专利名称：抑癌基因编码蛋白序列及其融合表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是对DNA损伤敏感的抑癌基因的蛋白核心功能区 域及其融合表达载体。
背景技术：
肿瘤细胞的特征是基因组不稳定性(genomic instability)，DNA损伤修复异常和 细胞周期调控异常是造成基因组不稳定性的原因。肿瘤细胞的恶性转化是以锚定非依赖性 生长(anchor-independent growth)为特征。以基因组DNA为研究对象的微阵列比较基因组杂交(microarray-based comparative genomic hybridization, Array-CGH)技术是目前国际上发现肿瘤相关新基 因的强有力手段。Array-CGH技术将覆盖全基因组且已知顺序的DNA克隆做成微阵列，代 替传统CGH检测中将中期染色体作为杂交靶，大大提高了检测DNA拷贝数异常位点的分辨 率；再分别提取肿瘤组织和正常组织的基因组DNA，用cy3和cy5荧光染料分别标记肿瘤组 织和正常组织的DNA，进行杂交检测，在杂交系统中加入Cotl-DNA用于抑制基因组中重复 序列的干扰，并用自动化的扫描仪分析杂交靶上荧光信号的相对强弱，最后用自动化分析 软件进行定量分析。Array-CGH不仅使检测染色体异常的分辨率提高，而且还可以确定肿瘤 相关基因并提供精确的定位。对DNA损伤敏感的基因(FATS)，编码一个在进化上极其保守的蛋白，在多种癌细 胞中发生缺失及表达异常，是一个抑癌基因。
发明内容
本发明是为进一步研究FATS抑癌分子机制，以及为FATS在肿瘤基因治疗中的应 用，而提供一段抑癌基因编码蛋白序列及其融合表达载体。本发明通过比较基因组杂交技术(CGH)和以细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)为基础的DNA芯片技术，系统分析肿瘤基因组中DNA拷贝 数的异常变化，在DNA缺失区域确认一个命名为FATS(Eragile-site Associated lumor Suppressor)的基因。微阵列CGH分析结果表明FATS最大的编码外显子区在肿瘤基因组 中的缺失频率比下游外显子区高7倍，并以开放读码框架(open reading frame, 0RF)的形 式存在，并将其命名为mini-FATS，显示mini-FATS核酸序列是FATS基因发挥抑癌功能的关 键区域。ORF编码蛋白序列如下MISPVVISRLIDEKKSMENGAILPQAIAQPQLCPTKPALARRDGVSMHRRFALSPDRLGILTPSDDQGLETEPLSTGDNLGKGSHSGFSSITITARRVGPPASSLVWDTFRDPLCPKCKAKDALFQEPPVLAGDARLCQHNRPFTCTESPSNGSVEGMKVFQAHSRLSARQDYWVTHTNDNEDSFSSDNSPSRKVPLVFSSCVHFRVSQQ
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QLSIHIPGffSYR一段抑癌基因编码蛋白序列，其是由对DNA损伤敏感抑癌基因最大外显子区编码，蛋白产物具有体外和体内抗肿瘤活性，其编码蛋白见序列表1。所述抑癌基因编码蛋白序列，该序列由对DNA损伤敏感抑癌基因中的微型抑癌基 因区域编码，蛋白产物具有体外和体内抗肿瘤活性。所述抑癌基因编码蛋白序列，其具有的抗肿瘤活性包括抑制癌细胞体外生长，抑 制裸鼠移植瘤的生长。一种抑癌基因编码蛋白序列的融合表达载体，其是由微型对DNA损伤敏感抑癌基 因的核酸序列与PCDNA3载体连接而成，该融合表达载体转染肿瘤细胞后能抑制肿瘤细胞 的恶性转化和扩增。所述的抑癌基因编码蛋白序列的融合表达载体，该融合表达载体转染后，抑制 Hela癌细胞在裸鼠异体移植瘤模型中的生长。本发明通过脂质体将融合表达载体pcDNA3-FATS和空载体pcDNA3分别转入Hela 人宫颈癌细胞系中，通过新霉素压力筛选得到稳定细胞株，用MTT，软琼脂分析和裸鼠动物 实验方法检测mini-FATS的抗肿瘤活性。本发明提供了 FATS蛋白具有的体外(in vitro)和体内(in vivo)抗肿瘤功能， 为肿瘤基因治疗和模拟mini-FATS编码蛋白三维结构的抗癌化学药物设计提供了基础。
图1是微阵列CGH分析结果；图2是为融合表达载体pcDNA3-FATS的构建示意图；图3是MTT实验结果；图4是为软琼脂实验结果；图5是体内动物实验结果。
