专利名称：：一种籼稻组织培养基及农杆菌介导的转基因方法
技术领域：
：本发明涉及植物组织培养及转基因
技术领域：
，具体涉及籼稻组织培养基，同时还涉及一种培养基的农杆菌介导的转基因方法，本发明适用于水稻花药愈伤组织诱导和继代，未成熟胚愈伤组织诱导和继代，成熟胚愈伤组织诱导和继代。以及农杆菌介导的愈伤组织遗传转化操作。
背景技术：
：水稻是全球的主要粮食作物，分为粳稻和籼稻两个亚种，两个亚种的各自代表品种都已经进行了全基因组测序(粳稻日本晴，籼稻9311)。所以对其进行基因工程的操作是当前研究的热点。遗传转化方法常用的有农杆菌侵染法和基因枪法。各种转化方法都依赖于优良的受体材料——愈伤组织，尤其农杆菌介导的遗传转化。农杆菌介导的遗传转化基于自然界本来存在的生物过程，转化一般为单拷贝插入，所得到的转基因苗变异较少优于基因枪转化方法。但是，农杆菌介导的遗传转化方法对转化受体材料_愈伤组织质量的要求比基因枪遗传转化方法高的多。从上世纪九十年代，第一个农杆菌侵染法水稻(粳稻)转基因成功以来，粳稻转基因技术已经相当的成熟和稳定。但是，籼稻农杆菌介导的转基因一直很难成功，进展缓慢，只有极少数品种的籼稻能够进行转基因操作，并且成功率很低。漫长研究探索仍然没有找到理想的、能够广泛适用于籼稻愈伤组织的培养和遗传转化方法，不能从根本上解决籼稻遗传转化的难题依赖基因型和遗传转化频率低。在最新报导的文献中仏inYJ，ZhangQOptimizingthetissuecultureconditionsforhighefficiencytransformationofindicarice。PlantCellRep(2005)23:540-547;XiaojiaGeZhaohuiChuYongj皿LinShipingWang2006AtissueculturesystemfordifferentgermplasMSofindicaricePlantCellR印(2006)25:392-402;YukohHiei&ToshihikoKomari。Agrobacterium—mediatedtransformationofriceusingimmatureembryosorcalliinducedfrommatureseed。NatureProtocol,2008，3:824-834;AsukaNishimura，IkukoAichi&MakotoMasuoka。AprotocolforAgrobacterium—mediatedtransformationinrice。NatureProtocol，2006，1:2796-2802)，根据Ge，etal。(2007)提供的诱导培养基和方法能够有效地诱导9311产生愈伤组织，这些愈伤组织能够有效地进行分化。但是这些愈伤组织在其提供的继代培养基上生长状态差，很容易死亡，这种状态的愈伤组织不能够用来做农杆菌侵染转基因操作，本实验室进行多次重复实验都没有能够获得遗传转化成功的阳性愈伤组织。目前，籼稻转基因技术仍然存在瓶颈，只有部分籼稻基因型能够转化成功，而且转化效率不高；一些大面积推广应用的优良品种，包括超级杂交稻的亲本材料都存在遗传转化困难的问题，大大地限制了转基因技术在水稻品种改良的作用。针对水稻转基因的现状，我们系统地研究分析了培养基成分、温度、激素、植物凝胶的浓度、抗生素浓度，以及各种处理方法对愈伤组织诱导、继代和遗传转化的影响，最终设计出全新的培养基，命名为LY培养基。LY培养基是籼稻的通用培养基，在已经完成的35个籼稻基因型遗传转化试验中，所获得的愈伤组织质量好、生长快，适用于农杆菌介导的的遗传转化。所测试的35个籼稻基因型遗传转化都获得了成功，转化效率介于20_50%，获得了非常理想的结果，取得了籼稻遗传转化技术的重大突破。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种籼稻组织培养基(LY培养基)，该培养基可用于籼稻组织培养。LY培养基是籼稻的通用培养基，在已经完成的35个籼稻基因型遗传转化试验中，所获得的愈伤组织质量好、生长快，适用于农杆菌介导的的遗传转化。所测试的35个籼稻基因型遗传转化都获得了成功，转化效率介于20-50%，获得了非常理想的结果，取得了籼稻遗传转化技术的突破。本发明的另一个目的是在于提供了一种在水稻组织培养基上的农杆菌介导的转基因方法，基于LY培养基的农杆菌介导的先导遗传转化技术，对所述的35个籼稻品种进行测试，愈伤组织生长良好，遗传转化率高，实现了理想的转化率(20-50%)。A、一种适合于籼稻愈伤组织生长的培养基(命名LY培养基)物质硝酸根离子(N03—>)铵离子(NH4+)钾离子(K+)磷酸根离子(P043—)七水硫酸镁(MgS04*7H20)二水氯化f丐(CaCL2*2H20)硫酸锰(MnS04)硫酸锌(ZnS04)硼酸(HB03)碘化钾(KI)五水硫酸铜(CuS04*5H20)二水钼酸钠(Na2Mo04*2H20)六水氯化钴(CoCl2*6H20)甘氨酸维生素Bl维生素B6烟酸肌醇七水硫酸亚铁(FeS04*7H20)N。。EDTA浓度(基本成分大量元素)40-70mM10-30mM30-60mM2-5mM150-400mg/L150-400mg/L20-40mg/L2-10mg/L5_15mg/Ll_5mg/L0.01-0.lmg/L0.1-lmg/L0.01-0.lmg/L2-4mg/Ll_2mg/L0.5-lmg/L0.5-lmg/L0-100mg/L20-50mg/L30-70mg/L。