专利名称：草鱼出血病疫苗蛋白表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白表达载体，尤其涉及一种用基因重组技术构建的疫苗蛋白表 达载体及其构建方法。
背景技术：
基于昆虫细胞的杆状病毒表达系统表达外源基因有很多优点表达量高，可以 表达高分子量的蛋白质，可以同时表达多个基因等等。然而昆虫细胞和哺乳动物细胞的 蛋白合成后修饰加工存在差异，许多在昆虫细胞中表达的哺乳动物细胞蛋白质没有足够 的活性(Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology，2005，23 : 567-575)。自1995年起，重组杆状病毒被发现可以携带外源基因进入多种哺乳动物细胞 (Sarkis C,Serguera C,Petres S,et al. Efficient transduction of neural cells in vitro and in vivo by a baculovirus-derived vector. Proceedings of the National Academy of Sciences USA，2000，97 :14638-14643)。不管是体内还是体外，疱疹性 口腔炎 病毒糖蛋白(VSV G)被发现都可以增强杆状病毒转导外源基因在很多哺乳动物细胞中表 达的水平(Mangor J. T.，Monsma S. A.，Johnson Μ. C.，Blissard G. W.，2001. A GP64_null baculovirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus G protein. Journal of Virology, 75 :2544_2556 ；Tani H.，Limn C. K.，Yap C. C.，Onishi Μ.，Nozaki Μ.，Nishimune Y.，Okahashi N.，Kitagawa Y.，Watanabe R.，Mochizuki R.，Moriishi K.，Atsuura Y.， 2003.In vitro and in vivo gene delivery by recombinant baculoviruses. Journal of Virology，77 :9799-9808)。由于杆状病毒具有低毒性和在哺乳动物细胞中不复制的 特点，携带VSV G的杆状病毒作为基因导入载体的研究已成为基因工程领域的一个研究热 点。在已有的杆状病毒载体的研究工作中，外源基因都是被哺乳动物特异性的启动子介导 表达的，目标蛋白质在繁殖病毒的昆虫细胞中并不表达(Aoki H，Sakoda Y，Jukuroki K， et al. Induction of antibodies in mice by a recombinant baculovirus expressing pseudorabies virus glycoprotein B in mammalian cells. Veterinary Microbiology, 1999,68 :197_207 ；Facciabene A，Aurisicchio L，Monica NL. Baculovirus vectors elicit antigen-specific immune responses in mice. Journal of Virology，2004，78 : 8663-8672)。选取一个能在无脊椎动物和脊椎动物细胞中都有活性的启动子构建重组杆状 病毒，则会使在昆虫细胞中和哺乳动物细胞中同时表达与分析外源蛋白成为可能。已有的 研究结果表明，对虾白斑病毒极早期基因iel的启动子在无脊椎动物对虾和昆虫细胞中有 表达活性(Liu W, Chang YiWang C, et al. Microarray and RT-PCR screening for white spot syndrome virus immediate-early genes in cycloheximi de-treated shrimp. Virology，2005，334 :327_341 ；Lu L，Wang H，Manopo I，et al. Baculovirus-mediated promoter assay and transcriptional analysis of white spot syndrome virus orf427 gene. Virology Journal，2005，2 (71))。
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草鱼出血病，是草鱼鱼种培育阶段一种广泛流行、危害大的病毒性鱼病。流行季节 长，发病率和死亡率均很高，往往造成大批草鱼鱼种死亡。草鱼出血病一般用草鱼出血病组 织浆灭活获得疫苗，或者用草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗。用上述方法获得的疫苗纯度低， 周期长。用基因工程方法获得防治草鱼出血病疫苗蛋白可以解决上述问题。目前还没有草 鱼出血病疫苗蛋白表达载体构建的报道。
发明内容
本发明提供了一种草鱼出血病疫苗蛋白表达载体，及其构建方法。实现本发明的技术方案如下提供一种草鱼出血病疫苗蛋白表达载体，包括以下部分(I)AcMNPV多角体启动子控制的VSV G表达阅读框；(2)白斑病毒iel启动子控制的VP7表达阅读框。所述的表达载体，由上述的两个部分，同时用基因克隆的办法，插入PFastBacl穿 梭载体中构成。本发明还提供一种整合有如上所述的表达载体的重组杆状病毒，该病毒是 vAc-G-Vp7,由上述的表达载体，通过在宿主菌DH10BAC 中定点转座的办法，整合进杆状病 毒基因组得到。本发明还提供一咱草鱼出血病疫苗蛋白表达载体的构建方法，包括如下步骤DVSV G阅读框的克隆A :pFastBacl中的多角体启动子首先用SnaB I和Sal I切除；B 用PCR的方法从Bacmid基因组中扩增得到多角体启动子，所用两条引物分别 是Pl :5’ -TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG-3’P2 :5’ -CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC-3，；C 将B步骤得到的多角体启动子用Smal和Sal 1双酶切，克隆进pFastBacl载体 的SnaB 1和Sal 1位点中，得到含新的多角体启动子的pFastBacl载体；D 用PCR的方法从pVSV-G载体中扩增，得到VSV G cDNA及其末端的β -globin 终止子，所用两条引物分别是Sl :5’ -CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC-3’S2 :5， -CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA-3，；E 将D步骤中用PCR方法扩增出来的VSV G片段用SnaB I和Sal I进行双酶切， 回收后的片段直接插入含新多角体启动子的pFastBacl载体；对转化平皿上的菌落用PCR 的方法进行阳性克隆筛选。2)VP7阅读框的克隆A 自对虾白斑综合症病毒基因组iel基因的启动子区扩增iel启动子；扩增引物 两端设计限制性内切酶位点SnaB I和Sal I，插入到pFastBacl载体的Stu I和Sal I位 占中.
