一种重组藻蓝胆素的制备方法及其应用的制作方法

专利名称：一种重组藻蓝胆素的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和食品医药领域，具体地说是一种重组藻蓝胆素的制备方法 及其应用。
背景技术：
藻蓝胆素(Phycocyanobilin，PCB)是存在于红藻及蓝藻中的一种光合作用辅助 色素。与胆红素类似，是由4个吡咯环通过甲烯基呈直链连接，分子量约为588.69g/mol。 它们在体内与可溶性蛋白质结合称为藻蓝蛋白(phycocyanin)或别藻蓝蛋白，溶于稀盐溶 液中。它们在光合作用中起吸收及传递光能的作用。作为胆红素的衍生物，藻蓝胆素目前已被证明具有抗氧化(Hirata，Τ.， Tanaka, Μ.，Ooike，Μ.，Tsunomura，Τ.，and Sakaguchi, Μ. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared from Spirulina ρlatensis J Appl Phycol 12，2000， 435-439.)、清除羟自由基以及氧自由基、保护生物膜免受氧化伤害(Hirata，Τ.，Tmiaka， Μ.，Ooike, Μ.，Tsunomura，Τ.，and Sakaguchi, Μ. Radical scavenging activities of phycocyanobilin prepared from a cyanobacterium， Spirulina platensis， Fisheries Sci 1999,65,971-974.) ^ 以及消炎(Bhat，V. B.，and Madyastha，K. Μ. Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobilin from Spirulina platensis protection against oxidative damage to DNA, Biochem Biophys Res Commun 2001，285，262-266.)等多种功效。最新研究证据发现，藻蓝胆素在细胞内可以被血 红素还原酶还原而转化为胆红素，进而反馈抑制由氧化损伤引起的NADPH氧化酶的 过量表达，对于糖尿病、Gilbert综合症等由氧化损伤引起的疾病起到很好的疗效 (McCarty，Μ. F.，Barroso-Aranda, J.，and Contreras，F.NADPH oxidase mediates glucolipotoxicity-induced beta cell dysfunction—clinical implications， Med Hypotheses 2010，74，596—600 ；McCarty, Μ. F.，Barroso—Aranda，J.，and Contreras， F. Oral phycocyanobilin may diminish the pathogenicity of activated brain microglia in neurodegenerative disorders，Med Hypotheses 2010，74，601-605.) 0 美 国食品医药局(FDA)已批准将藻蓝蛋白(藻蓝胆素与脱辅基蛋白结合在一起)用于皮肤 癌、乳腺癌的光敏治疗(范晓，海藻化学研究的展望，海洋科学，1996，(2) :24)。同时藻 蓝蛋白用于动脉粥样硬化的光敏治疗也已申请专利(US4886831)。同时藻蓝胆素可以作 为荧光探针及天然色素，在生物检测以及功能食品制备方面具有广阔的用途(Wu，S. H.， McDoweΙΙ,Μ. Τ. ,and Lagarias, J. C. Phycocyanobilin is the natural precursor of the phytochrome chromophore in the green alga Mesotaenium caldariorum, J Biol Chem 1997，272，25700-25705.)。现有的藻蓝胆素的提取技术主要是从螺旋藻中天然提取。它包括一系列长周期、 高成本、复杂的工艺过程。主要包括藻细胞的培养、离心收集，藻体的破碎和藻蓝胆素的抽 提、精制等。其中藻蓝胆素的分离纯化方法主要有热甲醇裂解法和甲醇两步抽提法。热甲醇裂解法是利用热甲醇(70-75°C )缓慢打开藻蓝胆素和脱辅基蛋白之间的硫醚键，从而 抽提得到2/3左右的自由藻蓝胆素。但由于螺旋藻中还含有叶绿素和类胡萝卜素等多种色 素，这种方法往往只能得到纯度不高的藻蓝胆素。而甲醇两步抽提法是先用冷乙醇抽提，去 除大部分的叶绿素和类胡萝卜素，此时藻蓝胆素不溶于冷乙醇，然后再用热甲醇抽提，这样 可以获得纯度较高(80%左右)的藻蓝胆素(0' Carra, P.，Murphy, R. F.，and Killilea， S. D. The native forms of the phycobilin chromophores of algal biliproteins.A clarification, Biochem J 1980，187，303-309.)。更高纯度的藻蓝胆素需要进一步的薄层 层析或制备性高效液相色谱纯化方可得到。尽管藻蓝胆素在螺旋藻中含量丰富(约占藻体干重的左右)，螺旋藻大规模 培养技术也已比较成熟，但由于螺旋藻培养周期较长，生长密度较低，需要占用大面积土 地，且高纯度自由藻蓝胆素的天然提取工艺较复杂(McCarty，M. F. Clinical potential of Spirulina as a source of phycocyanobilin, J Med Food 2007,10,566-570.),导致市 场上高纯度藻蓝胆素价格较高(作为光敏剂高纯度藻蓝胆素的价格约为150-180美元/毫 克)，目前主要依赖于从美国进口，尚不适合作为医疗保健品广泛应用。因此开发工艺简单、 成本低廉的藻蓝胆素规模制备技术，将为藻蓝胆素作为高效抗氧化剂和食用色素的广泛应 用奠定基础。

发明内容
本发明目的在于提供一种简便、快速、低成本的重组藻蓝胆素制备方法，及其在抗 氧化药物及功能食品等方面的应用。为了实现上述目的，本发明提供一种重组藻蓝胆素制备方法，包括如下步骤由藻类中克隆出血红素氧化酶基因hoi和铁氧还蛋白氧化还原酶基因pcyA，将上 述hoi基因和pcyA基因(藻蓝胆素合成关键酶基因)克隆到表达载体上，而后导入大肠杆 菌中进行异源表达，生产重组藻蓝胆素。上述方法中还进一步包括以下步骤将转化后的大肠杆菌破碎、氯仿萃取和凝胶 过滤层析，获得所述的重组藻蓝胆素。所述藻类选自蓝藻(Cyanobacteria)、红藻(Rhodophyta)、隐藻(Cryptomonas)、 甲藻(Pyrrophyta)或原绿球藻(Prochloroccus marinus)，优先选自集胞藻 (Synechocystis)、聚球藻(Synechococcus)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtiii)或 嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongates)。所述的血红素氧化酶基因hoi优选自Genebank中编号为sllll84、syc2236_c、 SYNW0171、CHLREDRAFT_152591或tll0365的hoi基因；所述铁氧还蛋白氧化还原酶基因 pcyA 优选自 Genebank 中编号为 slr0116、syc0325_d、SYNW1084、CHLREDRAFT_156256 或 tll2308 的 pcyA 基因。所述的表达载体为普通大肠杆菌表达载体，优选自pETDuet-1、pET28a_l、 pCDFDuet-1 或 pACYCDuet-1。所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。本发明还进一步提供上述方法制备的重组藻蓝胆素在药物或食品中的应用，优选 用于抗氧化药物或抗氧化食品。