B、一种在水稻组织培养基上的农杆菌介导的转基因方法，其步骤是1、愈伤组织诱导诱导培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4_d:0.5—1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6—ba等)浓度0.00-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将本步骤上述成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组配封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。①成熟胚诱导a)成熟水稻胚去颖壳之后，75%体积比酒精浸泡lmin。b)O.15%质量比的HgCl2浸泡10-15分钟。c)用灭菌水洗4遍，每次1分钟；再用灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次；将成熟种子胚接种到诱导培养基上，每瓶5-6颗，放置29-35摄氏度环境下暗培养25-35天，长出的愈伤组织接种到继代培养基上。②幼胚诱导a，幼胚去壳取出后，；b，0.15%质量比的HgC12浸泡15分钟；c，用灭菌水洗4遍，每次1分钟，再灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次；接种到诱导培养基上，每瓶5-6颗；放置29-35摄氏度环境暗培养25-35天长出的愈伤组织接种到继代培养基上；③花药诱导a，取水稻花药，先连同颖壳一起0.15%的HgC12浸泡15分钟；b，用灭菌水洗4遍，每次1分钟，再灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次；c，每50ml三角瓶接种80个花药，放置29-35摄氏度环境暗培养30-40天长出的愈伤组织接种到继代培养基上；:幼穗诱导待幼穗发育到2-3cm时取材，将无菌的幼穗剪2-3rnm的长度散于诱导培养基上，放置29-35摄氏度环境暗培养30-40天长出的愈伤组织接种到继代培养基上；2、继代继代培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶2.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.00-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将本步骤上述成分加入定溶到1000ml。pH5.4-5.830ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。继代操作挑取发生于盾片处的生长旺盛，质地坚硬，色泽黄亮的愈伤组织，每50ml瓶接种0.2克左右。每100ml三角瓶接种0.4g左右。颗粒大小直径3mm为宜。29-35度生长9-13天，可以增长7-15倍。3、预培养预培养培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶2.5-3.0g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.00-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将本步骤上述成分加入定容到1000ml。pH5.4_5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组配封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。预培养操作将生长良好的愈伤组织块接种于预培养培养基上，60-70块/9cm平皿，28-30度暗培养生长2-3天。籼稻愈伤组织与预培养特征在于l，预培养培养基的激素浓度2，4-d:0.5-1.5mg/L细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.05-0.5mg/L。4、农杆菌准备将转化好的农杆菌菌液在相应抗性的平板上划线，稠密为宜，30度生长36-48小时。再进行一次划线，生长24-36小时后可以进行转基因操作。5、农杆菌悬浮培养农杆菌悬浮培养基在LY/2的基础上添加在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度:0.00-0.5mg/L;Ph5.4-5.830ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。悬浮侵染操作先将农杆菌悬浮培养基分装在50ml/(100ml三角瓶中)，115度灭菌15分钟，温度降到室温，后加入终浓度100um的乙酰丁香酮。将生长好的农杆菌平板上的农杆菌刮到农杆菌悬浮培养基里，30度震荡，0D值在0.5-1.5的范围内即可转基因侵染。将预培养的愈伤组织转移到悬浮的菌液中，室温浸泡20-30min。6、共培养共培养培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.00-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将本步骤上述成分加入定溶到1000ml。Ph5.4_5.830ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。共培养操作将侵染中在菌液中的愈伤组织沥干农杆菌菌液；再将愈伤放置在灭菌后风干的多层(8-10层)滤纸上，超净台晾干约1小时，尽量浸干农杆菌菌液，以免共培养的时候农杆菌生长过多，对愈伤组织损害过度。同时，将共培养培养基倒好，方法同预培养培养基，超净台吹干1-2小时。