/… I B :Vp7基因用RT-PCR的办法扩增自草鱼出血病病毒标准株873株的基因组，所用 引物为
Vl 5' -ATAAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA-3'V2 5' -CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGGCTCCAC-3'；然后插入到含有iel启动子序列的pFastBacl载体中，插入位点是Xba 1和Not 1。本发明构建了携带受杆状病毒多角体启动子控制的VSV G和受白斑病毒iel启动 子控制的vp7两个表达阅读框的新型重组病毒，成功实现了其在SF9和草鱼CIK细胞上的 高效表达。本发明构建的杆状病毒表达载体在外膜上同时展示有VSV G糖蛋白；对虾白斑 病毒iel启动子在该载体的介导下，可以在所有测试的无脊椎动物或脊椎动物细胞系中高 效表达外源基因。本研究为该蛋白用作防治草鱼出血病的疫苗奠定了基础。
图1 :vAc-G-VP7质粒载体构建图谱；图2 重组杆状病毒vAc-G_VP7在Sf9细胞和CIK细胞中表达VP7的情况。
具体实施例方式应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人 员常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或依据 BAc-To-BAc系统使用手册(Irwitrogen)，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例中，所涉及的主要材料来源和常规方法如下1. 1 细胞无脊椎动物Sf9细胞系(国家水生动物病原库提供)培养在27度的无血清培养 基SF-900II (Invitrogen)中。草鱼CIK细胞(国家水生动物病原库提供)。1. 2病毒的感染，滴度测定和转导实验用杆状病毒感染Sf9细胞及杆状病毒的滴度测定按照以前报道的方法进行 (Lu L，Du Q，Chejanovsky N. Reduced expression of the immediate-early protein IEO enables efficient replication of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus in poorly permissive Spodoptera littoralis cells. Journal of Virology，2003，77 :535_545)。细胞上清液中的病毒通过超速离心进行浓 缩，病毒悬液的浓度用PBS调整到每毫升IOici空斑形成单位(PFU/ml)。杆状病毒转导脊 椎动物细胞系根据已报道的办法进行(Hsu C，Ho Y，Wang K，et al. Investigation of optimal transduction conditions for baculovirus-mediated gene delivery into mammalian cells.Biotechnology and bioengineering 2004,88 :42_51 ；Lu L，Ho YiKwang J.Suppression of porcine arterivirus replication by baculovirus-delivered shRNA targeting nucleoprotein. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006,340 :1178-1183)，并略有改动病毒转导过程中用D-PBS作缓冲液，转导在25度培养 箱中持续4小时，然后去掉上清，添加完全DMEM培养基，将细胞置于二氧化碳培养箱继续正 常培养。1. 3免疫印迹反应蛋白电泳，蛋白质转膜及抗体结合与显色反应都依据报道过的标准方法进
5行(Lu L, Du Q, Chejanovsky N.Reduced expression of the immediate-early protein IEO enables efficient replication of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus in poorly permissive Spodoptera littoralis cells.Journal of Virology, 2003, 77 =535-545) 0相当于1 X IO6的细胞总蛋白样品被用于本实验的蛋白 质分析。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例一质粒构建依据BAc-To-BAc系统使用手册(Invitrogen)，AcMNPV多角体启动子控制的VSV G表达阅读框，和白斑病毒iel启动子控制的VP7表达阅读框，同时用基因克隆的办法插入 pFastBacl穿梭载体(Invitrogen)中；这两个阅读框通过在宿主菌DH10BAC (Invitrogen) 中定点转座的办法，整合进杆状病毒基因组，得到重组病毒vAc-G-VP7。VSV G cDNA及其末端的β -globin终止子是用PCR的方法从pVSV-G(Clontech)载 体中扩增而来，两条引物分别是(Si) 5，CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC3，和(S2) 5，C CCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA3，。多角体启动子是用 PCR 的方法从 Bacmid (Invitrogen) 基因组中扩增而来，两条引物分别是(P 1) 5，TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG3，和 (P2) 5，CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC3，。