结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法

专利名称：结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及新型的结合藻红胆素(PEB)的藻 红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。
背景技术：
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光 光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin,简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin,简 称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白
(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白 的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光， 发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光， 发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基 色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素
(phycoviolobilin，简称PVB); PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
PEC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley AJ， Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host J Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671 )。与前人的方法不同，我们发现Anabaena sp. PCC7120中afr0677基 因编码beta裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的beta裂合酶。这类beta裂合酶不仅能催化藻蓝胆素PCB 与PEC的beta亚基及其同源蛋白质的84位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成藻红蓝 蛋白类荧光蛋白质，还能催化藻红胆素PEB与PEC的beta亚基及其同源蛋白质的84位半胱氨酸巯基(或 同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成一种新型的结合了 PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。藻红胆素PEB 可由HOK PebA、 PebB协同催寸七生成(Alvey，R.M.,Karty，J.A.etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)， 2448-2463 (2003))。在绝大部分的蓝藻和红藻中， 都存在有编码CPE脱辅基蛋白、CPC脱辅基蛋白、APC脱辅基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合成所需 的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有异形胞的蓝藻中存在PEC;隐藻中没有藻胆体，不存在上述基因中 的APC的基因。
藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723, 2002.04.17。 一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用 藻类作为原料，而是利用基因工程方法生产新型的藻红蓝蛋白。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质具 有优良的荧光性质，这种结合PEB的新型藻红蓝蛋白，为开发新型荧光探针提供了更多的选 择。本方法为藻红蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域 奠定了基础。

发明内容
本发明的目的在于提供一种结合藻红胆素(FEB)的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，它 是应用beta裂合酶催化PEB与藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备新型藻红蓝蛋白 类荧光蛋白质(天然状态下藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白是与PCB结合)。将含有beta裂合酶基 因、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到 相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产新型藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的技术方案是这样的 一种结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法， 包括下述步骤
(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta 裂合酶表达质粒；
(2) 用基因工程方法，将藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达 载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；
(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因力o7和/^Z^或其同源基因克隆于第 三个表达载体中，得到力o/和peZ^表达质粒；
(4) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四个表 达载体中，得到peM表达质粒；
(5) 将beta裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、力o7和peZ^表达质粒和pe/W表 达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用 此工程菌通过发酵工程生产结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提 纯技术，提纯得到相应的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的技术方案也可以是这样的 一种结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制
备方法，包括下述步骤
(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基 因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到beta裂合酶和脱辅基蛋白表达质粒；
(2) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因力o7和；7eZ^或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到力o7和peZ^表达质粒；
(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因；^似或其同源基因克隆于第四个表
达载体中，得到/^M表达质粒；
(4) 将beta裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、力o7和peM表达质粒和pe似表 达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用 此工程菌通过发酵工程生产结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提 纯技术，提纯得到相应的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
上述结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法中，所述的宿主菌为大肠杆菌； 所述的beta裂合酶基因是指与力朋力ae/7a sp. PCC7120中s化W77基因同源的基因；所述的 藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与sp. PCC7120或必7aw'/7a ^ sp. PCC7603中 pec5基因同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点
1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖快， 可以大大縮短周期；
2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质类似 的蛋白，提取方便；
4、 生成结合PEB的新型藻红蓝蛋白，具有与天然藻红蓝蛋白不同的光谱特性，为发展荧 光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料提供更多选择。


图1为本发明中Alr0617催化下生成的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的吸收与荧 光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但不构成对本发明的任何限制。 实施例1
