一株硝基还原假单胞菌及其应用的制作方法

文档序号:573848阅读:448来源:国知局
专利名称:一株硝基还原假单胞菌及其应用的制作方法
技术领域
本发明属于环境微生物领域,具体涉及一株硝基还原假单胞菌及其在生物 降解喹啉或其衍生物中的应用。
背景技术
喹啉(又称氮杂萘)是含氮杂环化合物的典型代表,又是大量复杂含氮杂 环化合物的基本结构单元。喹啉及其衍生物广泛存在于天然产物如煤焦油、矿 物油、杂酚油、化石燃料和植物碱中,同时还是焦化废水、橡胶废水、制药废 水等多种工业废水中重要的难降解有机污染成分。由于这类化合物水溶性较强, 已成为土壤和地下水中常见的污染物,在固体垃圾掩埋场、炼钢厂和化石燃料 加工厂附近污染尤其严重。大量研究证明,喹啉及其衍生物对动物和人体具有 毒性、致癌和致突变等危害性,已给生态环境和人类健康造成了潜在威胁。如 何降低和控制环境中含氮杂环化合物的含量正成为社会关注和科学研究的热 点。由于自然界中喹啉类含氮杂环化合物光解速度缓慢,很多研究者将目光投 向生物降解,并进行了大量研究,利用微生物降解是有效消除喹啉污染的新途 径。
自然界中存在许多特殊的具有降解有机污染物的微生物资源,研究这些微 生物的降解功能对效降低环境中有毒有害物质具有重要的科学意义和应用价
值。1976年Grant等发现莫拉氏菌(Moraxe〃a sp.)可以降解喹啉(Grant DJW等, M'cra&os, 1976, 15(61-62): 177-89),随后研究人员相继发现了许多其他可以降 解喹啉的微生物,如皮氏伯克霍尔德氏菌(^^狄o/^n'a^c^m'/)、食酸丛毛单胞 菌(C"o附a附owas "c/cfovora"s)、辜丸銅丛毛单胞菌(Go附a附o""51 ferfostero"0、发酵字L木干菌(Z^cto6ac/〃MS々rme" M附)、纟录脓杆菌(尸s^wcfowowcw oren/gi"osfl)、月兑硫菌 (i /2Cwfococc附sp.)、荧光j叚单胞菌(尸se"(iowo"a5^/7womscera1)、恶臭假单胞菌 (/^Mt/tW7o"os/^/(ia)、 红球菌(i /zocfococcws sp.)、 芽抱杆菌(5ac〃/w sp.)等细
菌和白腐菌等真菌。这些微生物多数是通过富集培养,然后以喹啉为唯一碳氮 源分离而得。
目前国内外有许多应用微生物活体降解喹啉的报道,但可以降解喹啉的最 大浓度普遍偏低。如崔明超报道了一株睾丸酮丛毛单胞菌(Co附"mow^ festo^eram'),可以完全降解250mg/L喹啉浓度的废水(崔明超等,环境科学学 报,2004,24(1): 171-173)。朱顺妮分离到的一株红球菌(i^o出coccM sp.) QL2 的最佳喹啉降解浓度为150mg/L (朱顺妮等,环境科学,2008, 29(2): 488-493)。 少数革兰氏阳性菌对喹啉降解能力较强,如发酵乳酸杆菌a"ctok^7/w sp.) Q5可以在72h内降解掉72.6%的初始浓度500mg/L的喹啉, 一株芽孢杆菌 (Bad〃M sp.) Q5对800mg/L喹啉降解率达到60%,极限浓度为1000mg/L (房 苗苗等,石油学报,2007, 23(5): 111-116),但降解率不足20%。目前报道的假单 胞菌降解喹啉能力一般较低,洪新分离到的一株假单胞菌(户M^fomo"wsp.) 最大喹啉降解浓度仅为140mg/L(洪新等,辽宁石油化工大学学报,2005,25(2): 32-35),超过该浓度菌体生长受到抑制。柏耀辉报道过一株可以同时去除吡啶 和喹啉的假单胞菌(i^e"domo"as sp.) BC001 (柏耀辉等,北京大学学报(自 然科学版),2007,2(3): 1-7),但该菌对吡啶的去除属于生物吸附,即不能利用 吡啶为碳氮源生长而进行代谢转化,对喹啉去除包括生物吸附和生物降解,可 以降解初始浓度500mg/L喹啉的废水。在实际污染现场,喹啉浓度或者较高, 或者与其他污染源同时存在,加大了生物技术处理的难度。因此筛选能降解高 浓度喹啉的微生物菌种,对丰富微生物资源,改善生态环境具有深远的现实意
4义。

发明内容
本发明的目的在于提供一株硝基还原假单胞菌及其应用。
本发明所提供的硝基还原假单胞菌为硝基还原假单胞菌(i^e"ctomo"w "/加涵c卿)CQ1 CGMCCNo.3159。