本发明具有如下优点1.本发明为运用基因工程技术，将藻蓝胆素合成关键酶基因转入大肠杆菌表达体 系中，以大肠杆菌自身血红素为底物，通过两步酶促催化反应生产藻蓝胆素。这一生产过程 避免了藻类养殖这一长周期过程，同时大肠杆菌易于实现高密度规模培养，从而大大降低 生产成本。2.与藻类相比，大肠杆菌细胞容易破碎，且不含有叶绿素、类胡萝卜素等其他光合 色素，使得下游纯化过程变得更加简单，容易获得低成本、高纯度的藻蓝胆素。3.本发明直接表达藻蓝胆素色基，不含有脱辅基藻蓝蛋白，因此不涉及色基与蛋 白间硫醚键的断裂问题，所以更容易获得结构单一、性质稳定的藻蓝胆素，可以建立统一质 量标准，适于大规模制备及应用。4、本发明所优选的表达载体 pETDuet-l、pET28a-l、pCDFDuet_l 或 pACYCDuet-Ι 能 够促使血红素氧化酶基因hoi和铁氧还蛋白氧化还原酶基因pcyA在大肠杆菌中高效表达。5、构建的重组载体在大肠杆菌BL21尤其能够高质量表达，所生产的藻蓝胆素质 量不逊色于野生藻类的藻蓝胆素。6、来源于集胞藻、聚球藻、莱茵衣藻或嗜热蓝藻的血红素氧化酶基因hoi和铁氧 还蛋白氧化还原酶基因PcyA在大肠杆菌BL21中表现出高表达量，更适合在大肠杆菌中表 达。


图1为本发明表达藻蓝胆素重组载体pETDuet-hol-pcyA的构建图。图2为本发明表达藻蓝胆素重组载体pET28a-h0l-pCyA的构建图。图3为本发明表达藻蓝胆素重组载体pCDFDuet-hol-pcyA的构建图。图4为本发明表达藻蓝胆素重组载体pACY⑶uet-hol-pcyA的构建图。图5为本发明藻蓝胆素抗氧化效果图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例进一步描述本发明，但并不限制本发明的保护范围。重组藻蓝胆素的制备方法由藻类中克隆出藻蓝胆素合成关键酶基因(血红素氧 化酶基因hoi和铁氧还蛋白氧化还原酶基因pcyA)，将hoi和pcyA基因克隆到适当表达载 体上，而后将重组表达载体导入大肠杆菌中进行异源表达，大肠杆菌以自身血红素为底物， 通过Hol和PcyA两步酶促催化反应，生产重组藻蓝胆素。最终经菌体破碎、氯仿萃取和凝 胶过滤层析，获得蓝色洗脱液，即得以上所述的重组藻蓝胆素。所述重组藻蓝胆素为蓝色化 合物，溶于稀盐溶液，分子量约为588.69g/mol。该重组藻蓝胆素可以直接用作药物、试剂、 食品添加剂、保健或功能食品有效成分等。其中所述藻类可为蓝藻、绿藻、红藻、隐藻、甲藻或原绿球藻，优选为集胞藻(所 述hoi和pcyA基因分别为S111184和slr0116)、聚球藻(所述hoi和pcyA基因分别为 syc2236_c 和 syc0325_d)、莱茵衣藻(所述 hoi 和 pcyA 基因分别为 CHLREDRAFT_152591 和 CHLREDRAFT_156256)或嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus，所述 hoi 禾口 pcyA 基 因分别为 tll0365 和 tll2308)。
各种载体选自大肠杆菌(E.coli)的 pETDuet-1、pET28a_l、pCDFDuet-1 或 pACYCDuet-1等载体系列。特别应指出的是在下列实施例中，使用的DNA提取、PCR扩增反应、表达载体构建 和转化、大肠杆菌的培养、溶剂萃取及色谱纯化以及抗氧化性分析等技术除特别说明外均 是本领域普通技术人员所熟知的，并可在诸如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄 培堂等译，科学出版社，2002年第三版)、《精编分子生物学实验指南》(F. M.奥斯伯，R.E.金 斯顿等著，马学军等译，科学出版社，2005年版)、《溶剂萃取手册》(汪家鼎，陈家镛等著，化 学工业出片反社，2001 年片反)、Improved DPPH determination for antioxidant activity spectrophotometric assay, Chemical Papers，2007，60 (3) :214_216.等参考文献中找到， 在这里整体引用。实施例1(1)集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803全基因组已经测序完成，可从 Genebank免费获得(Genebank编号为BA000022)。根据Genebank中公布的集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)血红素氧化酶基因(hoi)和铁氧还蛋白氧化还原酶基 因(pcyA)的基因序列，设计适当引物，以集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)基因 组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA。藻蓝胆素合 成关键酶基因hoi和pcyA在Genebank中的编号分别为sllll84和slr0116。(2)应用基因工程方法，在hoi基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点，并插 入到pETDuet-Ι质粒(购自Novagen，Germany)的第一个多克隆位点处(BamH I和Sac I 酶切位点，下文用相同表述方式表达)，得到重组载体pETDuet-hol。在基因pcyA两端分别 加上Nde I和Xho I酶切位点，并克隆到pETDuet-hol的另一个多克隆位点处，得到重组载 体pETDuet-h0l-pCyA(如附图1所示)。具体操作方法如下根据Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列设计引物。hoi的正向引物Pl 5，-TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2 :5，-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGG TGGCGAG-3，。pcyA 的正向引物 P3 5，-TTCATATGATGGCCGTCACTGATTTAAGTTTGACC-3，，反向弓I 物 P4 :5’-TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAGAC-3’。以 Synechocystis sp. PCC 6803 基因 组DNA作为PCR反应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试 剂盒(Omega公司)纯化。将所得hoi和pcyA基因片段与pETDuet-Ι载体分别用相应适当 的核酸内切酶37°C消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体 3 1混合，在T4DNA连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5ci。利用含 100ug/ml氨苄青霉素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重 组表达载体pETDuet-hol-pcyA。用碱变性法提取出构建好的表达质粒pETDuet-hol-pcyA， 转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)(索莱宝科技有限公司，下同)，得到能在T7启动子驱动下 高效表达活性藻蓝胆素的大肠杆菌菌株P1。