猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用。所述基因缺失株为含氯霉素抗性标记的CMS基因缺失株SS△CMS，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9735。本发明公开的猪链球菌血清7型重组菌SS△CMS，是采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的载体对猪链球菌7型菌株分支酸合酶编码的基因进行了缺失，同时在缺失位置标记了氯霉素抗性基因而得到的菌株，破坏了分支酸合酶蛋白的表达。本发明得到的基因缺失株比亲本株的毒力强，比国际标准7型和2型菌株的毒力强，可作为科研工作者使用的标准猪链球菌7型试验用强毒菌株。
CGMCC No.3343
20091019
CGMCC No.9735
20140925
【专利说明】猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细菌基因工程【技术领域】，涉及一种含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清 7型分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌（S. suis)属厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目中的链球菌科、链球菌属； 该菌呈球状、多数成短链或成对排列，不形成芽孢，能形成荚膜。S. suis属于革兰氏阳性兼 性厌氧球菌，根据其荚膜多糖抗原特性差异可将其分为35种血清型（1-34型，1/2型）。在 养猪产业，S. suis感染是世界范围的问题，它能引起猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、流 产以及仔猪的突然死亡。该病给养猪业造成的危害较大，是危害西方发达国家养猪业的三 大细菌传染病之一，也是多年来一直困扰中国养猪业发展的主要传染病之一。同时，S. suis 还是一个被忽视的新发人类病原体，能导致人类脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症及 突然死亡的人兽共患病原体。在越南S. suis是导致成人脑膜炎的主要原因，其次是在泰国 和香港。2005年，中国有一次重要的暴发，有200多人感染，死亡率达20% ;病人表现为中 毒性休克综合症，症状为高烧、全身乏力、恶心、呕吐；在严重病例里还出现皮下出血及昏迷 等症状。
[0003] 目前国内外对猪链球菌毒力因子的研究都有所拓展，不仅包括对传统毒素的研 究，还包括对细胞壁蛋白（表面蛋白）的探索。有几类毒力因子已被确认与猪链球菌的致 病性有关：（1)荚膜多糖：它能保护猪链球菌在非免疫动物体内不被免疫系统的各种吞噬 细胞吞噬。（2)溶血素：可能在猪链球菌侵入和裂解细胞的过程中发挥着重要作用。（3)黏 附素：Haataja等证实39ku黏附素以半乳糖为受体的猪链球菌能通过一个糖脂结合位点黏 附于猪咽部上皮组织。（4)谷氨酸脱氢酶：是新发现的一个与猪链球菌毒力相关的潜在毒 力因子。（5)纤连蛋白结合蛋白：介导细胞与细胞外基质的相互作用，在细胞黏附、迁移、生 长、分化和活化过程中起重要作用。除上述毒力因子外，国内外近年来还发现了一些新的毒 力因子，如De GreeffA研究发现了猪链球菌的第一个反应调节因子RevS，并认为其与猪链 球菌的定居能力相关。44kb蛋白为猪链球菌2型的胞壁蛋白，免疫斑点实验证明它具有很 强的免疫原性，高致病株的基因缺失株丧失了对猪的致病能力。属于热休克蛋白家族的IgG 结合蛋白，还有一些其它可能与毒力相关的物质，如细菌表面物质纤毛、粘着素等。但由于 毒力因子的多样性以及复杂性，分离和鉴定更多的毒力因子已成为该领域研究的热点。
[0004] 随着对S. suis研究的深入，对S. suis毒力因子的研究已成为热点。基因组学和 蛋白质组学提供了发现新毒力因子的手段，基因功能研究最经典和最有效的手段，是对目 的基因进行缺失突变分析。分支酸合酶是莽草酸代谢途径里的第7个酶，能催化5-烯醇丙 酮莽草酸-3-磷酸分支酸转化成分支酸。 申请人:前期研究工作发现，在不同毒力的7型猪 链球菌的比较蛋白组学中其表达量差异显著，这个酶表达量的大小是否与猪链球菌的毒力 强弱有关成为研究的焦点。
[0005] 鉴于上述背景，采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的 载体构建我国流行的s. suis 7型菌株的分支酸合酶基因缺失株，研究其遗传特性、生长 特性、对细胞的粘附力和侵袭性、对动物的致病力等生物学特性，为S. suis的防治及揭示 S. suis的致病机理奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合 酶基因缺失株，该缺失株是将猪链球菌菌株分支酸合酶编码的基因进行敲除，同时在缺失 位置标记了氯霉素抗性基因而得到的菌株。
[0007] 本发明的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株为含氯霉素抗性标记的CMS基因缺失 株SS Δ CMS,其分类命名为猪链球菌Streptococcus suis,保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏 编号为CGMCC No. 9735,保藏日期为2014年9月25日。