所述硝基还原假单胞菌(尸化t^o/woww "/^w^/wcera) CQ1,已于2009年7 月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其简称为 CGMCC,保藏号为CGMCCNo.3159。 、
本发明的硝基还原假单胞菌(i^ewcfo附o"a; ""ra^a^cera) CQ1来源于北京 燕山石化公司污水处理系统中的氧化塘污水,经过富集、分离和纯化得到,是 废水处理系统中的优势菌株,能处理含喹啉或其衍生物浓度较高的废水,有较 好的应用前景。
本发明所述硝基还原假单胞菌(尸sew必附o"as"/^w^/wce附)CQ1的特征 1)、形态学特征
该菌在无机盐固体培养基中菌落呈白色晕状,边缘参差不齐,在无机盐液 体培养基中为黄色悬浊液。革兰氏染色为阴性杆菌,极生鞭毛,多数菌株鞭毛 在两根以上可运动,菌体杆状,大小为0.6~1 ^imxl.5 2(im (见图1)。
所述无机盐液体培养基的配制为Na2HP04 6.0g 、 KH2P04 3.0g、 NaCl 0.5g, 去离子水定容至1L后灭菌;配制1M MgS(V7H20和1M CaCl2两种溶液,灭 菌;在无菌条件下,取lMMgSO(7H20和1MCaCl2两种溶液加入上述灭菌的 盐溶液中,使其终浓度为0.001mol/L。
所述无机盐固体培养基的配制为Na2HP04 6.0g 、 KH2P04 3.0g、 NaCl 0.5g, 琼脂粉12g,去离子水定容至1L后灭菌;配制1M MgS04'7H20和1M CaCl2两种溶液,灭菌;在无菌条件下,取1MMgSCV7H20和1MCaCl2两种溶液加 入上述灭菌的盐溶液中,使其终浓度为0.001mol/L,然后倒平板。
2) 、 CQ1菌株的16S rDNA鉴定
PCR扩增硝基还原假单胞菌(尸ww(iomo"ay m'^w^/wcmy) CQ1菌株16S rDNA约1.5 kb,测序结果具有序列表中SEQ ID No.l的核苷酸序列,将CQ1 菌的16S rDNA片段在GenBank中进行同源性比对,该菌与i^e^owo"o m rom/wcem (EF107515)同源性最高,达到99%。使用MEGA4软件,利用邻 位互换算法(CNI)搜索最小进化树(ME树),由K2P模型产生ME树(见图2)。
3) 、生理生化特征
CQ1菌为专性好氧菌,呼吸型代谢;有可扩散的荧光,氧化酶阳性,不水 解明胶和淀粉,不产硫化氢,精氨酸双水解反应阳性,可以将硝酸盐还原成亚 硝酸盐,尿酶反应、赖氨酸脱羧酶反应阳性;能够利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯 糖、已二酸、柠檬酸、羟基-L-脯氨酸等碳源,不能利用丙二酸、甲酸苄酯、L-丝氨酸、犬尿胺酸、马尿酸、乙酰胺和氨基苯,与模式菌P ""rare血cera DSM 14399相比,本发明的菌株还能利用甘露醇、山梨醇、肌醇、鼠李糖;4"C以下 和4rC以上不生长,最适生长温度3(TC,最适pH为7.5。
表lCQ1生理生化试验结果
生理生化试验结果生理生化试验结果
可扩散的荧光+阿拉伯糖+
氧化酶+山梨醇+
淀粉酶-鼠李糖+
精氨酸双水解酶+肌醇+
H2S产生-乙醇酸—
明胶水解-丙二酸—
脲酶+己二酸+
P-半乳糖苷酶-柠檬酸+
赖氨酸脱羧酶+甲酸苄酯—
鸟氨酶脱羧+L-丝氨酸—
反硝化反应+羟基-L-脯氨酸+蔗糖产果聚糖 - 犬尿胺酸 _
碳源利用
葡萄糖
蔗糖 甘露醇
4) 抗生素抗性特征
本发明菌株CQ1对硫酸卡那霉素、四环素和庆大霉素敏感。
5) 质粒特征
该菌不携带质粒,可以用作构建具有多种降解能力的基因工程菌。 参照《Bergey,s Manual of Deteriminative Bacteriology》第9版和《常见细菌 系统鉴定手册》假单胞菌属特征,结合其形态特征和16S rDNA基因序列相似性, 将CQ1菌鉴定为石肖基还原1^单胞菌i^ewcfomo"as m'/rore^/ce似。
本发明所述硝基还原假单胞菌在好氧条件下可以利用喹啉或其衍生物作为 唯一碳氮源。该菌可在LB培养基中生长,也可在含有喹啉浓度为100-700mg/L 的无机盐培养基中培养,生长温度为28-32。C, pH7-9,最适生长温度为3(TC, 最适pH为7.5。