(1)从GeneBank中可以査到，藻种^7a6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， ^ 7a肌';7as"s sp. PCC7603和Ca"t/ r众sp. PCC7601部分序列已经测定。^ sZ73e/ a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pec仏a7rW7;7、力o7); ^ Ja犯V o仰s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(peM); CWoz^r" sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因。eM和peZ^)。通过基因工程方法，将力/7a力ae/7asp. PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-sJ^^77，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将力朋Zwe朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^克隆于Novagen 公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝 蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o/和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-/ e似，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因/^"在pET30中是在化oRV和J力o I两个酶切位点之间；裂合酶基因 aZrt W7在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点设7II和之间；PEB合成酶基因是3 个(力o厶peM和/ eM)， 7 o7和pe/^在同一个载体pCDFDuet-1中，力W在第一个多克隆位 点I和尸"I之间，peM在第二个多克隆位点y\4/e I和I力o I之间，peZ^在pACYCDuet-l 中第二个多克隆位点^^ill和27w I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-alrt^77、 pET30-; ec厌pCDFDuet-力o卜peM和pACYCDuet-/7eM转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的 LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为lmmol/L, 2CTC至37。C振荡表达约12小时， 生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破 碎细胞后，离心收集上清液，通过N;T亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白 质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。其吸收与荧光光谱见图1所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为 荧光光谱。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下
从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mLLB培养基，37°C 振荡培养过夜;取100ML饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37。C振荡培养至0D6。。=0. 3 0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min;离心lmin (10000g， 4")弃去 上清，收集沉淀菌体;用lmL预冷的O, lmol/LCaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s (10000g, 4'C) 去上清，菌体沉淀用100nL预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰上，加入一定量的构建好 的质粒，混匀后冰浴放置30min， 42。C热休克90s，冰浴5min后加入300^ LB培养基，37°C 低速振荡培养45min，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平板上，倒置于37。C培养箱至 形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；分 别从中取100pL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37'C振荡培养至0D6。。=0. 5-0. 7时， 冰浴约30min，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、 150转/分，表达约12小时。离心收集细 胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表 达。
实施例2
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种勘Wae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M J柳i/70S〃s sp. PCC7603和CaJot/zr^sp. PCC7601部分序列已经测定。力/736ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pet^、 3ZrW77、 /w/);
7a肌V oms sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(pec5); CaJoz^r& sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(peW和peZ^)。通过基因工程方法，将 sp.PCC7120中的alrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a/r^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将^7a&e朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5(C1551)克隆于 Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pec^(C1551)，在大肠杆菌中能表达脱 辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(/w7和/^M)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-/ o/-/ Wi9，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-pe^，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因/ ec5(C155I)在pET30中是在fcoRV和i%o I两个酶切位点之间；裂 合酶基因a7^ W7在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点^^1I禾Q J力o I之间；PEB合成酶 基因是3个(力o厶peM和peM)，力o7和； eM在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个 多克隆位点AfcoI禾B尸"I之间，pe65在第二个多克隆位点Abtel和J力ol之间，pe似在 pACYCDuet-l中第二个多克隆位点^ill和J/wI之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-alrt ^ 7、 pET30-pec5(C1551) 、 pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l鹏ol/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝 蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例3
(1)从GeneBank中可以査到，藻种^a&e朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， #. 7a肌'/7os"s sp. PCC7603和C3"t力r&sp. PCC7601部分序列已经测定。^ a力ae/ asp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(pec^、 aJi^W7、力o7); 必Ja肌'/70s〃s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(z e^); Ca7"力wi sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(pe似和peZ^)。通过基因工程方法，将A W朋/ a sp. PCC7120中的W^^77基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因/ ec万克隆于Novagen公司的 pETDuet-l中，所得质粒叫pETDuet-pec^alr^77，在大肠杆菌中能表达藻红蓝蛋白类脱辅 基蛋白B和beta裂合酶。根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力W和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7，e/^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pec5和裂合酶基因Wr0577在pETDuet-1中，pecA处于第一个多克 隆位点，酶切位点是^boR I和尸"I ， a介W77处于第二个多克隆位点《^ n和J力o I之间； PEB合成酶基因是3个(力o厶peW和peM)，力o/和； eM在同一个载体pCDFDuet-l中，力o7 在第一个多克隆位点vVco I和Z5" I之间，/ eM在第二个多克隆位点AWe I和屈o I之间，pe^ 在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点5WII和Wo I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: 1混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-pec&aZrt W7、 pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基 中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时， 生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破 碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白 质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例4
(1)从GeneBank中可以查到，藻种^ a力ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成，
yK Ja/iw7 awssp. PCC7603和C^"/ r&sp. PCC7601部分序列已经测定。///73/ ae/7a sp. PCC7120
在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(pec仏a介W77、力o7);