然后将滤纸上的愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，每皿70颗左右，19-22度暗培养2-3天。待培养基上略见菌斑为宜。7、第一次筛选第一次筛选培养基(以潮霉素作为真核抗性为例)筛选培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L;2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6_ba等)浓度0.00-0.5mg/L;在1000ml可灭菌的瓶子中将上述成分全部加入，定容到1000ml，115摄氏度灭菌15分钟。冷却到50摄氏度左右加入对应载体抗性标记的阳性克隆筛选剂一定浓度，600-800mg/L终浓度的头孢，倒平板30ml/9cm平叛。超净台晾干30-60min。筛选操作将共培养的愈伤组织用400-800mg/l浓度的灭菌水洗净表面的农杆菌，直至水清澈。是否洗净农杆菌是是决定以后筛选中是否长菌的关键。洗干净的愈伤组织均匀放置在灭菌滤纸上超净台放置30分钟。将滤纸上的愈伤组织均匀的放在筛选培养基上20-30颗/皿。28-32度暗培养20-25天。8、后筛选后筛选培养基(以潮霉素作为真核抗性为例)8筛选培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L;2，4-d:0.1-0.5mg/L，；细胞分裂素(kt或ba或6_ba等)浓度0.5-1.5mg/L在lOOOml可灭菌的瓶子中将上述成分全部加入，定容到lOOOml，115摄氏度灭菌15分钟。冷却到50摄氏度左右加入对应载体抗性标记的阳性克隆筛选剂一定浓度，倒平板30ml/9cm平叛。超净台晾干10-30min。筛选操作将第一次筛选的阳性愈伤组织(新长出的愈伤组织)颗粒，转移到后筛选培养基上15颗每平皿，28-32度培养7天。分化培养基在LY培养基中加入谷氨酰胺300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素kt:1.5—2.5mg/L;6_ba:1.5—2.5mg/L;NAA:0.1—0.5mg/L;IAA:0.1—0.5mg/L。植物凝胶2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0。将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶。将上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml，30ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中用组配封口膜封口后110摄氏度灭菌15分钟。冷凝后即可用。分化操作分化培养基配制好后每个100的三角瓶分装50ml，110度灭菌15分钟。将筛选长出的阳性愈伤组织颗粒放置与分化培养基上，每瓶放置2-3个阳性克隆。26-30度，光照分化10-14天长出绿叶后就可以进行生根。生根培养基在1/2LY培养基中300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:NAA:0-0.lmg/L或IAA:0-0.lmg/L。植物凝胶2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0，首先将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶。将上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml30ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中用组配封口膜封口后110摄氏度灭菌15分钟。冷凝后即可用。生根操作将每个克隆分化出的健壮苗每瓶放置2-3棵苗。27-30度光照培养，10_15天后可直接移栽。发明与现有技术相比具有以下优点和效果l，此培养基——改善了愈伤组织的质量。愈伤组织不再出现褐化，水化，白化，玻璃化等症状。培养出的各品种的愈伤组织坚硬，致密，色泽黄亮达到转基因的理想状态。如图，3。图2为9311的愈伤组织。2，使得转化率达到20-50%。见表一，如图二，a，b，c，d分别为9311，m63，94d_2，gd-ls的筛选结果。3，本发明解决了长期以来籼稻诱导困难，继代困难，转基因困难的难题。经过对籼稻9311，yta，ytb，明辉63，c815s，彦农6s，天源6s，pei64s，9802s，珍山97，IR64，明恢86，ipd，宝大粒等34个籼稻品种实验表明全部能有效的进行愈伤组织诱导，继代，转化。4，提高了愈伤组织生长的速度，縮短了转化周期诱导只需25天，在最新文献(XiaojiaGeetal2007，LinandZhang2005)愈伤组织增长6-7倍需要15-20天的时间，然而在本发明中所描述的方法中9-12天就愈伤组织就可以增长7-10倍。两次筛选只要30天。所以整个转基因过程从诱导开始3个月就可以完成。从转化开始一个半月就可以完成。图1:9311诱导结果，诱导结果良好，出愈率高，没有任何的褐化。图2:9311愈伤组织继代，愈伤组织状态优秀，黄色颗粒，没有任何的水化褐化。图3:9311愈伤组织，愈伤组织黄色，表面光滑，质地坚硬。图4:9311愈伤组织经过共培养和水洗后的愈伤组织，依然状态良好没有任何的发黑的现象，表明愈伤组织质量极好，可以经受逆境处理。图5:9311筛选结果。有较高的阳性率，转化率很高。图6:9311的另一个筛选实例。很多愈伤表面长出了新的愈伤组织，表明转化率较高。图7:9311愈伤组织的gus染色验证，右一为阴性对照，其他为检测样品，表明阳性率很好，随机抽取12个样有11个表现出明显的gus阳性。