上述硝基还原假单胞菌CQ1的应用是指该菌在生物降解喹啉或其衍生物 中的应用。
所述生物降解喹啉或其衍生物为降解污水中的喹啉或其衍生物,具体方法 为将硝基还原假单胞菌(尸化Wowowasm^wec/Mcem) CQl CGMCC No.3159接 种于含有喹啉或其衍生物的污水中,在28-32。C条件下培养36-72h。 所述污水中喹啉或其衍生物浓度不超过700mg/L。
所述硝基还原假单胞菌(i^eMc/owo"osmYrwe甴ce"s) CQl CGMCCNo.3159 接种量为lxl07-lxl08cfu/mL。
本发明的有益效果本发明菌株硝基还原假单胞菌(AewAmo"w
7
酸胺苯
尿酰基
马乙JL亂
+ + +m'frwe^cera) CQl CGMCC No.3159可降解喹啉或其衍生物的浓度达到 700mg/L,处理72h后,降解率达到100%,能较好满足工业生产中喹啉处理浓 度高,时间短等要求。此夕卜,本发明菌株CQ1对硫酸卡那霉素、四环素和庆大 霉素敏感,在实际使用中不会向土著菌传递这些耐药因子,保证使用的安全性。 该菌不携带质粒,可以用作构建具有多种降解能力的基因工程菌。在好氧条件 下可以利用喹啉为唯一碳氮源。本发明丰富了微生物资源,为生物降解高浓度 喹啉或其衍生物提供了优良菌种,对改善生态环境具有深远的现实意义。


图1为CQ1菌电镜扫描照片;
图2为CQ1菌株及其近缘属种的聚类分析树状图3为CQ1菌株在多种初始喹啉浓度下的降解曲线;
图4为CQ1菌株在700mg/L喹啉浓度的无机盐培养液中生长和降解情况。
具体实施例方式
本发明实施例中培养基配制均采用常规方法配制。实施例中涉及的分子生 物学操作如未注明具体试验条件和方法,均参照SambrookJ等主编,科学出版
社,2002,分子克隆实验指南(第三版)。
以下实施例中使用的培养基的配制
1L富集培养基的配制胰蛋白胨5.0g,葡萄糖1.5g,酵母粉2.5g, NaCl 5.0 g,去离子水定容至1L, HC1或NaOH调节pH至7.2。
所述无机盐液体培养基的配制为Na2HP04 6.0g 、 KH2P04 3.0g、 NaCl 0.5g, 去离子水定容至1L后灭菌;配制1M MgS04'7H20和1M CaCb两种溶液,灭 菌;在无菌条件下,取1MMgS(V7H20和1MCaCl2两种溶液加入上述灭菌的 盐溶液中,使其终浓度为0.001mol/L。所述无机盐固体培养基的配制为Na2HP04 6.0g 、 KH2P04 3.0g、 NaCl 0.5g, 琼脂粉12g,去离子水定容至1L后灭菌;配制1M MgSOWH20和1M CaCl2 两种溶液,灭菌;在无菌条件下,取1MMgSCV7H20和1MCaCl2两种溶液加 入上述灭菌的盐溶液中,使其终浓度为0.001mol/L,然后倒平板。
1L常用LB液体培养基的配制:在950 ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g、 酵母提取物5g、 NaC110g,摇动容器直至溶质溶解。用NaOH或HCl调pH至 7.2,用去离子水定容至1L,高压灭菌20min。
1L常用固体LB培养基的配制在上述常用液体LB培养基中再加入12g 琼脂,其他同常用液体LB培养基的配制,高压灭菌后倒平板。
实施例l:硝基还原假单胞菌(尸5e油附o腦"z.旨e血固s) CQ1的分离及纯化 将取自北京燕山石化公司废水处理系统中的氧化塘废水lOmL,接种到含 200mg/L喹啉的lOOmL富集培养基摇瓶中,于30°C 、 160 rpm摇床震荡培养5 d。 以此摇瓶中的培养菌液作为菌种,转接至含同样浓度喹啉的新鲜富集培养液中, 接种量为5mL,再次驯化培养5d,共转接3次。将最后一次培养的菌液5mL 接种到lOOmL含喹啉500mg/L的无机盐液体培养基中,在同样条件下培养, 每5 d转接1次,转接3次。将最后一次培养菌液用富集培养液梯度稀释成10x 和100x菌液,分别涂布在以喹啉为唯一碳、氮源的500mg/L喹啉的无机盐固体 培养基上,3(TC在培养箱中培养5d。挑取长势较好的单菌落,接入LB固体培 养基上。在3(TC下培养72h,将LB固体培养基上的单菌落接种于含500mg/L 喹啉的无机盐固体培养基上,反复划线纯化,以不添加喹啉的作对照。挑取能 够在无机盐固体培养基上健康生长的细菌菌落,其中有一菌落表现较好,定名 为CQ1菌株。实施例2:硝基还原假单胞菌(i^ewdomoww w^wedwce附)CQ1的16S rDNA