M 7a/w'/ osM sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序列中找到所需基因(/ ec^); "A t力rj', sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(pe似和peZ^)。通过基因工程方法，将Z/^tee朋 sp. PCC7120中的a&M77基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec贝C1551)克隆于Novagen 公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pec5 (C155I) -WrM/7，在大肠杆菌中能表达 藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白B和beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和pe力历克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peM,在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pec^ (C155I)和裂合酶基因WrW77在pETDuet-1中，pec5处于第 一个多克隆位点，酶切位点是^boR I和户W I ， a77^W7处于第二个多克隆位点A^ni和 I之间；PEB合成酶基因是3个(Z o入peM和pe65)， Z o7和；7e65在同一个载体pCDFDuet-l 中，力o7在第一个多克隆位点Afco I和,"I之间，peM在第二个多克隆位点We I和i7 o I 之间，pe/W在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点份7II和J/w I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生
素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-pec^(C1551) -aZrt W7、 pCDFDuet-Z o7-pe6^和pACYCDuet-peiW转入
大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的
LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-f3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl
thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，
生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破
碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白
质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例5
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^7a&e朋sp. PCC7120的全序列己经测定完成， 尨7a历i/7os"s sp. PCC7603和Ca/"/ rj>sp. PCC7601部分序列已经测定。力"a/ ae/7a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(/7ecA、 aZrt W7、 Zw/); 必7a肌V70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因。ecA); Ca^t力rA sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(pe^和pe6幼。通过基因工程方法，将^7aZ^e朋 sp.PCC7120中的a7rOW7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a介。W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将^朋&e朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因； ec5克隆于Novagen 公司的表达载体pCOLADuet-l中，所得质粒叫pCOLADuet-; ecA在大肠杆菌中能表达脱辅基 蛋白藻红蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(Zw7和； eZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^,在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因p"5在pCOLADuet-l第一个多克隆位点feoR I和Pst I两个酶切位点 之间；裂合酶基因a^M77在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点《WII和之间； PEB合成酶基因是3个(力o厶/ e似和/ eM)，力o7和pe6v 在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7 在第一个多克隆位点〃co I和尸W I之间，peM在第二个多克隆位点M/e I和J力o I之间，/ e力力 在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点处7II和i7w I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-alrW77、 pCOLADuet-pec仏pCDFDuet-力o/-pe/^和pACYCDuet-pe似转
11入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0
的LB培养基中，37t:振荡培养至ODe。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1腸1/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝 蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例6
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种j/7a力朋朋sp. PCC7120的全序列己经测定完成， vK 7柳i"ows sp. PCC7603和CaJoMrji sp. PCC7601部分序列已经测定。A aZjae/7a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因。ec仏aZrt W7、力o/); 必7a^'/70^s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(; ecv9); Ca7"力r^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679,可从所査到序列中找到所需基因(/7eM和；;e6^)。通过基因工程方法，将力/7aZ^朋a sp. PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-W^ W 7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将^朋6ae朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecMC1551)克隆于 Novagen公司的表达载体pC0LADuet-1中，所得质粒叫pC0LADuet-pec^(C1551)，在大肠杆菌 中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-; eZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pecMC155I)在pC0LADuet-1第一个多克隆位点￡boR I和Pst I两个
酶切位点之间；裂合酶基因Wi^W7在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点5^HI和J力o
I之间；PEB合成酶基因是3个(力o入peM和/ e力5)， Zw7和/ e/^在同一个载体pCDFDuet-1
中，力o7在第一个多克隆位点I和At I之间，peM在第二个多克隆位点M/e I和i7 oI
之间，pe/M在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点份7II和Wo I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5 ) 将 pETDuet-aZrW7;7 、 pC0LADuet-/ ecW(C1551) 、 pCDFDuet-/ o卜/ e力A和 pACYCDuet-;^W转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工 程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D,为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-(J-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37 'C振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌 体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到相应 的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例7
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种勘atee朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， iK 7a/w'/ os"s sp. PCC7603和CaJo^ r^sp. PCC7601部分序列已经测定。力/7a6ae/7asp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pec^、 alrt^77、力o7); #. 7a肌'加s〃s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(; ec^); CW"力rh sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(peW和pe力5)。通过基因工程方法，将 sp.PCC7120中的a7/^W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a7rW7 7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将必7柳i/3oms sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec万克隆于Novagen 公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-;^c万，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝 蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，
所得质粒叫pCDFDuet-/w7-/7eZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(/^W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 质粒叫pACYCDuet-peW，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pec5在pET30中是在化oRV和J力o I两个酶切位点之间；裂合酶基因 Wr^W7在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点5^11和i7 o I之间；PEB合成酶基因是3 个(力o厶pe/W和； eM)，力o7和pe65在同一个载体pCDFDuet-1中，Z o7在第一个多克隆位 点Afco I和尸W I之间，/ eZ^在第二个多克隆位点We I和J7 o I之间，在pACYCDuet-l 中第二个多克隆位点《WII和o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生