图8:9311愈伤组织的分化照片，显示了较高的分化率和分化质量。图9:9311生根，再生苗健壮。图10:转基因苗的per鉴定具体实施方式实施例1-种新的适合于籼稻愈伤组织生长的培养基(命名LY培养基，下同)物质浓度硝酸根离子(N03—>)铵离子(NH4+)钾离子(K+)磷酸根离子(P043—)七水硫酸镁(MgS04*7H20)二水氯化f丐(CaCL2*2H20)硫酸锰(MnS04)硫酸锌(ZnS04)硼酸(HB03)碘化钾(KI)五水硫酸铜(CuS04*5H20)二水钼酸钠(Na2Mo04*2H20)六水氯化钴(CoCl2*6H20)甘氨酸维生素Bl维生素B6(基本成分大量元素)40或45或51或56或62或66或70mM10mM或20mM或30mM30mM或40mM或50mM或60mM2mM或3mM或4mM或5mM150mg/L或250mg/L或400mg/l150mg/L或250mg/L或400mg/L20mg/L或30mg/L或40mg/L2mg/L或4mg/L或6mg/L或lOmg/L5mg/L或10mg/L或15mg/Llmg/L或3mg/L或5mg/L;0.0lmg/L或0.05mg/L或0.lmg/L0.lmg/L或0.5mg/L或lmg/L0.0lmg/L或0.5mg/L或0.lmg/L2mg/L或3mg/L或4mg/Llmg/L或2mg/L0.5mg/L或lmg/L烟酸0.5mg/L或lmg/L肌醇0mg/L或50mg/L或100mg/L七水硫酸亚铁(FeS04*7H20)20mg/L或35mg/L或50mg/LNa2EDTA30mg/L或45mg/L或70mg/L实施例2:用质粒pCAMBIA1301(购于澳大利亚CAMBIA公司)，农杆菌为EHA105菌株(本实验保存)，转化籼稻材料9311(本实验室保存)成熟胚诱导的愈伤组织。一种在水稻组织培养基上的农杆菌介导的转基因方法，其步骤是A、愈伤组织诱导诱导培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，—酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4_d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.0-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组配封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。成熟水稻胚去颖壳之后，75%酒精浸泡lmin。b)O.15%的HgCl2浸泡10-15分钟。c)用灭菌水洗4遍，每次1分钟；再用灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次；将成熟种子胚接种到诱导培养基上，每瓶5-6颗，放置29-35摄氏度环境下暗培养25-35天，长出的愈伤组织(如图1)接种到继代培养基上。B、继代继代培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶2.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.0-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。继代操作挑取发生于盾片处的生长旺盛，质地坚硬，色泽黄亮的愈伤组织，每50ml瓶接种0.2克左右。每100ml三角瓶接种0.4g左右。颗粒大小直径3mm为宜。29-35度生长9-13天，可以增长7-15倍，如图2，图3。C、预培养预培养培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶2.5-3.0g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6_ba等)浓度0.0-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将成分加入定溶到1000ml。Ph5.4_5.830ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组配封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。预培养操作将生长良好的愈伤组织块接种于预培养培养基上，60-70块/9cm平皿，28-30度暗培养生长2-3天。籼稻愈伤组织与预培养特征在于l，预培养培养基的激素浓度2，4-d:0.5-1.5mg/L细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.05-0.5mg/L。D、农杆菌准备将转化好的农杆菌菌液在相应抗性的平板上划线，稠密为宜，30度生长36-48小时。再进行一次划线，生长24-36小时后可以进行转基因操作。E、农杆菌悬浮培养农杆菌悬浮培养基在LY/2的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4_d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度:0.0-0.5mg/L;Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。悬浮侵染操作先将农杆菌悬浮培养基分装在50ml/(100ml三角瓶中)，115度灭菌15分钟，温度降到室温后加入终浓度100um的乙酰丁香酮。