曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，所述检测试剂盒主要包括有：与胺基修饰的支持探针偶联的微球；连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列互补配对的序列；连接目标基因mRNA与信号检测组分间的扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端能与标记探针互补配对的序列。本发明所述试剂盒除了具有特异性好、信噪比高、能够在均一的反应条件下进行杂交反应等优点外，还能实现不同基因mRNA表达水平的稳定检测，即能够在不同样本间，3种内参基因的表达检测稳定,从而使检测结果更易判读。
【专利说明】曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及曲妥珠单抗疗 效相关基因表达检测液相芯片试剂盒。
【背景技术】
[0002] 曲妥珠单抗（trastuzumab，也称为赫赛汀，Herceptin)，是抗HER-2的单克隆抗 体，它通过将自己附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细 胞的生长，赫赛汀还可以刺激身体自身的免疫细胞去摧毁癌细胞。
[0003] (1)原癌基因人类表皮生长因子受体2 (HER-2)
[0004] HER-2即CerbB2基因，是EGFR家族成员之一。HER-2蛋白是原癌基因 CerbB2(HER-2/neu)编码的具有受体酪氨酸激酶（RTK)活性的跨膜糖蛋白，分子量185kDa， 简称P185,属表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族，能启动酪氨酸激酶调控的信号转导系统。 赫曲妥珠单抗是一种针对HER-2/neu原癌基因产物的人源化单克隆抗体，能特异结合于 HER2受体胞外段干扰HER-2与其它ErbB家族成员形成异源二聚体，从而抑制肿瘤细胞增 殖，促进肿瘤细胞凋亡。曲妥珠单抗1998年获美国FDA批准上市用于治疗HER-2过度表达 的转移性乳腺癌。作为与乳腺癌的转移预后密切相关的基因之一，HER2受体的过表达是乳 腺癌的发病机制的独立危险因子，成为目前研究的热点之一。
[0005] 研究表明，HER_2mRNA水平与乳腺癌的浸润性有关，HER-2RNA过表达的乳腺癌浸 润性强，无病生存期短，预后差。北美乳腺癌协作组的一项研究指出：确定可手术乳腺癌患 者的HER-2表达水平时，可以检测该基因RNA表达量，并且可以代替标准的IHC蛋白表达 检测法。多项研究表明：赫赛汀的疗效与HER2mRNA和蛋白的表达水平有关。在第44届美 国临床肿瘤学年会（ASC0)上报告的最新数据显示：在晚期（转移性）乳腺癌的临床研究中 发现，HER2RNA过表达的患者在接受赫赛汀治疗时有较长的无疾病进展生存时间，且在用赫 赛汀治疗中出现疾病进展而需要进一步治疗的妇女中，使用赫赛汀治疗仍然有效。
[0006] (2)张力蛋白同源物磷酸酯酶基因（PTEN)
[0007] 张力蛋白同源物磷酸酯酶基因（PTEN)为PI3K/AKT信号通路的一种负调节因子， 目前研究显示，PTEN与肿瘤对曲妥珠单抗的敏感性有关。
[0008] (3)持家基因β 2-微球蛋白（B2M)、铁传递蛋白受体（TFRC)和TATA框结合蛋白 (TBP)
[0009] 持家基因一般在体内可稳定表达，但由于这种稳定表达是相对的，在一定的病理 状态或用药情况下，某些常用的持家基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中 稳定表达的基因作持家基因，对保证检测结果的准确性至关重要。因此，本发明从一定数量 的常用持家基因中进行筛选，确定3个合适的持家基因，分别是：β 2-微球蛋白（B2M)、铁传 递蛋白受体（TFRC)、TATA框结合蛋白（ΤΒΡ)。
[0010] 基于以上基因的表达水平与受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效的相关性，专 家推荐患者在接受靶向药物之前，应当进行相关的基因mRNA表达水平的检测，帮助临床医 生根据患者的个体差异制定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。 [0011] 目前，对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有：逆转录定量PCR法、实时荧 光定量PCR法、RNA原位核酸杂交（RISH)等。其中，RISH主要用于分析组织或细胞内RNA 分布以了解特定基因的表达情况，且其过程较长、操作繁琐，不适合用于临床应用；而逆转 录定量PCR法与实时荧光定量PCR法，首先，这两种方法均需要进行RNA抽提、逆转录，检测 的结果受RNA降解影响大；其次，这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增，容易产生非特 异性结合，从而导致假阳性高；再次，这两种方法一般只有一个持家基因作对照，其准确性 容易受到病理状态的影响；因此，逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作为临床应用均 存在着难以克服的技术缺陷。针对现有技术存在的上述问题，本发明 申请人:在项目开发早 期申请了的中国发明专利（申请号：200910193802. 8)，但其针对同一样本不同基因mRNA检 测信号的强弱不均衡，从而影响到目标基因PTEN和HER-2的检测结果判读，因此急需对该 产品进行改进。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是提供一种曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，该 检测试剂盒除了可以高灵敏度和特异性地单独或者任意组合并列检测以下5种目标基因 的表达水平：PTEN、HER-2、B2M、TFRC、TBP，且其中3种内参基因表达检测更加稳定。
[0013] 实现上述目的的技术方案如下：
[0014] 一种曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，主要包括：
[0015] (4)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5'端的间隔臂序 列和3'端的能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 5,每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；
[0016] (5)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针的碱基 序列从5'端到3'端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序 列、能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异 性序列P2包括有：针对PTEN基因的选自SEQ ID N0. 6 - SEQ ID N0. 10中的2条以上、针 对HER-2基因的选自SEQ ID NO. ll - SEQ ID N0. 15中的2条以上、针对B2M基因的选自 SEQ ID N0. 16 - SEQ ID N0. 20 中的 2 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID N0. 21 - SEQ ID NO. 25中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 26- SEQ IDN0. 30中的2 条以上；
[0017] (6)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5'端到3'端依次为：能与目 标基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5, 3'末端还修饰有生物素；所 述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对PTEN基因的选自SEQ ID N0. 31 - SEQ ID NO. 40中的5条以上、针对HER-2基因的选自SEQ ID NO. 41 -SEQ ID NO. 50中的5条以 上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的5条以上、针对TFRC基因的 选自SEQ ID NO. 61 -SEQ ID NO. 70中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 71 - SEQ ID NO. 80中的5条以上，所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形 成二聚体、不存在错配、与PI、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