Vp7 基因用 RT-PCR 的办法扩增自草鱼出血 病病毒标准株873株(中国典型培养物保藏中心提供)的基因组，所用引物为(V1)5' AT AAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA3‘和(V2)5‘ CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGG CTCCAC3'。引物在插入两个阅读框前，pFastBacl中的多角体启动子首先用SnaBl和Sail 切除。具体构建步骤如下DVSV G阅读框的克隆A :pFastBacl中的多角体启动子首先用SnaB I和SalI切除；B 用PCR的方法从Bacmid基因组中扩增得到多角体启动子，所用两条引物分别 是Pl 5' TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG3’P2 :5’ CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC3’ ；C 将B步骤得到的多角体启动子用Smal和Sal 1双酶切，克隆进pFastBacl载体 的SnaB 1和Sal 1位点中，得到含新的多角体启动子的pFastBacl载体；D 用PCR的方法从pVSV-G载体中扩增，得到VSV G cDNA及其末端的β -globin 终止子，所用两条引物分别是Sl :5’ CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC3，S2 :5， CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA3，；E 将D步骤中用PCR方法扩增出来的VSV G片段用SnaB I和Sal I进行双酶切， 回收后的片段直接插入含新多角体启动子的pFastBacl载体；对转化平皿上的菌落用PCR 的方法进行阳性克隆筛选。2)VP7阅读框的克隆A 自对虾白斑综合症病毒基因组iel基因的启动子区扩增iel启动子；扩增引物 两端设计限制性内切酶位点SnaB I和Sal I，插入到pFastBacl载体的Stu I和Sal I位 占中.
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B :Vp7基因用RT-PCR的办法扩增自草鱼出血病病毒标准株873株的基因组，所用 引物为Vl 5' ATAAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA3'V2 5' CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGGCTCCAC3'；然后插入到含有iel启动子序列的pFastBacl载体中，插入位点是Xba 1和Not 1。构建质粒载体图谱见图1。实施例二 重组杆状病毒的构建根据Invitrogen公司Bac-to-bac表达系统的使用手册构建重组杆状病毒。转化 所构建的重组质粒进DHlOBac (Invitrogen)感受态宿主菌，利用该质粒能够自主转座的特 性，VSV G和VP7两个阅读框可以通过转座进入宿主菌中的杆状病毒基因组质粒上。提取 发生转座的杆状病毒基因组质粒，用脂质体转导的方法转入昆虫SF9细胞系，即可得到重 组杆状病毒vAc-G-VP7。为了增强杆状病毒转导外源基因进入脊椎动物细胞的能力，在杆状病毒载体中 插入了多角体启动子控制下的VSV G表达阅读框，VSV G将会被展示在病毒粒子的外膜 上(Tani H. , Limn C. K. , Yap C. C. , Onishi Μ. , Nozaki Μ. , Nishimune Y. , Okahashi N., Kitagawa Y. , Watanabe R. ,Mochizuki R. , Moriishi K. ,Atsuura Y. ,2003. In vitro and in vivo gene delivery by recombinant baculoviruses. Journal of Virology,77 9799-9808)。在此基础上，一个由iel启动子控制的VP7表达阅读框被同时整合到含有VSV G表达框的病毒基因组中得到重组病毒vAc-G-VP7。实施例三新型杆状病毒表达载体介导草鱼出血病病毒vp7蛋白在SF9和CIK细 胞中的表达。为了检测重组病毒vAc-G-Vp7表达目的蛋白vp7的能力，实验中用vAC-G-vp7感 染昆虫Sf9细胞，感染复数(multiplicity of infection)为25 ；同时，用vAc-G_VP7转导 CIK细胞，感染复数为250。24小时后，收获vAc-G-VP7感染或转导的细胞，用抗VP7的单抗 通过免疫印迹反应检测VP7的表达情况(见图2)。附图2中M例为Marker ；Cl列，表示重组病毒转导CIK细胞，病毒感染复数为25 的表达情况；Sl列，表示重组病毒感染昆虫Sf9，感染复数为25的表达情况；C2列，表示重 组病毒转导CIK细胞，病毒感染复数为250的表达情况；S2列，表示重组病毒感染昆虫Sf9， 感染复数为250的表达情况。本发明同时以草鱼出血病病毒外膜蛋白vp7为目的蛋白，成功实现了其在SF9和 草鱼CIK细胞上的表达，为该蛋白用作防治草鱼出血病的疫苗奠定了基础。序列表<110>上海海洋大学<120>草鱼出血病疫苗蛋白表达载体及其构建方法<160>6<210>1<211>32<212>DNA