将生长好的农杆菌平板上的农杆菌刮到农杆菌悬浮培养基里，30度震荡，OD值在0.5-1.5的范围内即可转基因侵染。将预培养的愈伤组织转移到悬浮的菌液中，室温浸泡20-30min。F、共培养共培养培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6_ba等)浓度0.0-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将成分加入定溶到1000ml。Ph5.4_5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。共培养操作将侵染中在菌液中的愈伤组织沥干农杆菌菌液；再将愈伤放置在灭菌后风干的多层(8-10层)滤纸上，超净台晾干约1小时，尽量浸干农杆菌菌液，以免共培养的时候农杆菌生长过多，对愈伤组织损害过度。同时，将共培养培养基倒好，方法同预培养培养基，超净台吹干1-2小时。然后将滤纸上的愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，每皿70颗左右，19-22度暗培养2-3天。待培养基上略见菌斑为宜。G、第一次筛选第一次筛选培养基(以潮霉素筛选为例)筛选培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L;2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.0-0.5mg/L;在1000ml可灭菌的瓶子中将上述成分全部加入，定容到1000ml，115摄氏度灭菌15分钟。冷却到50摄氏度左右加入25-30mg/L终浓度的潮霉素，600-800mg/L终浓度的头孢，倒平板30ml/9cm平叛。超净台晾干30-60min.筛选操作将共培养的愈伤组织用400-800mg/l浓度的灭菌水洗净表面的农杆菌，直至水清澈。洗干净的愈伤组织均匀放置在灭菌滤纸上超净台放置30分钟，如图4。将滤纸上的愈伤组织均匀的放在筛选培养基上20-30颗/皿。28-32度暗培养20-25天，如图5.H、后筛选后筛选培养基(以潮霉素筛选为例)筛选培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L;2，4-d:0.1-0.5mg/L，；细胞分裂素(kt或ba或6_ba等)浓度0.5-1.5mg/L在1000ml可灭12菌的瓶子中将上述成分全部加入，定容到lOOOml，115摄氏度灭菌15分钟。冷却到50摄氏度左右加入30-40mg/L终浓度的潮霉素，倒平板30ml/9cm平叛。超净台晾干10_30min。筛选操作将第一次筛选的阳性愈伤组织(新长出的愈伤组织)颗粒，转移到后筛选培养基上15颗每平皿，28-32度培养7天。分化培养基在LY培养基中加入谷氨酰胺300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:kt:1.5-2.5mg/L;6_ba:1.5-2.5mg/L;NAA:0.1-0.5mg/L;IAA:0.1-0.5mg/L。植物凝胶2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶。将上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml，30ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中用组配封口膜封口后110摄氏度灭菌15分钟。冷凝后即可用。分化操作分化培养基配制好后每个100的三角瓶分装50ml，110度灭菌15分钟。将筛选长出的阳性愈伤组织颗粒放置与分化培养基上，每瓶放置2-3个阳性克隆。26-30度，光照分化10-14天长出绿叶后就可以进行生根，如图8。[OMO]生根培养基在1/2LY培养基中300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:NAA:0-0.lmg/L或IAA:0-0.lmg/L。植物凝胶2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0首先将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶。将上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml30ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中用组配封口膜封口后110摄氏度灭菌15分钟。冷凝后即可用生根操作将每个克隆分化出的健壮苗每瓶放置2-3棵苗。27-30度光照培养，10_15天后直接移栽，如图9。对转基因愈伤和植株的鉴定如图7:阳性愈伤的gUS染色检测。如图10:转基因苗的pcr鉴定。实施例3:用质粒pCAMBIA1301(购于澳大利亚pCAMBIA公司)，农杆菌为EHA105菌株(本实验保存)，转化籼稻材料9311，yta，明恢63，江-s，94d_2，ytb/9311，71994，5-34/浙733，y58s-l，IR40931,kaslath，IR64，DML105，FR13A，GodaHeenati，E32，天源96-2，显矮s，MC526,GD-1SD等20个品种的诱导，培养，农杆菌转化。A、愈伤组织诱导诱导培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.5-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组配封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。