[0008] 本发明的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株，衍生于 本试验室研究人员从发病猪的脑组织里分离到的S. suis血清7型WC-SS7株（保藏号为 CGMCC No. 3343,将其基因组上的分支酸合酶基因缺失，使CMS蛋白不表达，同时在缺失位置 标记了氯霉素抗性基因，获得了含有氯霉素抗性标记的CMS基因缺失突变株。
[0009] 本发明目的之二是提供一种构建所述的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型 分支酸合酶基因缺失株的方法，其特征是将含有待敲除的目的基因的上、下游同源臂并融 合了氯霉素抗性基因 DNA片断的pSET4s质粒导入所述的猪链球菌血清7型菌株，经同源重 组而实现的。其中，所述的DNA片断从上游至下游依次是CMS上游同源臂、氯霉素抗性基 因、CMS下游同源臂，与所述的猪链球菌7型菌株的CMS蛋白编码基因的上游序列和下游序 列发生同源重组，同时将氯霉素抗性标记在突变株上，得到带有氯霉素抗性标记的CMS基 因缺失株SS Λ CMS。具体构建方法如下：
[0010] 1.以S.suis血清7型WC-SS7株基因组为模板，以CMSK0P1/2为引物扩增上游同 源臂，以CMSK0P5/6为引物扩增下游同源臂，以pSETl载体为模板，CM-F/R为引物扩增氯霉 素抗性盒。切胶回收3个片段，并以3段为模板，以CMSK0P1/6为引物，通过重叠 PCR方法 扩增上下游同源臂中间嵌氯霉素抗性盒的融合片段。纯化该融合产物，克隆至PBLUE载体， 转化E. coli DH5a感受态细胞，经过PCR和酶切鉴定后测序。将测序正确的质粒酶切回收 目的片段，连接pSET4s载体，转化E. coli DH5 a感受态细胞，再经PCR和酶切鉴定，最终获 得敲除载体。pSET4s载体图谱如图1所示。
[0011] 2.取5yL基因敲除载体电转化50yL WC-SS7感受态细胞，经30°C、CO2孵箱内 培养48h，〇1^的THB平板上长出几十个抗性克隆，挑选正确的克隆先后经过30°C双交换和 40°C质粒丢失，最后通过点板的方法获得其因敲除突变体。提取突变株基因组作模板，分别 用不同引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的定义为SS Λ CMS。
[0012] 在本发明的【具体实施方式】中，所述的CMS蛋白编码基因的序列如SEQNO. 1所示。
[0013] 在本发明的【具体实施方式】中，扩增上游同源臂序列的引物序列如下所示：
[0014] CMSKOPI ：ATTGTCGACGCGGTCACTTGGATTTGG
[0015] CMSK0P2 ： CCTCGGAACCCATCGAATTATCCATGAGACTCACCAGC
[0016] 在本发明的【具体实施方式】中，扩增下游同源臂序列的引物序列如下所示：
[0017] CMSK0P3 ：GCGGGATCCAATGAAGAGTTAAAACGGCG
[0018] CMSK0P4 ： GTGGTCGACAATAGTATCTCCATCTCGCT
[0019] 在本发明的【具体实施方式】中，扩增氯霉素抗性基因的引物序列如下所示：
[0020] CM-F ：TAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAA
[0021] CM-R : CACCGAACTAGAGCTTGATGAAAAT
[0022] 本发明的目的之三是提供所述的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸 合酶基因缺失株为科研工作者在试验中作为标准的猪链球菌7型强毒菌株的应用。
[0023] 本发明的目的之四是提供所述的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸 合酶基因缺失株的血清型分型、DNA分型、MlST分型及该菌在小鼠体内的病理复制模型。 [0024] 本发明的主要优点是：
[0025] 1、本发明公开的猪链球菌血清7型重组菌SS Λ CMS，是采用RecA同源重组系统，利 用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的载体对猪链球菌7型菌株分支酸合酶编码的基因进行 了缺失，同时在缺失位置标记了氯霉素抗性基因而得到的菌株，破坏了分支酸合酶蛋白的 表达。
[0026] 2、本发明所用的材料是S. suis血清7型WC-SS7,是从发病猪的脑组织里分离到的 S. suis血清7型流行株，是现地流行菌株的代表，因此，今后以该菌株构建的CMS基因缺失 株为研究对象更具有针对性。
[0027] 3、本发明得到的猪链球菌血清7型CMS基因缺失株比亲本株的毒力强，比国际标 准7型和2型菌株的毒力强，可作为科研工作者使用的标准猪链球菌7型试验用强毒菌株。
[0028] 4、通过该菌可了解该菌株的血清型分型、DNA分型、MlST分型及该菌在小鼠体内 的病理复制模型。
[0029] 保藏信息：
[0030] 一、SS Λ CMS:
[0031] 分类命名：猪链球菌 Streptococcus suis ;
[0032] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0033] 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所；
[0034] 保藏编号：CGMCC No. 9735 ; 保藏日期：2014年9月25日。 二、WC-ss7 株： 分类命名：猪链球菌Streptococcus suis ; 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所； 保藏编号：CGMCC No. 3343 ; 保藏日期：2009年10月19日。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1为pSET4s载体图谱示意图；
