雌激素效应的方法，涉及水体环境污染对水生生物影响的评价。该方法通过检测养殖在不同剂量PBDEs水体中稀有鮈鲫脑组织和性腺组织CYP19b基因的表达量，说明水体中PBDEs的含量越高，类雌激素效应也越明显，从而得到PBDEs类雌激素效应的评价方法。
文档编号C12Q1/68GK101875969SQ20091027334
公开日2010年11月3日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者俞小牧, 程磊, 童金苟, 谭新 申请人:中国科学院水生生物研究所