成熟水稻胚去颖壳之后，75%酒精浸泡lmin。b)0.15%的HgCl2浸泡10-15分钟。c)用灭菌水洗4遍，每次1分钟；再用灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次；将成熟种子胚接种到诱导培养基上，每瓶5-6颗，放置29-35摄氏度环境下暗培养25-35天，长出的愈伤组织接种到继代培养基上。B、继代继代培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶2.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。继代操作挑取发生于盾片处的生长旺盛，质地坚硬，色泽黄亮的愈伤组织，每50ml瓶接种0.2克左右。每100ml三角瓶接种0.4g左右。颗粒大小直径3mm为宜。29-35度生长9-13天，可以增长7-15倍。C、预培养预培养培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶2.5-3.Og/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组配封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。预培养操作将生长良好的愈伤组织块接种于预培养培养基上，60-70块/9cm平皿，28-30度暗培养生长2-3天。籼稻愈伤组织与预培养特征在于l，预培养培养基的激素浓度2，4-d:0.5-1.5mg/L细胞分裂素(kt或ba，6-ba等)浓度0.05-0.5mg/L。D、农杆菌准备将转化好的农杆菌菌液在相应抗性的平板上划线，稠密为宜，30度生长36-48小时。再进行一次划线，生长24-36小时后可以进行转基因操作。E、农杆菌悬浮培养农杆菌悬浮培养基在LY/2的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4_d:0.5-1.5mg/L;Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。悬浮侵染操作先将农杆菌悬浮培养基分装在50ml/(100ml三角瓶中)，115度灭菌15分钟，温度降到室温后加入终浓度100um的乙酰丁香酮。将生长好的农杆菌平板上的农杆菌刮到农杆菌悬浮培养基里，30度震荡，OD值在0.5-1.5的范围内即可转基因侵染。将预培养的愈伤组织转移到悬浮的菌液中，室温浸泡20-30min。F、共培养共培养培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将成分加入定溶到lOOOml。Ph5.4-5.830ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟。共培养操作将侵染中在菌液中的愈伤组织沥干农杆菌菌液；再将愈伤放置在灭菌后风干的多层(8-10层)滤纸上，超净台晾干约1小时，尽量浸干农杆菌菌液，以免共培养的时候农杆菌生长过多，对愈伤组织损害过度。同时，将共培养培养基倒好，方法同预培养培养基，超净台吹干1-2小时。然后将滤纸上的愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，每皿70颗左右，19-22度暗培养2-3天。待培养基上略见菌斑为宜。G、第一次筛选第一次筛选培养基(以潮霉素筛选为例)筛选培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L;2，4-d:0.5-1.5mg/L;在lOOOml可灭菌的瓶子中将上述成分全部加入，定容到lOOOml，115摄氏度灭菌15分钟。冷却到50摄氏度左右加入25-30mg/L终浓度的潮霉素，600-800mg/L终浓度的头孢，倒平板30ml/9cm平叛。超净台晾干30_60min.筛选操作将共培养的愈伤组织用400-800mg/l浓度的灭菌水洗净表面的农杆菌，直至水清澈。洗干净的愈伤组织均匀放置在灭菌滤纸上超净台放置30分钟，如图4。将滤纸上的愈伤组织均匀的放在筛选培养基上20-30颗/皿。28-32度暗培养20-25天。H、后筛选后筛选培养基(以潮霉素筛选为例)筛选培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L;2，4-d:0.1-0.5mg/L，；细胞分裂素(kt或ba或6_ba等)浓度0.5-1.5mg/L在lOOOml可灭菌的瓶子中将上述成分全部加入，定容到lOOOml，115摄氏度灭菌15分钟。冷却到50摄氏度左右加入30-40mg/L终浓度的潮霉素，倒平板30ml/9cm平叛。超净台晾干10_30min。筛选操作将第一次筛选的阳性愈伤组织(新长出的愈伤组织)颗粒，转移到后筛选培养基上15颗每平皿，28-32度培养7天。分化培养基在LY培养基中加入谷氨酰胺300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:kt:1.5-2.5mg/L;6_ba:1.5-2.5mg/L;NAA:0.1-0.5mg/L;IAA:0.1-0.5mg/L。植物凝胶2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶。将上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml，30ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中用组配封口膜封口后110摄氏度灭菌15分钟。