素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-aZr。677、 pET30-pec仏pCDFDuet-力o/-peZ^和pACYCDuet-pe似转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的 LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小时， 生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破 碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白 质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例8
(1)从GeneBank中可以查到，藻种^朋A朋朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成，
7柳i77omssp. PCC7603和CW"/^ijrsp. PCC7601部分序列己经测定。如aZ^e朋sp. PCC7120
在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pec5、 W2^W7、 Z o7);
必7a/w'/70幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序
列中找到所需基因(peM); Ck "/ rj> sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为
AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(/ eW和pe6A)。通过基因工程方法，将力/ 36ae"a
sp.PCC7120中的alrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫
pETDuet-aZrt W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将尨h肌'/mms sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecMC155I)克隆 于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pec^(C1551)，在大肠杆菌中能表 达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(/w/和； e力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe力A在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-; e力A在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pecMC155I)在pET30中是在化oRV和I两个酶切位点之间；裂 合酶基因aZrt 《77在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点^^1I和i7 oI之间；PEB合成酶 基因是3个(力o厶； e/^和； e/^),力o7和pe秘在同一个载体pCDFDuet-1中，Z o7在第一个 多克隆位点Afcol禾卩尸"I之间，； e/^在第二个多克隆位点AWeI和X力oI之间，/ ei^在 pACYCDuet-l中第二个多克隆位点份7II和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生
素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-aZr^77、 pET30-pec5(C1551) 、 pCDFDuet-/ o7—peZ 5和pACYCDuet— 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至OD咖为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio_(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝 蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例9
(1)从GeneBank中可以查到，藻种^朋6ae/ a sp. PCC7120的全序列已经测定完成，
yK Ja肌'"os"s sp. PCC7603和Ca7ot/ rj>sp. PCC7601部分序列已经测定。A a力ae/ja sp, PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pec5、 a7/^W7、 Zw7); iZ "加'y os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，可从所査到序 列中找到所需基因(/ ec幼；Ca2"力h;sr sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(peW和pe/^)。通过基因工程方法，将力/7stee/7a sp. PCC7120中的a7r^77基因和必^肌V7oms sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基 因pec^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pec&a7/^577，在大肠 杆菌中能表达藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白B和beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-Z o7-v9eZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 质粒叫pACYCDuet-peW，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pec^和裂合酶基因a77^W7在pETDuet-1中，pec^处于第一个多克 隆位点，酶切位点是^boR I和尸st I ， W^^77处于第二个多克隆位点5g7II和I之间； PEB合成酶基因是3个(力o厶peM禾t]pe/^)，力W和pe65在同一个载体pCDFDuet-l中，力o7 在第一个多克隆位点Wco I和尸W I之间，/ eM在第二个多克隆位点/fefe I和o I之间，/ e^ 在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点餘JII和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-pec5"Wr^77、 pCDFDuet-力o7-pe/^和pACYCDuet-转入大肠杆菌，
当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基
中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl
thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小时，
生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破
碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白
16质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例10
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力朋力ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M h/z i/7o幼s sp. PCC7603和CaJ"力rAsp. PCC7601部分序列已经测定。^朋Z ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(pec仏a^rt W7、力o/);
7柳j'/ os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(pec^); Ca7W力ri义sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679,可从所査到序列中找到所需基因(/^M和pe/^)。通过基因工程方法，将力朋6朋朋 sp. PCC7120中的aZrt^/7基因和M ^啦V os"s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基 因pec5 (C155I)克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pec5 (C155I) -a7/^W7，在大肠杆菌中能表达藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白B和beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力W和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7，eM，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-pe^，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因/ ec5 (C155I)和裂合酶基因a7/^W7在pETDuet-1中，； ec^处于第 一个多克隆位点，酶切位点是^boR I和尸"I ， WrM77处于第二个多克隆位点5《711和J力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o入pe似和peM)，力o7和peZ^在同一个载体pCDFDuet-1 中，力o7在第一个多克隆位点I和尸W I之间，/ eM在第二个多克隆位点AWe I和J/ o I 之间，/ e/M在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点和J/w I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-pec5(C1551) -aZrt 《/7、 pCDFDuet-Zw卜/ eM和pACYCDuet-; aM转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的 LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时， 生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破 碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白 质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例11