鉴定
以CTAB法提取CQ1菌的基因组DNA为模板,采用扩增细菌16S rDNA全长的保守引物27F和1495R(Lane DJ, Wiley, Chichester, 1991, 115-175),扩增CQ1菌株16S rDNA约1.5 kb。
27F: 5 ,-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3 , ( SEQ ID No.2)1495R: 5,-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3, (SEQIDNo.3)
PCR反应组分为
10xPCR buffer 5 pi
dNTP (2.5 mM) 5 ^
引物27F (10|iM) 2^1
引物1495R(10nM) 2pl
gDNA (O.l吗) 1 pi
PfiiTaq (5U/nL) 0.5 pi
ddH20 34.5 pi
总体积 50 ^
PCR扩增反应条件为94t:变性5 min; 94匸变性40 s, 53"C复性40s, 72°C延伸lmin,循环数为35; 72。C充分延伸10min。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后连接到T载体上克隆,经蓝白筛选后提取质粒测序,测序公司为上海生工,测序结果表明具有序列表中SEQIDNo.l的核苷酸序列。
将CQl菌的16SrDNA片段在GenBank中进行同源性比对,发现该菌与i^ew^w7omw m'^wWwcem (Genbank登录号EF107515)同源性最高,达到99%。用DNAMAN (Version 6)对序列进行比对及对齐操作。使用MEGA 4软件通过Kimura2-Earameter(K2P)模型计算距离矩阵。使用MEGA4软件,利用邻位互换算法(CNI)搜索最小进化树(ME树),由K2P模型产生ME树(见图2),并进行IOOO次重复的自展检验。
参照《Bergey,s Manual of Deteriminative Bacteriology》第9版和《常见细菌系统鉴定手册》假单胞菌属特征,结合其形态特征和16S rDNA基因序列相似性,将CQ1菌鉴定为石肖基还原假单胞菌尸sewcfo附o"os "〖^we(^Mcera。实施例3:硝基还原假单胞菌CQ1对喹啉的降解效果检测
取纯化后的菌株,接种于LB培养液中,培养至OD6oo-0.6,按1:500(V : V)接种量接种于100ml、 pH7.5的无机盐液体培养基,其中喹啉含量分别为200mg/L、 300mg/L、 400mg/L、 500mg/L、 600mg/L、 700mg/L和800mg/L。在30°C、 170rpm摇床培养,每隔6h取出3 ml测定006()()值。然后将菌液12000rpm离心10min,取上清进行高压液相色谱分析(HPLC)。每处理重复3个。
1) 、喹啉浓度测定色谱柱采用安捷伦ZORBAXSB-C18色谱柱(250 x4.6 mm,5(xm); VWD UV-Vis Detector;流动相为V甲醇V水=4 : 1,流速为1 mL/min;检测波长为275nm,进样体积为10pL,滞留时间7.5min。
2) 、 CQ1生长曲线测定上海尤尼柯2102型紫外可见分光光度计测定波长为600nm的光密度值。
CQ1菌株对不同初始喹啉浓度的降解情况,见图3; CQ1菌株在700mg/L喹啉浓度的无机盐培养液中生长和降解情况见图4。
实验结果表明,降解初期,CQ1生长缓慢,主要由于其从营养丰富的LB培养基转入以喹啉为唯一碳氮源的无机盐培养基,需要一定的适应时间,此为微生物生长的停滞时间,根据喹啉的初始浓度不同,低浓度喹啉(200-500mg/L)中的菌生长停滞期大约需要6-24h,高浓度喹啉(500-700mg/L)时间较长,约60h。之后经过6-12h进入对数生长期,该期的喹啉降解量随生长速率增加而显
11著提高,残留喹啉量有时甚至呈直线下降。200-500mg/L的初始喹啉浓度42h内可以完全降解完,高浓度的喹啉也可以在72h内降解完全,表现出较好的降解能力。对800mg/L喹啉降解能力较弱,84h内降解率仅为16.6%。实施例4:硝基还原假单胞菌(尸"W(iomow"smYra7^/"cms) CQ1的抗性检测