冷凝后即可用。分化操作分化培养基配制好后每个100的三角瓶分装50ml，110度灭菌15分钟。将筛选长出的阳性愈伤组织颗粒放置与分化培养基上，每瓶放置2-3个阳性克隆。26-30度，光照分化10-14天长出绿叶后就可以进行生根。生根培养基在1/2LY培养基中300-/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:NAA:0-0.lmg/L或IAA:0-0.lmg/L。植物凝胶2.5-3.0g/L。Ph值5.6-6.0首先将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶。将上面描述的所有成分加入定溶到1000ml30ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中用组配封口膜封口后110摄氏度灭菌15分钟。冷凝后即可用生根操作将每个克隆分化出的健壮苗每瓶放置2-3棵苗。27-30度光照培养，10-15天后直接移栽。不同品种诱导产生胚性愈伤组织的效率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求一种籼稻愈伤组织培养的培养基，其组成物质和浓度范围如下物质浓度硝酸根离子40-70mM铵离子10-30mM钾离子30-60mM磷酸根离子2-5mM七水硫酸镁150-400mg/l二水氯化钙150-400mg/L硫酸锰20-40mg/L硫酸锌2-10mg/L硼酸5-15mg/L碘化钾1-5mg/L五水硫酸铜0.01-0.1mg/L二水钼酸钠0.1-1mg/L六水氯化钴0.01-0.1mg/L甘氨酸2-4mg/L维生素B11-2mg/L维生素B60.5-1mg/L烟酸0.5-1mg/L肌醇0-100mg/L七水硫酸亚铁20-50mg/LNa2EDTA30-70mg/L。2.权利要求l所述的一种籼稻组织培养基的农杆菌介导的转基因方法，其步骤是A、愈伤组织诱导诱导培养基在n培养基的基础上添加蔗糖30g／L，酸水解酪蛋白500—800mg／L，谷氨酰胺300—500mg／L，脯氨酸300—500mg／L，2，4一Do.5一1.5mg／L，细胞分裂素浓度o.o—o.5mg／L；将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，与本步骤上述成分混匀，定溶到1000ml，pH5.4—5.830ml或50ml／瓶分装到50ml或lOOml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟，或先115度灭绝15min后倒平板，30ml／9Cm平板；①成熟胚诱导a)成熟水稻胚去颖壳之后，75％酒精浸泡lmin；b)o.15％的HgCl，浸泡lo—15分钟；C)用灭菌水洗4遍，每次1分钟；再用灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次；将成熟种子胚接种到诱导培养基上，每瓶5—6颗，放置29—35摄氏度环境下暗培养25—35天，长出的愈伤组织接种到继代培养基上；②幼胚诱导a)幼胚去壳取出后；b)o.15％的HgCl，浸泡15分钟；C)用灭菌水洗4遍，每次1分钟，再灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次；接种到诱导培养基上，每瓶5—6颗；放置29—35摄氏度环境暗培养25—35天长出的愈伤组织接种到继代培养基上；⑧花药诱导a)取花药，先连同颖壳一起o.15％的HgCl，浸泡15分钟；b)用灭菌水洗4遍，每次1分钟，再灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次；C)每50ml三角瓶接种80个花药，放置29—35摄氏度环境暗培养30一40天长出的愈伤组织接种到继代培养基上；幼穗诱导待幼穗发育到2-3cm时取材，将无菌的幼穗剪2-3mm的长度散于培养基上，放置29-35摄氏度环境暗培养30-40天长出的愈伤组织接种到继代培养基上；B、继代继代培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶2.5-3.0g/L，2，4-D0.5-1.5mg/L，细胞分裂素浓度0.0-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，与本步骤上述成分混匀，定溶到1000ml，pH5.4-5.830ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟；继代操作挑取发生于盾片处的生长旺盛、质地坚硬、色泽黄亮的愈伤组织，每个50ml瓶接种0.2克，每个100ml三角瓶接种0.4g，颗粒大小直径3mm，29-35度生长9_13天；C、预培养预培养培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶2.5-3.Og/L，2，4-D0.5-1.5mg/L，细胞分裂素浓度0.0-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，与本步骤上述成分混匀，定溶到1000ml。