上述质粒提取、连接、转化以及阳性重组子的筛 选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002 年第三版)介绍的方法。(3)从LB固体(含1. 5%琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株Pl单菌 落于5mL含lOOug/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度 37°C，转速200r/min左右)。将过夜培养物以1 100的比例接种于IL的TB培养基(含氨苄青霉素lOOug/mL)中。在恒温振荡培养箱中以温度37°C、转速200r/min的培养条件下 培养至OD600 = 0 . 5 0. 7时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-th iogalactopyranoside)至终浓度为0. 5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30°C、转 速200r/min的培养条件继续培养24h后停止。将收获的菌液在10，OOOg条件下离心lOmin，弃上清液。收集的菌体用IXPBS缓 冲液(常用生物试验试剂)洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积预冷的 IXPBS缓冲液中。超声波破碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计30min，破碎过程 中保持细胞低温(0°C )。破碎后于4°C以12，OOOg离心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纤维 素膜过滤后，加入等体积的氯仿，颠倒均勻lh。在IOOOOg离心30min，小心吸取富含藻蓝胆 素的蓝色沉淀。将沉淀用DMSO(二甲基亚砜，下同)重新溶解。不溶物经IOOOOg离心IOmin 除去。将上述处理获得的蓝色溶液，上样到预先用PBS缓冲液平衡过的Desalting column (GE healthcare, Sweden)，上样体积不超过柱体积的1/3，流速为2mL/min ；然后接 着用PBS缓冲液洗去杂蛋白，最后藻蓝胆素用20 %乙醇溶液洗脱下来。洗脱时同时监测A28tl 和A369，收集洗脱峰，从而得到纯度较高的藻蓝胆素。实施例2(1)集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803全基因组已经测序完成，可从 Genebank免费获得(Genebank编号为BA000022)。根据Genebank中公布的集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)血红素氧化酶基因(hoi)和铁氧还蛋白氧化还原酶基 因(pcyA)的基因序列，设计适当引物，以集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)基因 组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA。藻蓝胆素合 成关键酶基因hoi和pcyA在Genebank中的编号分别为sllll84和slr0116。(2)应用基因工程方法，在hoi基因两端分别加上Nde I和EcoR V酶切位点，并插 入到pET28a-l质粒(Novagen，Germany)的多克隆位点处，得到重组载体pET28a_hol。在 基因pcyA两端分别加上EcoR V和Xho I酶切位点，并克隆到pET28a-hol的下游位点处， 得到重组载体pET28a-h0l-pCyA(如附图2所示)。具体操作方法如下根据Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列设计引物。hoi的正向引物Pl 5，-TACATATGTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2 :5，-TTGATATCCTAGCCTTCGGAGG TGGCGAG-3，。pcyA 的正向引物 P3 5，-TTGATATCATGGCCGTCACTGATTTAAGTTTGACC-3，，反向弓I 物 P4 :5’-TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAGAC-3’。以 Synechocystis sp. PCC 6803 基因 组DNA作为PCR反应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试 剂盒(Omega公司)纯化。将所得hoi和pcyA基因片段与pET28a_l载体分别用相应适当 的核酸内切酶37°C消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体 3 1混合，在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 α。利用含 50ug/ml卡那霉素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组 表达载体pET28a-h0l-pCyA。用碱变性法提取出构建好的表达质粒pET28a-hol-pCyA，转化 感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性藻蓝胆素的大肠杆菌 菌株P2。上述质粒提取、连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指 南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。
(3)从LB固体(含1. 5%琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P2单菌 落于5mL含50ug/mL卡那霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度37°C， 转速200r/min左右)。将过夜培养物以1 100的比例接种于IL的TB培养基(含卡那 霉素50ug/mL)中。在恒温振荡培养箱中以温度37°C、转速200r/min的培养条件下培养至 OD600 = 0 . 5 0. 7 时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)至终浓度为0. 5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30°C、转速200r/ min的培养条件继续培养24h后停止。将收获的菌液在10，OOOg条件下离心lOmin，弃上清液。收集的菌体1 XPBS缓冲 液洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积预冷的IXPBS缓冲液中。超声波破 碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计30min，破碎过程中保持细胞低温(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg离心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纤维素膜过滤后，加入等体积的 氯仿，颠倒均勻让。在IOOOOg离心30min，小心吸取富含PCB的蓝色沉淀。将沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物经IOOOOg离心IOmin除去。将上述处理获得的蓝色溶液，上样到预先用PBS缓冲液平衡过的Desalting column (GE healthcare)，上样体积不超过柱体积的1/3，流速为2mL/min ；然后接着用PBS 缓冲液洗去杂蛋白，最后藻蓝胆素用20%乙醇溶液洗脱下来。洗脱时同时监测A28tl和A369， 收集洗脱峰，从而得到纯度较高的藻蓝胆素。实施例3(1)集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803全基因组已经测序完成，可从 Genebank免费获得(Genebank编号为BA000022)。根据Genebank中公布的集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)血红素氧化酶基因(hoi)和铁氧还蛋白氧化还原酶基 因(pcyA)的基因序列，设计适当引物，以集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)基因 组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA。藻蓝胆素合 成关键酶基因hoi和pcyA在Genebank中的编号分别为sllll84和slr0116。(2)应用基因工程方法，在hoi基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点， 并插入到P⑶FDuet-I质粒(Novagen，Germany)的第一个多克隆位点处，得到重组载体 pCDFDuet-hol。在基因pcyA两端分别加上Nde I和Xho I酶切位点，并克隆到pCDFDuet-hol 的另一个多克隆位点处，得到重组载体ρ⑶FDUet-hol-pCyA(如附图3所示)。具体操作方 法如下根据Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列设计引物。hoi的正向引物Pl 5，-TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2 :5，-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGG TGGCGAG-3，。pcyA 的正向引物 P3 5，-TTCATATGATGGCCGTCACTGATTTAAGTTTGACC-3，，反向弓I 物 P4 5’-TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAGAC-3’。以 Synechocystis sp. PCC 6803 基因 组DNA作为PCR反应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试 剂盒(Omega公司)纯化。将所得hoi和pcyA基因片段与ρ⑶FDuet-Ι载体分别用相应适 当的核酸内切酶37°C消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载 体3 :1混合，在T4DNA连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5ci。利用含 50ug/ml壮观霉素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组 表达载体pCDFDuet-hol-pcyA。用碱变性法提取出构建好的表达质粒pCDFDuet-hol-pcyA，转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性藻蓝胆素的大肠 杆菌菌株P3。上述质粒提取、连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实 验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。(3)从LB固体(含1. 5%琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P3单菌 落于5mL含50ug/mL壮观霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度37°C， 转速200r/min左右)。将过夜培养物以1 100的比例接种于IL的TB培养基(含壮观 霉素50ug/mL)中。在恒温振荡培养箱中以温度37°C、转速200r/min的培养条件下培养至 OD600 = 0 . 5 0. 7 时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)至终浓度为0. 5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30°C、转速200r/ min的培养条件继续培养24h后停止。将收获的菌液在10，OOOg条件下离心lOmin，弃上清液。收集的菌体IXPBS缓冲 液洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积预冷的IXPBS缓冲液中。超声波破 碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计30min，破碎过程中保持细胞低温(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg离心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纤维素膜过滤后，加入等体积的 氯仿，颠倒均勻让。在IOOOOg离心30min，小心吸取富含PCB的蓝色沉淀。将沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物经IOOOOg离心IOmin除去。将上述处理获得的蓝色溶液，上样到预先用PBS缓冲液平衡过的Desalting column (GE healthcare)，上样体积不超过柱体积的1/3，流速为2mL/min ；然后接着用PBS 缓冲液洗去杂蛋白，最后藻蓝胆素用20%乙醇溶液洗脱下来。洗脱时同时监测A28tl和A369， 收集洗脱峰，从而得到纯度较高的藻蓝胆素。实施例4(1)集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803全基因组已经测序完成，可从 Genebank免费获得(Genebank编号为BA000022)。根据Genebank中公布的集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)血红素氧化酶基因(hoi)和铁氧还蛋白氧化还原酶基 因(pcyA)的基因序列，设计适当引物，以集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)基因 组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA。藻蓝胆素合 成关键酶基因hoi和pcyA在Genebank中的编号分别为sllll84和slr0116。(2)应用基因工程方法，在hoi基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位 点，并插入到pACY⑶uet-Ι质粒(Novagen，Germany)的第一个多克隆位点处，得到重组 载体pACY⑶uet-hol。在基因pcyA两端分别加上Nde I和Xho I酶切位点，并克隆到 pACYCDuet-hol的另一个多克隆位点处，得到重组载体pACYCDuet-hol-pcyA(如附图4所 示)。