[0018] 或者，主要包括：
[0019] (3)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5'端的间隔臂序 列和3'端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 5,每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；
[0020] (4)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针的碱基 序列从5'端到3'端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序 列、能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性 序列P2包括有：针对PTEN基因的选自SEQ ID N0. 6 - SEQ ID N0. 10中的2条以上、针对 HER-2基因的选自SEQ ID N0. 11 - SEQ ID N0. 15中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID N0. 16 - SEQ ID N0. 20 中的 2 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID N0. 21 - SEQ ID NO. 25中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 26 - SEQ ID NO. 30中的2条 以上；
[0021] (5)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5'端到3'端依次为：能与目 标基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5 ;所述扩增延伸探针的特异性 序列P4包括有：针对PTEN基因的选自SEQ ID N0. 31 - SEQ ID N0. 40中的5条以上、针 对STMN1基因的选自SEQ ID N0. 41 - SEQ ID N0. 50中的5条以上、针对B2M基因的选自 SEQ ID N0. 51 - SEQ ID N0. 60 中的 5 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID N0. 61 - SEQ ID NO. 70中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 71 - SEQ ID NO. 80中的 5条以上；所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与PI、 P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和
[0022] (6)标记探针,所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的序列，且末端具 有生物素修饰。
[0023] 在其中一个实施例中，所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平检 测液相芯片，还包括有填充序列，包括有：针对PTEN基因的SEQ ID N0. 82-SEQ ID N0. 84、 针对HER-2基因的选自SEQ ID NO. 85 - SEQ ID NO. 87中的一条或多条、针对B2M基因的选 自SEQIDN0·88 - SEQIDN0·91中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQIDN0·92 - SEQ ID N0. 93中的一条或多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID N0. 94 - SEQ ID N0. 95。
[0024] 在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5 - 10个T ;所述P5的组成为SEQ ID NO. 81。
[0025] 本发明的主要优点在于：
[0026] (1)本发明在已有产品的基础上，通过各种探针的设计和组合的进一步优化，除了 具有特异性好、信噪比高、能够在均一的反应条件下进行杂交反应等优点外，还能实现不同 基因mRNA表达水平的稳定检测，即能够在不同样本间，3种内参基因的表达检测稳定，从而 使检测结果更加准确。
[0027] (2)所设计的各种探针能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间 基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的 组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统，有着操作简易、准确性高、 特异性高的特点。
【具体实施方式】
[0028] 本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提 供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0029] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的【技术领域】 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所 列项目的任意的和所有的组合。
[0030] 实施例1曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，主要包括有：
[0031] 一、偶联有支持探针（SP)的微球
[0032] 支持探针由三部分组成，5'端是与微球结合的胺基端，3'端是与支持延伸探针结 合（互补配对）的特异序列P1，长度为16nt，中间是间隔序，所述间隔臂为本领域的技术人 员所理解的，即用于将支持探针与微球表面间隔开来，在支持延伸探针与扩增延伸探针内 部也存在间隔臂序列，通过在探针序列与氨基之间、探针内部设置适当长度的间隔臂序列， 可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明支持探针的间隔臂 优选为5 - 10个T，本实施例所述间隔臂序列是8个T。每个目标基因选用一种微球，并选 用一条支持探针，每种微球具有不同的荧光编码。
[0033] 本实施例中，每个目标基因的支持探针如表1所示：
[0034] 表1不同的目标基因及其选用微球的编号、支持探针（SP)
[0035]
【权利要求】
1. 一种曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于，主要包括： (1) 与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5'端的间隔臂序列 和3'端的能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 5,每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码； (2) 连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针的碱基序列 从5'端到3'端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序列、 能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序 列P2包括有：针对PTEN基因的选自SEQ ID NO. 6 - SEQ ID NO. 10中的2条以上、针对 HER-2基因的选自SEQ ID NO. 11 - SEQ ID NO. 15中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 16 - SEQ ID NO. 20 中的 2 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID NO. 21 - SEQ ID NO. 