pH5.4-5.830ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟；预培养操作将生长的愈伤组织块接种于预培养培养基上，60-70块/9cm平皿，28-30度暗培养生长2-3天；D、农杆菌准备将转化的农杆菌菌液在抗性的平板上划线，稠密，30度生长36-48小时，再进行一次划线，生长24-36小时后进行转基因操作；E、农杆菌悬浮培养农杆菌悬浮培养基在1/2LY的基础上添加在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4-D0.5-1.5mg/L，细胞分裂素浓度0.0-0.5mg/L;pH5.4-5.8，30ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟；悬浮侵染操作先将农杆菌悬浮培养基分装在50ml三角瓶，115度灭菌15分钟，温度降到室温后加入终浓度100uM的乙酰丁香酮，将生长的农杆菌平板上的农杆菌刮到农杆菌悬浮培养基里，30度震荡，0.D.值在0.5-1.5的范围内转基因侵染，将预培养的愈伤组织转移到悬浮的菌液中，室温浸泡20-30min;F、共培养共培养培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L，2，4-D0.5-1.5mg/L;细胞分裂素浓度O.0-0.5mg/L;将植物凝胶用800ml去离子水用微波炉煮溶，将本步骤上述成分加入混匀，定溶到1000ml，pH5.4-5.8，30ml或50m1/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后，115摄氏度灭菌15分钟；共培养操作将侵染在菌液中的愈伤组织沥干农杆菌菌液，再将愈伤组织放置在灭菌后风干的8-10层滤纸上，超净台晾干1小时，将滤纸上的愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，每皿70颗，19-22度暗培养2-3天，待培养基上见菌斑；G、第一次筛选第一次筛选培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0-3.5g/L，2，4_D0.5-1.5mg/L;在lOOOml灭菌的瓶子中将本步骤上述成分加入，定容到1000ml，115摄氏度灭菌15分钟，冷却到50摄氏度加入对应载体抗性标记的阳性克隆筛选剂一定浓度，600-800mg/L终浓度的头孢菌素，倒平板30ml/9cm平叛，超净台晾干30_60min;筛选操作将共培养的愈伤组织用400-800mg/L头孢菌素浓度的灭菌水洗净表面的农杆菌，直至水清澈，洗干净的愈伤组织均匀放置在灭菌滤纸上超净台放置30分钟，将滤纸上的愈伤组织均匀的放在筛选培养基上20-30颗/皿，28-32度暗培养20-25天；H、后筛选后筛选培养基在LY培养基的基础上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝胶3.0_3.5g/L，细胞分裂素浓度0.5-1.5mg/L，在lOOOml灭菌的瓶子中将本步骤上述成分加入定容到lOOOml，115摄氏度灭菌15分钟，冷却到50摄氏度左右加入对应载体抗性标记的阳性克隆筛选剂一定浓度，倒平板30ml/9cm平叛，超净台晾干10_30min;筛选操作将第一次筛选的阳性愈伤组织颗粒，转移到后筛选培养基上15颗每平皿，28-32度培养5-7天；I、分化培养分化培养基在LY培养基中加入谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，酸水解酪蛋白500-1000mg/L，蔗糖30g/L，激素KT1.5-2.5mg/L，6_BA1.5-2.5mg/L，NAA0.1-0.5mg/L，IAA0.1-0.5mg/L，植物凝胶2.5-3.0g/L。pH值5.6-6.O，将植物凝胶用800ml去离子水在微波炉中煮溶，将本步骤上述成分加入定溶到lOOOml;30ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中用组培封口膜封口后110摄氏度灭菌15分钟；分化操作分化培养基配制好后每个100的三角瓶分装50ml，110度灭菌15分钟，将筛选长出的阳性愈伤组织颗粒放置在分化培养基上，每瓶放置2-3个阳性克隆，26-30度，光照分化10-14天长出绿叶后进行生根；J、生根培养生根培养基在1/2LY培养基中加入谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，酸水解酪蛋白500-1000mg/L，蔗糖30g/L，激素NAA0-0.lmg/L或IAA0-0.lmg/L，植物凝胶2.5-3.Og/L，pH值5.6-6.O，将植物凝胶用800ml去离子水在微波炉中煮溶，将本步骤上述成分加入定溶到1000ml;30ml或50ml/瓶分装到50ml或100ml容积的三角瓶中用组培封口膜封口后110摄氏度灭菌15分钟；生根操作将每个克隆分化出的绿苗每瓶放置2-3棵苗，27-30度光照培养，10-15天后直接移栽。全文摘要本发明公开了一种籼稻组织培养基及农杆菌介导的转基因方法，该培养基包含水稻愈组织生长所必须的大量元素，小量元素，有机元素以及不同培养阶段的激素配比。基于该培养基的籼稻转基因包括愈伤组织的诱导，继代，预培养，共培养，筛选，后筛选，分化，生根等步骤。本方法广泛适用籼稻基因型，所测试的35个籼稻基因型遗传转化全部获得成功，转化率介于20-50％。解决了长期以来籼稻组织培养和农杆菌介导的遗传转化的技术难题基因型依赖和转化频率低，将广泛应用于籼稻的分子生物学、功能基因组研究和品种遗传改良。籼稻种植的面积占水稻生产总面积的80％以上，本发明对水稻基础生物学研究、新品种改良，以及保障未来粮食安全发挥重要的作用。文档编号C12N15/82GK101717749SQ20091027335公开日2010年6月2日申请日期2009年12月22日优先权日2009年12月22日发明者李阳,李阳生申请人:武汉大学