具体操作方法如下根据Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列设计引物。hoi的正向引物Pl 5，TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2 :5，-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGGT GGCGAG-3，。pcyA的正向引物P3 5，-TTCATATGATGGCCGTCACTGATTTMGTTTGACC-3，，反向引物 P4 :5’ -TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAGAC-3’。以 Synechocystis sp. PCC 6803 基因组 DNA作为PCR反应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试剂盒 (Omega公司)纯化。将所得hoi和pcyA基因片段与pACY⑶uet-Ι载体分别用相应适当的核 酸内切酶37°C消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体3 1混合，在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 α。利用含50ug/ ml克拉霉素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载 体pACYCDuet-hol-pcyA。用碱变性法提取出构建好的表达质粒pACYCDuet-hol-pcyA，转化 感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性藻蓝胆素的大肠杆菌 菌株P4。上述质粒提取、连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指 南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。(3)从LB固体(含1. 5%琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P4单菌 落于5mL含50ug/mL克拉霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度37°C， 转速200r/min左右)。将过夜培养物以1 100的比例接种于IL的TB培养基(含克拉 霉素50ug/mL)中。在恒温振荡培养箱中以温度37°C、转速200r/min的培养条件下培养至 OD600 = 0 . 5 0. 7 时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)至终浓度为0. 5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30°C、转速200r/ min的培养条件继续培养24h后停止。将收获的菌液在10，OOOg条件下离心lOmin，弃上清液。收集的菌体IXPBS缓冲 液洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积预冷的IXPBS缓冲液中。超声波破 碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计30min，破碎过程中保持细胞低温(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg离心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纤维素膜过滤后，加入等体积的 氯仿，颠倒均勻让。在IOOOOg离心30min，小心吸取富含PCB的蓝色沉淀。将沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物经IOOOOg离心IOmin除去。将上述处理获得的蓝色溶液，上样到预先用PBS缓冲液平衡过的Desalting column (GE healthcare)，上样体积不超过柱体积的1/3，流速为2mL/min ；然后接着用PBS 缓冲液洗去杂蛋白，最后藻蓝胆素用20%乙醇溶液洗脱下来。洗脱时同时监测A28tl和A369， 收集洗脱峰，从而得到纯度较高的藻蓝胆素。实施例5(1)聚球藻Synechococcus elongatus PCC 6301全基因组已经测序完成，可从 Genebank中免费获得其基因序列(Genebank编号为AP008231)。根据Genebank中公布的 聚球藻Synechococcus elongatus PCC 6301血红素氧化酶基因(hoi)和铁氧还蛋白氧化 还原酶基因(PcyA)的基因序列，设计适当引物，以聚球藻Synechococcus elongatus PCC 6301基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA。 其中藻蓝胆素合成关键酶基因ho 1和pcyA在Genebank中的编号分别为syc2236_c和 syc0325_do(2)应用基因工程方法，在hoi基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点，并插 入到pETDuet-Ι质粒的第一个多克隆位点处，得到重组载体pETDuet-hol。在基因pcyA两 端分别加上Nde I和Xho I酶切位点，并克隆到pETDuet-hol的另一个多克隆位点处，得到 重组载体pETDuet-h0l-pCyA(如附图1所示)。具体操作方法如下根据Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列设计引物。hoi的正向引物P5 5 ，-TAGGATCCTATGGGCGCGAATCTAGCA-3，，反向引物 P6 :5，-TTGAGCTCTTATTCGGCTGCAGTTG-3’。 pcyA 的正向引物 P7 5，-TTCATATGATGTCCTCCAGCACGCGAG-3，，反向引物 P8 5，-TGCTCGAGTCA ATCACTGGGCAAATC-3，。以 Synechocystis sp. PCC 6301 基因组 DNA 作为 PCR 反应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试剂盒(Omega公司)纯化。将所 得hoi和pcyA基因片段与pETDuet-Ι载体分别用相应适当的核酸内切酶37°C消化6h。酶 切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体3 1混合，在T4DNA连接酶作 用下16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5ci。利用含氨苄青霉素的LB平板筛选，挑 取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载体pETDuet-hol-pcyA。用碱变 性法提取出构建好的表达质粒pETDuet-hol-pcyA，转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，得到 能在T7启动子驱动下高效表达活性藻蓝胆素的大肠杆菌菌株P5。上述质粒提取、连接、转 化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂 等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。(3)从LB固体(含1. 