<213>人工序列<220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用来从pVSV-G载体中扩 增 VSV G cDNA及其末端的β -globin终止子的引物；命名为Si。<400>1cgcggatcca tgaagtgcct tttgtactta gc 32<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用来从pVSV-G载体中扩 增 VSV GcDNA及其末端的β -globin终止子的引物；命名为S2。<400>2cccaagcttc caacacacta ttgcaatgaa 30<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用来从Bacmid基因组中 扩增多角体启动子的引物，命名为P1。<400>3tcccccgggg gatggt tggc tacgtatact ccg 33<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用来从Bacmid基因组中 扩增多角体启动子的引物，命名为P2。<400>4cgcggatccg gtttcggacc gagatccgc 29<210>5<211>41
<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用RT-PCR的办法扩增草 鱼出血病病毒标准株873株的Vp7基因的引物，命名为VI。<400>5ataagaatgc ggccggtaat gccacttcac atgattccgc a 41<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用RT-PCR的办法扩增草 鱼出血病病毒标准株873株的Vp7基因的引物，命名为V2。<400>6ctagtctaga cgcattaatc ggatggctcc ac 32
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权利要求
一种草鱼出血病疫苗蛋白表达载体，其特征在于，包括以下部分(1)AcMNPV多角体启动子控制的VSV G表达阅读框；(2)白斑病毒ie1启动子控制的VP7表达阅读框。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，该载体是由权利要求1所述的两个部 分，同时用基因克隆的办法，插入PFastBacl穿梭载体中构成。
3.一种整合有如权利要求1所述的表达载体的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒是 vAc-G-Vp7,由权利要求2所述的表达载体，通过在宿主菌DH10BAC 中定点转座的办法，整 合进杆状病毒基因组得到。
4.一种草鱼出血病疫苗蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 DVSV G阅读框的克隆A :pFastBacl中的多角体启动子首先用SnaB I和Sal I切除； B 用PCR的方法从Bacmid基因组中扩增得到多角体启动子，所用两条引物分别是 Pl 5' -TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG-3' P2 5' -CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC-3’ ；C 将B步骤得到的多角体启动子用Smal和Sal 1双酶切，克隆进pFastBacl载体的 SnaB 1和Sal 1位点中，得到含新的多角体启动子的pFastBacl载体；D 用PCR的方法从pVSV-G载体中扩增，得到VSV G cDNA及其末端的β -globin终止 子，所用两条引物分别是515' -CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC-3'52:5’ -CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA-3’ ；E 将D步骤中用PCR方法扩增出来的VSV G片段用SnaB I和Sal I进行双酶切，回收 后的片段直接插入含新多角体启动子的pFastBacl载体； 对转化平皿上的菌落用PCR的方法进行阳性克隆筛选。 2)VP7阅读框的克隆A 自对虾白斑综合症病毒基因组iel基因的启动子区扩增iel启动子；扩增引物两端 设计限制性内切酶位点SnaB I和Sal I，插入到pFastBacl载体的Stu I和Sal I位点中； B :Vp7基因用RT-PCR的办法扩增自草鱼出血病病毒标准株873株的基因组，所用引物为Vl 5' -ATAAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA-3‘ V2 5' -CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGGCTCCAC-3'；然后插入到含有iel启动子序列的pFastBacl载体中，插入位点是Xba 1和Not 1。
全文摘要
本发明公开了一种草鱼出血病疫苗蛋白表达载体及其构建方法。本发明将AcMNPV多角体启动子控制的VSV G表达阅读框，和白斑病毒ie1启动子控制的草鱼出血病疫苗蛋白VP7表达阅读框，同时用基因克隆的办法插入pFastBac1穿梭载体中，获得了VP7杆状病毒表达载体；将这两个阅读框通过在宿主菌DH10BACTM中定点转座的办法整合进杆状病毒基因组得到重组病毒vAc-G-VP7。本发明构建的表达载体可以实现同时在不同种类细胞系中有效表达外源目的基因vp7，可用于草鱼出血病疫苗蛋白表达载体的构建与疫苗活性蛋白的前期免疫活性分析。
文档编号C12N15/66GK101974563SQ201010264188
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月24日 优先权日2010年8月24日
发明者吕利群, 李家乐, 王浩 申请人:上海海洋大学