25中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 26 - SEQ ID NO. 30中的2条 以上； (3) 扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5'端到3'端依次为：能与目标基 因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5, 3'末端还修饰有生物素；所述扩增 延伸探针的特异性序列P4包括有：针对PTEN基因的选自SEQ ID NO. 31 - SEQ ID NO. 40 中的5条以上、针对HER-2基因的选自SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50中的5条以上、针对 B2M基因的选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的5条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 61- SEQ ID NO. 70中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 71- SEQ ID NO. 80中的5条以上，所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存 在错配、与PI、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
2. 根据权利要求1所述的曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特 征在于：还包括有填充序列，所述填充序列为：针对PTEN基因的SEQ ID NO. 82 - SEQ ID NO. 84、针对HER-2基因的选自SEQ ID NO. 85 - SEQ ID NO. 87中的一条或多条、针对B2M 基因的选自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 91中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 92- SEQ ID NO. 93中的一条或多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID NO. 94 - SEQ ID NO. 95。
3. 根据权利要求1所述的曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特 征在于：所述特异性序列P1为：针对PTEN基因的SEQ ID NO. 1、针对HER-2基因的SEQ ID NO. 2、针对B2M基因的SEQ ID NO. 3、针对TFRC基因的SEQ ID NO. 4、和/或针对TBP基因 的选自 SEQ ID NO. 5。
4. 根据权利要求1所述的曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征 在于：所述间隔臂序列为5 - 10个T。
5. 根据权利要求1一4任一项所述的抗曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试 剂盒，其特征在于：所述P5的组成为SEQ ID NO. 81。
6. -种曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：主要包括： (1) 与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5'端的间隔臂序列 和3'端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 5,每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码； (2) 连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针的碱基序列从 5'端到3'端依次为：对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序列、能与对 应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包 括有：针对PTEN基因的选自SEQ ID NO. 6 - SEQ ID NO. 10中的2条以上、针对HER-2基因 的选自SEQ ID NO. 11 -SEQ ID NO. 15中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 16 - SEQ ID NO. 20中的2条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 21 - SEQ ID NO. 25中的2 条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 26 - SEQ ID NO. 30中的2条以上； (3) 扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5'端到3'端依次为：能与目标 基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5 ;所述扩增延伸探针的特异性序 列P4包括有：针对PTEN基因的选自SEQ ID NO. 31 - SEQ ID NO. 40中的5条以上、针对 HER-2基因的选自SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50中的5条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60 中的 5 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID NO. 61 - SEQ ID NO. 70中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 71 - SEQ ID NO. 80中的5条 以上；所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、 P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和 (4) 标记探针，所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的序列，且末端具有生 物素修饰。
7. 根据权利要求6所述的曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特 征在于：还包括有填充序列，所述填充序列为：针对PTEN基因的SEQ ID NO. 82 - SEQ ID NO. 84、针对HER-2基因的选自SEQ ID NO. 85 - SEQ ID NO. 87中的一条或多条、针对B2M 基因的选自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 91中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 92- SEQ ID NO. 93中的一条或多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID NO. 94 - SEQ ID NO. 95。
8. 根据权利要求6所述的曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特 征在于：所述特异性序列P1为：针对PTEN基因的SEQ ID NO. 1、针对HER-2基因的SEQ ID NO. 2、针对B2M基因的SEQ ID NO. 3、针对TFRC基因的SEQ ID NO. 4、和/或针对TBP基因 的选自 SEQ ID NO. 5。
9. 根据权利要求6所述的曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征 在于：所述间隔臂序列为5 - 10个T。
10. 根据权利要求6- 9任一项所述的曲妥珠单抗疗效相关基因表达检测液相芯片试 剂盒，其特征在于：所述P5的组成为SEQ ID NO. 81。
【文档编号】C12Q1/68GK104195230SQ201410356989
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】吴诗扬, 罗彩英, 杨惠夷, 何嘉英 申请人:益善生物技术股份有限公司