5%琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P5单菌 落于5mL含lOOug/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度 37°C，转速200r/min左右)。将过夜培养物以1 100的比例接种于IL的TB培养基(含 氨苄青霉素lOOug/mL)中。在恒温振荡培养箱中以温度37°C、转速200r/min的培养条件下 培养至OD600 = 0 . 5 0. 7时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-th iogalactopyranoside)至终浓度为0. 5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30°C、转 速200r/min的培养条件继续培养24h后停止。将收获的菌液在10，OOOg条件下离心lOmin，弃上清液。收集的菌体IXPBS缓冲 液洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积预冷的IXPBS缓冲液中。超声波破 碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计30min，破碎过程中保持细胞低温(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg离心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纤维素膜过滤后，加入等体积的 氯仿，颠倒均勻让。在IOOOOg离心30min，小心吸取富含PCB的蓝色沉淀。将沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物经IOOOOg离心IOmin除去。将上述处理获得的蓝色溶液，上样到预先用PBS平衡过的Desalting column (GE healthcare)，上样体积不超过柱体积的1/3，流速为2mL/min ；然后接着用PBS缓冲液洗去 杂蛋白，最后藻蓝胆素用20%乙醇溶液洗脱下来。洗脱时同时监测A28t^PA369，收集洗脱峰， 从而得到纯度较高的藻蓝胆素。实施例6(1)聚球藻Synechococcus sp. WH 8102全基因组已经测序完成，可从Genebank免 费获得(Genebank编号为BX548020)。根据Genebank中公布的血红素氧化酶基因(hoi)和 铁氧还蛋白氧化还原酶基因(PcyA)的基因序列，设计适当引物，以Synechococcus sp. WH 8102基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA。藻 蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA在Genebank中的编号分别为SYNW0171和SYNW1084。(2)应用基因工程方法，在hoi基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点，并 插入到pETDuet-Ι质粒的多克隆位点处，得到重组载体pETDuet-hol。在基因pcyA两端 分别加上Nde I和Xho I酶切位点，并克隆到pETDuet-hol的下游位点处，得到重组载体 pETDuet-h0l-pCyA(如附图1所示)。具体操作方法如下根据Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列设计引物。hoi的正向引物P9 5 ，-TAGGATCCTATGTCTGTCGCTCTGGCTAC-3，，反向引物 PlO :5，-TTGAGCTCTCAGGCCGCCGCAG-3’。 pcyA 的正向引物 P11 5，-TTCATATG ATGCAGTCCCCGCCGTC-3，，反向引物 P12:5，-TGCTCGAGTCAACCTGGAGGCAAAGG-3，。以 Synechococcus sp. WH 8102 基因组 DNA 作为 PCR 反应扩增模 板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试剂盒(Omega公司)纯化。 将所得hoi和pcyA基因片段与pETDuet-Ι载体分别用相应适当的核酸内切酶37°C消化6h。 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体3 1混合，在T4DNA连接酶 作用下16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5ci。利用氨苄青霉素的LB平板筛选，挑 取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载体pETDuet-hol-pcyA。用碱变 性法提取出构建好的表达质粒pETDuet-hol-pcyA，转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，得到 能在T7启动子驱动下高效表达活性藻蓝胆素的大肠杆菌菌株P6。上述质粒提取、连接、转 化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂 等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。(3)从LB固体(含1.5%琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P6单 菌落于5mL含50ug/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度 37°C，转速200r/min左右)。将过夜培养物以1 100的比例接种于IL的TB培养基(含 氨苄青霉素50ug/mL)中。在恒温振荡培养箱中以温度37°C、转速200r/min的培养条件下 培养至OD600 = 0 . 5 0. 7时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-th iogalactopyranoside)至终浓度为0. 5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30°C、转 速200r/min的培养条件继续培养24h后停止。将收获的菌液在10，OOOg条件下离心lOmin，弃上清液。收集的菌体IXPBS缓冲 液洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积预冷的IXPBS缓冲液中。超声波破 碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计30min，破碎过程中保持细胞低温(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg离心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纤维素膜过滤后，加入等体积的 氯仿，颠倒均勻让。在IOOOOg离心30min，小心吸取富含PCB的蓝色沉淀。将沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物经IOOOOg离心IOmin除去。将上述处理获得的蓝色溶液，上样到预先用PBS缓冲液平衡过的Desalting column (GE healthcare)，上样体积不超过柱体积的1/3，流速为2mL/min ；然后接着用PBS 缓冲液洗去杂蛋白，最后藻蓝胆素用20%乙醇溶液洗脱下来。