具体实施例方式下面结合附图及实施对本发明进行详细的说明。一 .实验材料来源小鼠模型用p53杂合子近交系C57BL/6小鼠建立。用Y -射线(4Gy)单剂量照射， 4-6月后收集胸腺淋巴瘤组织，提取基因组DNA。Hela细胞购自美国American Type Culture Collection (ATCC)。表达载体 pcDNA3、脂质体 Lipofactamine2000 和 G418 购自 Invitrogen 公司。3-(4,5)-dimethylthiahiazo(_z_yl)_3，5-di-phenytetrazoliumromide(MTT) i式 齐U购自Sigma公司。 果鼠购自Jackson Laboratory0二.实施方法1. Array-CGH 实验用覆盖小鼠全基因组的BAC文库DNA制备DNA芯片，每张玻璃芯片含19000个 微阵列BAC克隆。提取小鼠胸腺淋巴瘤组织DNA，以正常小鼠的基因组DNA作为对照， 分别用cy3和cy5荧光染料分别标记肿瘤组织和正常组织的DNA，进行杂交检测，在杂交系统中加入Cotl-DNA用于抑制基因组中重复序列的干扰，并用自动化的扫描仪ImaGene 4. O (BioDiscovery公司)分析杂交靶上荧光信号的相对强弱，最后用自动化分析软件 Excel-Macro进行定量分析。2.生物信息学分析通过比较基因组学分析，用美国国家国家卫生研究所网上提供的分析软件(// www.nebi. nlm. nih. gov)分析CGH结果，确定FATS新基因外显子分布和mRNA核酸序列，参 见序列表。图1中RP23-35I7和RP23-34H14为BAC克隆名称。3. pcDNA3-FATS融合表达载体构建融合表达载体pcDNA3-FATS其结构为环状，将mini-FATS双链核酸序列以平末端 正向连接到PCDNA3载体中CMV启动子下游，转化感受态大肠杆菌DH5 α，铺平板过夜培养， 挑取转化菌扩增培养提取质粒，酶切测序验证插入序列。mini-FATS双链核酸序列通过PCR 扩增得到，弓丨物序列为 5 ‘ -CTGGCATCACAGAACACAAGAATGA-3 '和 5 ‘ -CTACTCACCAGCCCTGTA ACTCCAG-3‘。用PCR仪GeneAmp 9700上进行PCR反应，反应体系为94°C预变性2min，94°C变 性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，循环30次。用琼脂糖凝胶电泳分析结果，参见图2， mini-FATS被置于CMV启动子下游，在末端含有翻译终止密码。4.融合表达载体转染人宫颈癌细胞株应用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒提取纯化质粒，用200 μ 1低渗液将2 μ g重 组质粒与4μ 1脂质体LipofactamindOOO混合，静置15分钟，加入细胞培养液中，5% CO2 温箱孵育。添加500 μ g/μ 1 G418压力筛选至非转染对照组细胞完全死亡，约20天，将表 达pcDNA3-FATS的单克隆挑出扩大培养。结果表明表达mini-FATS的Hela癌细胞生长速度，与对照组相比显著下降，锚 定非依赖性恶性生长特征基本消失，在免疫缺陷裸鼠体内的成瘤速率与对照组相比显著下 降，呈现体外(in vitro)和体内(invivo)抗肿瘤活性。5. MTT 实验接种细胞，用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞 接种到96孔板，每孔体积200ul。每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul，继续孵育4小 时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMS0，振荡10分钟，使结晶物充分 融解。利用酶标仪测定570nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。6.软琼脂实验这一培养法选择性地使已转化的细胞进行增殖，而抑制正常细胞的增殖。将含有 0.5%琼脂的培养基作为营养层铺在底部，然后再将含有细胞(Hela-pcDNA或Hela-FATS) 的少量软琼脂培养基(琼脂量约0.3% )倒在上面。14天后，正常细胞仍停留在接种时的 状态，几乎不进行增殖，但已转化的细胞则以半浮游状态增殖，而形成多细胞集落。参见图4，在软琼脂介质中转染pcDNA3的Hela细胞(Hela-pCDNA3)能形成多细胞 集落，但转染PCDNA3-FATS的Hela细胞(Hela-FATS)几乎没有多集落形成。统计结果基于 至少300个细胞(P < 0. 