将纯化后的该菌分别接种于含50mg/L浓度的氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四环素、利福平和庆大霉素抗生素的LB固体培养基中,3(TC温箱中静置培养5d,观察菌体是否在培养基上生长。结果表明,该菌对对硫酸卡那霉素、庆大霉素和四环素均无抗性,在实际使用过程中不会向环境传递这些耐药因子,保证了生态安全性。
实施例5:硝基还原假单胞菌(/^ew^wo"osmYra/^/wce/M) CQ1的质粒检测用改进的碱裂解法提取CQ1的质粒,具体方法如下
1、 将纯化后的CQ1接种于LB液体培养基中,在30。C、 170rpm条件下培养至对数生长期;
2、 取1 mL菌液装于离心管中,4X:条件下12000 r/min离心1 min收集菌体;
3、 加入250pL的Pl溶液,振荡悬浮沉淀;
4、 加入250 pL的P2溶液,轻轻混匀,颠倒几次至溶液澄清、黏稠;
5、 加入250 ^L的P3溶液,颠倒混匀(可稍微剧烈)至出现白色絮状物,4aC条件下12000 r/min离心10 min;
6、 将上清转移到新的离心管,加0.6倍体积的异丙醇,轻轻混匀,12000 r/min离心15 min;
7、 去上清,力G 1 mL无水乙醇,轻混,12000 r/min离心5 min;
8、 去上清,无菌风吹干,加20pLTE溶液溶解沉淀;
9、 琼脂糖凝胶电泳分析。所用试剂
Buffer Pl:在800 mL Milli-Q中加入6.06 g Tris base, 3.72 g EDTA.2H20,用HCl调节pH至8.0,定容至1升,灭菌后4。C保存。
Buffer P2:在800 mLMilli-Q中加入8.0 gNaOH, 10.0 g SDS,定容至1升,不
灭菌常温保存。
Buffer P3:: 500 mL Milli-Q中加入294.5 g乙酸钾,用冰醋酸调节pH至5.5,定容至1升,不灭菌4"C保存。
质粒检测结果表明,该菌不携带质粒,有利于外源质粒进行水平基因转移,避免了质粒的不相容性,是构建具备多种降解能力的基因工程菌的良好材料。
参考文献
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<110>华北电力大学
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<130> 34
<160> 3
<170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 1397 <212> DNA
<213> Pseudomonas nitroreducens <400> 1
tgcaagtcga gcggatgagt ggagcttgct ccatgattca gcggcggacg ggtgagtaat 60
gcctaggaat ctgcctggta gtgggggaca acgtttcgaa aggaacgcta ataccgcata 120
cgtcctacgg gagaaagcag gggaccttcg ggccttgcgc tatcagatga gcctaggtcg 180
gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg atccgtaact ggtctgagag 240
gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300
gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggtctt 3 60
cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggcagtaa gttaatacct tgctgttttg 420
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tagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga aggaacacca 660