洗脱时同时监测A28tl和A369， 收集洗脱峰，从而得到纯度较高的藻蓝胆素。实施例7(1)嗜热蓝藻Thermosynechococcus elongatus BP-1全基因组已经测序完成， 可从Genebank免费获得(Genebank编号为BA000039)。根据Genebank中公布的血红素 氧化酶基因(hoi)和铁氧还蛋白氧化还原酶基因(pcyA)的基因序列，设计适当引物，以 Thermosynechococcus elongatus BP-1基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻蓝胆 素合成关键酶基因hoi和pcyA。藻蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA在Genebank中的编 号分别为tll0365和tll2308。(2)应用基因工程方法，在hoi基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点，并插 入到pETDuet-Ι质粒的第一个多克隆位点处，得到重组载体pETDuet-hol。在基因pcyA两 端分别加上Nde I和Xho I酶切位点，并克隆到pETDuet-hol的另一个多克隆位点处，得到 重组载体pETDuet-h0l-pCyA(如附图1所示)。具体操作方法如下根据Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列设计引物。hoi的正向引物P13 5，-TAGGATCCTATGACAACGTCTCTAGC-3’,反向引物 P14 :5，-TTGAGCTCTTAGTCGGCGGTGG-3’。 pcyA 的正向引物 P15 :5，-TTCATATGATGTCTTTGCGTCAACAC-3，，反向引物 P16 :5，-TGCTCGAG CTACACCGGGGGGACAT-3，。以 Thermosynechococcus elongatus BP-1 基因组 DNA 作为 PCR 反 应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试剂盒(Omega公司) 纯化。将所得hoi和pcyA基因片段与pETDuet-1载体分别用相应适当的核酸内切酶37°C消 化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体3 1混合，在T4DNA连 接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5ci。利用含氨苄青霉素的LB平板筛 选，挑取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载体pETDuet-hol-pcyA。用 碱变性法提取出构建好的表达质粒pETDuet-hol-pcyA，转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)， 得到能在1~7启动子驱动下高效表达活性藻蓝胆素的大肠杆菌菌株P7。上述质粒提取、连接、 转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培 堂等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。(3)从LB固体(含1. 5%琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P7单菌 落于5mL含lOOug/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度 37°C，转速200r/min左右)。将过夜培养物以1 100的比例接种于IL的TB培养基(含 氨苄青霉素lOOug/mL)中。在恒温振荡培养箱中以温度37°C、转速200r/min的培养条件下 培养至OD600 = 0 . 5 0. 7时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-th iogalactopyranoside)至终浓度为0. 5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30°C、转 速200r/min的培养条件继续培养24h后停止。将收获的菌液在10，OOOg条件下离心lOmin，弃上清液。收集的菌体IXPBS洗缓 冲液涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积预冷的IXPBS缓冲液中。超声波破 碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计30min，破碎过程中保持细胞低温(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg离心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纤维素膜过滤后，加入等体积的 氯仿，颠倒均勻让。在IOOOOg离心30min，小心吸取富含PCB的蓝色沉淀。将沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物经IOOOOg离心IOmin除去。将上述处理获得的蓝色溶液，上样到预先用PBS缓冲液平衡过的Desalting column (GE healthcare)，上样体积不超过柱体积的1/3，流速为2mL/min ；然后接着用PBS 缓冲液洗去杂蛋白，最后藻蓝胆素用20%乙醇溶液洗脱下来。洗脱时同时监测A28tl和A369， 收集洗脱峰，从而得到纯度较高的藻蓝胆素。实施例8(1)莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii全基因组已经测序完成，可从 Genebank免费获得(Genebank编号为ABCN00000000)。根据Genebank中公布的血红素 氧化酶基因(hoi)和铁氧还蛋白氧化还原酶基因(pcyA)的基因序列，设计适当引物，以 Chlamydomonas reinhardtii基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻蓝胆素合成关 键酶基因hoi和pcyA。藻蓝胆素合成关键酶基因hoi和pcyA在Genebank中的编号分别为 CHLREDRAFT_152591和 CHLREDRAFT_156256。(2)应用基因工程方法，在hoi基因两端分别加上Nde I和EcoR V酶切位点，并插 入到pET28a_l质粒的多克隆位点处，得到重组载体pET28a-hol。在基因pcyA两端分别加 上EcoR V和Xho I酶切位点，并克隆到pET28a-hol的下游位点处(如附图2所示)，得到重组载体pET28a-h0l-pcyA。具体操作方法如下根据Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列设计引物。hoi的正向引物P17 5，-TACATATGTATGTCGGATGCA-3’,反向引物 P18 :5，-TTGATATCCGTGTGCGGCAAAGCAGCA-3’。 pcyA 的正向引物 P19 5，-TTGATATCATGCGCTGCTGAGGCGCATT-3，，反向引物 P20:5，-TGCTCGAG TGCCGACAGCGGAGCTAA-3，。以莱茵衣藻 Chlamydomonas reinhardtii 基因组 DNA 作为 PCR 反 应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试剂盒(Omega公司) 纯化。