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^73力ae"a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， vK z3肌'/ os"s sp. PCC7603和C37"/ w>sp. PCC7601部分序列已经测定。力/7a63e/7a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(pec^、 a7r。W7、 Z o7); ^7柳i/JO幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(pec5); 6^ot/ n';r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(peM和/ ^^)。通过基因工程方法，将力朋&e朋 sp. PCC7120中的a^W77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-Wj^W 7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将#. 7a肌'/7os"s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因peci9克隆于Novagen 公司的表达载体pC0LADuet-1中，所得质粒叫pC0LADuet-pecA在大肠杆菌中能表达脱辅基 蛋白藻红蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和； eZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-/ o/-在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-pe^，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pec^在pC0LADuet-l第一个多克隆位点^boR I和Pst I两个酶切位点
之间；裂合酶基因WrOW7在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点^^71I和之间；
PEB合成酶基因是3个(力o入peM和peM)， / o7和；7e65在同一个载体pCDFDuet-l中，力o7
在第一个多克隆位点vVco I和尸W I之间，peM在第二个多克隆位点A^e I和i7 o I之间，pe^
在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点《§711和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-aZrt ^/;7、 pC0LADuet-/ ec5、 pCDFDuet-力o卜peZ^和pACYCDuet-pe^转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio—(3—D—galactoside，简称IPTG)至终浓度为1腸1/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝 蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例12
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力/7a/ ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， Ja/w'/7as"s sp. PCC7603和CaJ"力ri;sr sp. PCC7601部分序列已经测定。力朋力ae/7a sp. PCC7120
在GeneBank中编号为BA000019,可从所査到序列中找到所需基因(pec^、 a7rM/7、力o7); M Ja7u';7as"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(pec5); C^ot/ r^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(; e6/I和peZw9)。通过基因工程方法，将^7a6ae朋 sp. PCC7120中的a7/^W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-3^^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，禾U用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将M 73/w'加犯s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5(C155I)克隆 于Novagen公司的表达载体pC0LADuet-1中，所得质粒叫pC0LADuet-pec79(C1551)，在大肠
杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，
所得质粒叫pCDFDuet-/ o/-peZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。(4)将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-/ eM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pe^(C155I)在pC0LADuet-1第一个多克隆位点￡boR I和Pst I两个 酶切位点之间；裂合酶基因a7^ W7在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点^ 7II和J力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o7、 /7eW和pe力万)，力o7和pe/^在同一个载体pCDFDuet-1 中，力W在第一个多克隆位点Abo I和/^f I之间，pe/^在第二个多克隆位点We I和J7w I 之间，在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点^ill和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5 ) 将 pETDuet-3ZrW77 、 pC0LADuet—; ec5(C1551) 、 pCDFDuet-力o —peZ S禾口 pACYCDuet-pe/^转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工 程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D,为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1腸1/L， 2(TC至37 'C振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌 体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提纯得到相应 的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的beta裂合酶、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白、藻红胆 素生物合成酶基因或其同源基因来制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开 的问题，本发明只选用了 GenBank中已公开全序列的蓝藻^7a6ae/7a sp. PCC7120和已经部分 测序的尨7a肌7ws"s sp. PCC7603和Ca"^rj> sp. PCC7601为例对本发明方法加以说明，本 领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本发明。
权利要求
1. 一种结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1)用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；(2)用基因工程方法，将藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；(3)用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因bol和pebB或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到hol和pebB表达质粒；(4)用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到pebA表达质粒；(5)将beta裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、hol和pebB表达质粒和pebA表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
2. —种结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基 因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到beta裂合酶和脱辅基蛋白表达质粒；(2) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因力o7和/je65或其同源基因克隆于第 三个表达载体中，得到力o/和pe力^表达质粒；(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四个表 达载体中，得到peM表达质粒；(4) 将beta裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、力o/和pe幼表达质粒和pe^表 达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用 此工程菌通过发酵工程生产结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提 纯技术，提纯得到相应的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的beta裂合酶基因是指与 sp. PCC7120中WrOW7基因同源的基因。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因 是指与^朋Aae朋sp. PCC7120或必J棚i/7os"5 sp. PCC7603中；pecS基因同源的基因。
全文摘要
本发明公开了一种结合藻红胆素(PEB)的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻红胆素与藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。
文档编号C12N15/60GK101481700SQ20081002574
公开日2009年7月15日 申请日期2008年1月10日 优先权日2008年1月10日
发明者佟顺刚, 坤 夏 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司