gtggcgaagg cgaccacctg gactgatact gacactgagg tgcgaaagcg tggggagcaa 720
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ttgagatttt agtggcgcag ctaacgcgat aagtcgaccg cctggggagt acggccgcaa 840ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt
900
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1080
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atcatggccc ttacggccag ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca gagggttgcc 1200
aagccgcgag gtggagctaa tcccataaaa ccgatcgtag tccggatcgc agtctgcaac 1 260
tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtgaatca gaatgtcacg gtgaatacgt13 20
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgctcc agaagtagct 1380
agtctaaccg caagggg
1397
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增CQl 16S rDNA的上游引物
<400> 2
gagagtttga tcctggctca g
21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增CQl 16S rDNA的下游弓I物
<400> 3
ctacggctac cttgttacga
20
1权利要求
1、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1 CGMCC No.3159。
2、 权利要求l所述硝基还原假单胞菌的应用,其特征在于,所述硝基还原假单 胞菌在生物降解喹啉或其衍生物中的应用。
3、 根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述生物降解喹啉或其衍生物为 降解污水中的喹啉或其衍生物,具体方法为将硝基还原假单胞菌(i^e^fowo"wCQl CGMCC No.3159接种于含有喹啉或其衍生物的污水中,在 28-32。C条件下培养36-72h,其中,所述硝基还原假单胞菌CQ1的接种量为 lxl07-lxl08cfu/mL。
4、 根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述污水中喹啉或其衍生物浓度 不超过700mg/L。
全文摘要
本发明公开了属于环境微生物领域的一株硝基还原假单胞菌及其应用。本发明的一株硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1来源于北京燕山石化公司污水处理系统中的氧化塘污水中,经过富集、分离和纯化而得到,该菌已于2009年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其简称为CGMCC,保藏号为CGMCC No.3159。本发明还公开了该菌在生物降解喹啉或其衍生物中的应用。本发明的菌株可降解喹啉或其衍生物的浓度达到700mg/L,处理72h后,降解率达到100%。此外,本发明菌株CQ1对硫酸卡那霉素、四环素和庆大霉素敏感,且不携带质粒。
文档编号C12N1/20GK101643716SQ20091008915
公开日2010年2月10日 申请日期2009年7月31日 优先权日2009年7月31日
发明者薇 张 申请人:华北电力大学
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