将所得hoi和pcyA基因片段与pET28a-l载体分别用相应适当的核酸内切酶37°C消 化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体3 1混合，在T4DNA 连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5ci。利用含卡那霉素的LB平板筛 选，挑取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载体pET28a-h0l-pCyA。用 碱变性法提取出构建好的表达质粒pET28a-h0l-pCyA，转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，得 到能在T7启动子驱动下高效表达活性藻蓝胆素的大肠杆菌菌株P8。上述质粒提取、连接、 转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培 堂等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。(3)从LB固体(含1. 5%琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P8单菌 落于5mL含50ug/mL卡那霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度37°C， 转速200r/min左右)。将过夜培养物以1 100的比例接种于IL的TB培养基(含卡那 霉素50ug/mL)中。在恒温振荡培养箱中以温度37°C、转速200r/min的培养条件下培养至 OD600 = 0 . 5 0. 7 时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)至终浓度为0. 5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30°C、转速200r/ min的培养条件继续培养24h后停止。将收获的菌液在10，OOOg条件下离心lOmin，弃上清液。收集的菌体1 XPBS缓冲 液洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积预冷的IXPBS缓冲液中。超声波破 碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计30min，破碎过程中保持细胞低温(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg离心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纤维素膜过滤后，加入等体积的 氯仿，颠倒均勻让。在IOOOOg离心30min，小心吸取富含PCB的蓝色沉淀。将沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物经IOOOOg离心IOmin除去。将上述处理获得的蓝色溶液，上样到预先用PBS缓冲液平衡过的Desalting column (GE healthcare)，上样体积不超过柱体积的1/3，流速为2mL/min ；然后接着用PBS 缓冲液洗去杂蛋白，最后藻蓝胆素用20%乙醇溶液洗脱下来。洗脱时同时监测A28tl和A369， 收集洗脱峰，从而得到纯度较高的藻蓝胆素。实施例9藻蓝胆素的抗氧化作用^tM DPPH 自 ^Sif ^fe (Hirata, T. ，Tanaka, M. ，Ooike, M. ，Tsunomura, T. ，and Sakaguchi, Μ. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared from Spirulina platensis J Appl Phycol 12，2000，435-439.注明参考文献)。测定方法如下取 100 μ L 的200 μ M DPPH乙醇溶液(各组成成分如表1-1所示)和100 μ L的受测液㈧于96孔板 中，混勻，室温下放置30min后，在517nm处测吸光度，同时测定100 μ L DPPH溶液+100 μ L 无水乙醇混合液⑶和100 μ L受测液+100 μ L无水乙醇混合液(C)在517nm下的吸光度。 按照下式计算DPPH自由基清除率DPPH清除率=[I-(A-C)/B] X 100%。
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此处受测液为上述纯化后的藻蓝胆素溶液。我们分别以不同浓度的PCB溶液作为 受试液，混合液A组成如下表1-1所示，测定藻蓝胆素抗氧化效果与浓度之间的关系。表1-1藻蓝胆素抗氧化效果测定体系
权利要求
一种重组藻蓝胆素制备方法，其特征在于包括如下步骤由藻类中克隆出血红素氧化酶基因ho1和铁氧还蛋白氧化还原酶基因pcyA，将上述ho1基因和pcyA基因克隆到表达载体上，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产重组藻蓝胆素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中还进一步包括以下步骤将转化 后的大肠杆菌破碎、氯仿萃取和凝胶过滤层析，获得所述的重组藻蓝胆素。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述藻类选自蓝藻、红藻、隐藻、甲藻或原绿 球藻。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述藻类选自集胞藻、聚球藻、莱茵衣藻或嗜 热蓝藻(Thermosynechococcus elongates)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的血红素氧化酶基因hoi选自Genebank 中编号为 sllll84、syc2236_c、SYNW0171、CHLREDRAFT_152591 或 tll0365 的 hoi 基因; 所述铁氧还蛋白氧化还原酶基因pcyA优选自Genebank中编号为slr0116、syc0325_d、 SYNW1084、CHLREDRAFT_156256 或 tl 12308 的 pcyA 基因。
6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述的表达载体选自pETDuet-1、 pET28a-l、pCDFDuet-1 或 pACYCDuet-1。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
8.权利要求1-7任一所述方法制备的重组藻蓝胆素在药物或食品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于用于抗氧化药物或抗氧化食品。
全文摘要
本发明公开了一种重组藻蓝胆素的制备方法，具体地说是一种利用基因工程技术生产重组藻蓝胆素的方法。具体步骤包括由藻类中克隆出藻蓝胆素合成关键酶基因(ho1和pcyA)，将关键酶基因克隆到适当的表达载体上，而后将重组载体导入大肠杆菌表达体系中进行异源表达，经酶促催化反应，合成重组藻蓝胆素。最后经萃取、层析等纯化步骤，即得重组藻蓝胆素。本发明所得重组藻蓝胆素具有较强的清除DPPH自由基的能力，可用于治疗由氧化损伤所引起的多种疾病，同时还可以作为添加剂应用于功能食品。
文档编号C12P17/16GK101948887SQ20101026415
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者葛保胜, 黄方 申请人:中国石油大学(华东)