001)。7.裸鼠体内成瘤实验将5X IO6细胞(Hela-pcDNA或Hela-FATS)接种于免疫缺陷裸鼠皮下，测量肿瘤体积大小。SEQUENCE LISTING<110>天津医科大学附属肿瘤医院<120>抑癌基因编码蛋白序列及其融合表达载体<130>1<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>362<212>PRT<213>2 Ambystoma laterale χ Ambystoma jeffersonianum<220><221>protein<222>(1). . (362)<223><400>1Met lie Ser Pro Val Val lie Ser Arg Leu lie Asp Glu Lys Lys Ser151015Met Glu Asn Gly Ala lie Leu Pro Gln Ala lie Ala Gln Pro Gln Leu202530Cys Pro Thr Lys Pro Ala Leu Ala Arg Arg Asp Gly Val Ser Met His354045Arg Arg Phe Ala Leu Ser Pro Asp Arg Leu Gly lie Leu Thr Pro Ser505560Asp Asp Gln Gly Leu Glu Thr Glu Pro Leu Ser Thr Gly Asp Asn Leu65707580Gly Lys Gly Ser His Ser Gly Phe Ser Ser lie Thr lie Thr Ala Arg859095Arg Val Gly Pro Pro Ala Ser Ser Leu Val Trp Asp Thr Phe Arg Asp100105110Pro Leu Cys Pro Lys Cys Lys Ala Lys Asp Ala Leu Phe Gln Glu Pro115120125Pro Val Leu Ala Gly Asp Ala His Leu Cys Gln His Asn Arg Pro Phe130135140Thr Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asn Gly Ser Val Glu Gly Met Lys Val145150155160Phe Gln Ala His Ser Arg Leu Ser Ala Arg Gln Asp Tyr Trp Val Thr165170175His Thr Asn Asp Asn Glu Asp Ser Phe Ser Ser Asp Asn Ser Pro Ser
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权利要求
一段抑癌基因编码蛋白序列，其特征在于由对DNA损伤敏感抑癌基因最大外显子区编码，蛋白产物具有体外和体内抗肿瘤活性，其编码蛋白见序列表1。
2.根据权利要求1所述抑癌基因编码蛋白序列，其特征在于该序列由对DNA损伤敏感 抑癌基因中的微型抑癌基因区域编码，蛋白产物具有体外和体内抗肿瘤活性。
3.根据权利要求1或2所述抑癌基因编码蛋白序列，其特征在于具有的抗肿瘤活性包 括抑制癌细胞体外生长，抑制裸鼠移植瘤的生长。
4.一种如权利要求1所述抑癌基因编码蛋白序列的融合表达载体，其特征在于该融合 表达载体是由微型对DNA损伤敏感抑癌基因的核酸序列与pcDNA3载体连接而成，该融合表 达载体转染肿瘤细胞后能抑制肿瘤细胞的恶性转化和扩增。
5.根据权利要求3所述的抑癌基因编码蛋白序列的融合表达载体，其特征在于该融合 表达载体转染后，抑制Hela癌细胞在裸鼠异体移植瘤模型中的生长。
全文摘要
本发明公开了一段抑癌基因编码蛋白序列及其融合表达载体，属于生物技术领域。基于对DNA损伤敏感抑癌基因(mini-FATS)中的微型抑癌基因区域编码的氨基酸顺序进化上保守，利用mini-FATS与pcDNA3载体连接构建pcDNA3-FATS表达载体，将pcDNA3-FATS转染HeLa癌细胞后能显著抑制Hela癌细胞的体外生长和恶性转化，并抑制HeLa癌细胞在裸鼠异体移植瘤模型中的生长。本发明提供了FATS蛋白具有的体外和体内抗肿瘤功能，为肿瘤基因治疗和模拟mini-FATS编码蛋白三维结构的抗癌化学药物设计提供了基础。
文档编号C12N15/85GK101798343SQ200910067828
公开日2010年8月11日 申请日期2009年2月6日 优先权日2009年2月6日
发明者李政 申请人:天津医科大学附属肿瘤医院