[0036] 图2为CMS上下游同源臂、氯霉素抗性基因及多重PCR产物，图中1和2 =CMSiT 游同源臂；3 :DL-2000DNA Maker ;4 :氯霉素抗性基因 Cm ;5 :多重PCR产物；6 :DL-5000DNA Maker ；
[0037] 图3为重组质粒pBLUE-CMS的构建和鉴定，图中1-3 :pBLUE-CMS双酶切鉴定；4 : DL-5000DNA Maker ；
[0038] 图4为重组质粒pSET4s-CMS的构建和鉴定，图中I :DL-2000DNA Maker ;2 : pSET4s-CMS 双酶切鉴定；3 :DL-5000DNA Maker ;
[0039] 图5为突变株55八〇1^的卩0?鉴定结果，图中1:01^-20000嫩1&11?51' ;2-6:55八〇1^ 基因组作模板，分别用5对引物⑶H-F/R，CM-F/R，SPC1/2, CMSK0P3/4, CMSK0P1/6 ;7 :阴性 对照；8 :阳性对照；9 :DL-15000DNA Maker ;
[0040] 图6为WC_ss7株和SS Λ CMS株的猪链球菌种鉴定和S. suis 7型鉴定，图中1和 4 :DL-2000DNA Maker ;2 :WC-ss7基因组作模板，gdh引物；3 :SSACMS基因组作模板，gdh引 物；5 :WC-ss7基因组作模板，S. suis7引物；6 :SS Λ CMS基因组作模板，S. suis7引物；
[0041] 图7为WC-ss7株与SSACMS突变株的革兰氏染色比较；
[0042] 图8为WC-ss7株与SS Λ CMS突变株的生长情况的比较；
[0043] 图9为突变株和野生株对人喉癌上皮细胞H印2的黏附情况；
[0044] 图10为野生株与突变株的脉冲场凝胶电泳图谱。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0046] 1、本发明中所涉及的材料：
[0047] I. 1菌株和质粒（表1)
[0048] 表1所用菌株与质粒
[0049]
【权利要求】
1. 一种猪链球菌分支酸合酶基因缺失株，其特征在于所述基因缺失株为含氯霉素抗性 标记的CMS基因缺失株SS A CMS，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No. 9735。
2. -种权利要求1所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所 述构建方法步骤如下： (1) 以S. suis血清7型WC-ss7株基因组为模板，以CMSK0P1/2为引物扩增上游同源 臂，以CMSK0P5/6为引物扩增下游同源臂，以pSETl载体为模板，CM-F/R为引物扩增氯霉素 抗性盒；切胶回收3个片段，并以3段为模板，以CMSK0P1/6为引物，通过重叠 PCR方法扩增 上下游同源臂中间嵌氯霉素抗性盒的融合片段；纯化该融合产物，克隆至PBLUE载体，转化 E. coli DH5a感受态细胞，经过PCR和酶切鉴定后测序；将测序正确的质粒酶切回收目的 片段，连接pSET4s载体，转化E. coli DH5a感受态细胞，再经PCR和酶切鉴定，最终获得敲 除载体； (2) 取5iiL基因敲除载体电转化50iiL WC-ss7感受态细胞，经30°〇、〇)2孵箱内培养 48h，〇1^的THB平板上长出抗性克隆，挑选正确的克隆先后经过30°C双交换和40°C质粒丢 失，最后通过点板的方法获得其因敲除突变体；提取突变株基因组作模板，分别用不同引物 进行PCR鉴定，将鉴定正确的定义为SS A CMS。
3. 根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所 述CMS蛋白编码基因的序列如SEQN0. 1所不。
4. 根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所 述扩增上游同源臂序列的引物序列如下所示： CMSK0P1 ：ATTGTCGACGCGGTCACTTGGATTTGG ； CMSK0P2 ：CCTCGGAACCCATCGAATTATCCATGAGACTCACCAGC〇
5. 根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所 述扩增下游同源臂序列的引物序列如下所示： CMSK0P3 ：GCGGGATCCAATGAAGAGTTAAAACGGCG ； CMSK0P4 :GTGGTCGACAATAGTATCTCCATCTCGCT。
6. 根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所 述扩增氯霉素抗性基因的引物序列如下所示： CM-F ：TAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAA ； CM-R ：CACCGAACTAGAGCTTGATGAAAAT〇
7. -种权利要求1所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株在试验中作为标准的猪链 球菌7型强毒菌株的应用。
【文档编号】C12N15/74GK104498417SQ201410612576
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】蔡雪辉, 王淑杰, 刘永刚, 金家民 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所