链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法

专利名称：链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种链霉亲和素标记的结合藻红 胆素(PEB)的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。
背景技术：
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其 吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红 蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋 白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基 中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半 胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。 藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发 射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的 可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧 光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结 合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB); PEC的beta亚基结合的辅基色素 为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放大作 用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医疗检测等 领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。
PEC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley AJ， Glazer AN. Biosynthesis cif the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J" Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671)。 与前人的方法不同，我们发现Anabaena sp. PCC7120中aZrt W7基因编码beta裂合酶，在 其它蓝藻中也存在同源的beta裂合酶。这类beta裂合酶不仅能催化藻蓝胆素PCB与PEC的 beta亚基及其同源蛋白质的84 位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成 藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，还能催化藻红胆素PEB与PEC的beta亚基及其同源蛋白质的84 位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成一种新型的结合了 PEB的藻红蓝蛋 白类荧光蛋白质。藻红胆素PEB可由HOl、 PebA、 PebB协同催化生成 (Alvey, R. M., Karty, J. A. etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis inFremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10), 2448-2463 (2003))。通过 基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于表达载体， 可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，直接实现 链霉亲和素和藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接，而不需要通过化学交联等方法实现链霉亲 和素标记。
藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。藻红蓝蛋白类 荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链霉亲和素和藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的 连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。这种结合PEB的新型藻红蓝蛋白，为开发新型 荧光探针提供了更多的选择。本方法为藻红蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆 品、医药和生物工程领域奠定了基础。

发明内容
本发明的目的在于提供一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素(PEB)的藻红蓝蛋白类荧光 蛋白质的方法，它是应用beta裂合酶催化PEB与链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白 共价结合，从而制备新型藻红蓝蛋白类荧光蛋白质(天然状态下藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白是 与PCB结合)。将含有beta裂合酶基因、链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼 接的基因、PEB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过如此 设计的基因工程菌生产新型链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的技术方案是这样的 一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光 蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤
(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta 裂合酶表达质粒；
(2) 用基因工程方法，将藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因与链霉亲和素基因 拼接后克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因力o7和/^Z^或其同源基因克隆于第 三个表达载体中，得到力o7和/ eZ^表达质粒；
(4) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四个表 达载体中，得到pe^表达质粒；
(5) 将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、力o7和pe65表 达质粒及/^似表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应 的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，发酵后，按常规蛋白质提纯技术，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合PEB的 藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的技术方案也可以是这样的 一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白 类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤
(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基 因或其同源基因与链霉亲和素基因拼接后同时克隆于表达载体中，得到beta裂合酶和链霉亲 和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(2) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因力W和/7eZ^或其同源基因克隆于第 二个表达载体中，得到力o7和pe/^表达质粒；
(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因peW或其同源基因克隆于第三个表 达载体中，得到pe^表达质粒；
(4) 将beta裂合酶和链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、力o7和peZ^表达质粒及 peM表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌， 应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，发 酵后，按常规蛋白质提纯技术，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白 类荧光蛋白质。
上述链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法中，所述的 宿主菌为大肠杆菌；所述的beta裂合酶基因是指与^atee朋sp. PCC7120中aJr^77基因 同源的基因；所述的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与^朋6ae朋sp. PCC7120或 yK 7朋u7 oms sp. PCC7603中pec^基因同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点-
1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白 质，大肠杆菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质类似 的蛋白，提取方便；
4、 生成结合PEB的新型藻红蓝蛋白，具有与天然藻红蓝蛋白不同的光谱特性，为发展荧 光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料提供更多选择。


图1为本发明中Alr0617催化下生成的链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光 蛋白质的吸收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但不构成对本发明的任何限制。 实施例1
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^7a6ae"a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， yK〗a/w'/7os〃s sp. PCC7603和C^"/ ri;r sp. PCC7601部分序列已经测定。^朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因。ec仏aZr。W7、力o7); 必7柳i/3omssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(pec5); CW"Ari;f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(peW和peM)。通过基因工程方法，将^sAae朋 sp.PCC7120中的Wr。W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-aZrt W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将^73&e朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-M-pec& 链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和 素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o 和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe6A在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因。e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peW，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因幼在pET30中在I和A^II两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因 pec^在pET30中是在fcoRV和i7 o I两个酶切位点之间；裂合酶基因air。《/7在pETDuet-1 中，处于第二个多克隆位点和J力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o厶pe^和peZ^)， Z o7和peM在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点vVco I和At I之间，peM 在第二个多克隆位点AWeI和之间，peM在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点^"7II和 /力o1之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-a7r。6/;7、 pET30-sa^; ec厌pCDFDuet-力o -/ e65和pACYCDuet-peZ^转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l醒ol/L， 2(TC至37。C振荡表 达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯 得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。其吸收与荧 光光谱见图l所示；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下
从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mLLB培养基，37°C 振荡培养过夜;取lOOpL饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37。C振荡培养至0D6Q。=0. 3 0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min;离心lmin (10000g, 4。C)弃去 上清，收集沉淀菌体;用lmL预冷的O. lmol/LCaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s (10000g， 4'C) 去上清，菌体沉淀用lOO(aL预冷的O. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰上，加入一定量的构建好 的质粒，混匀后冰浴放置30min， 42。C热休克90s，冰浴5min后加入300pL LB培养基，37°C 低速振荡培养45min，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平板上，倒置于37'C培养箱至 形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；分 别从中取lOO)aL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37。C振荡培养至0D6。。=0. 5-0. 7时， 冰浴约30rain，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、 150转/分，表达约12小时。离心收集细 胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表 达。
实施例2
(1)从GeneBank中可以查到，藻种^ a力ae朋sp. PCC7120的全序列己经测定完成， Ja/w'"os〃s sp. PCC7603和CaJ"Arz> sp. PCC7601部分序列已经测定。J朋&e朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019,可从所査到序列中找到所需基因(/ ec5、 37rW/7、 Z o7); i/. 7a迈yy osiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序列中找到所需基因。ec5); CaJ"/ r^r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因。eW和pe/^)。通过基因工程方法，将力朋力ae"a sp.PCC7120中的a7r^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得质粒叫 pETDuet-a介0W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将^ja^e朋sp. PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5(C1551)和链霉亲 和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-pec^(C1551)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因。e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa在pET30中在A>/71和《"II两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因 pec5(C155I)在pET30中是在fcoRV和J/ o I两个酶切位点之间；裂合酶基因a7i^W7在 pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点设7II和^oI之间；PEB合成酶基因是3个(力o厶
和peM)，力o7和peM在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点I和 尸"I之间，peZ^在第二个多克隆位点AWe I和J力o I之间，在pACYCDuet-1中第二个多 克隆位点《WI1和J/ o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: 1混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生
素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5 ) 将 pETDuet-aZrt 《7;7 、 pET30-ss"/ ec^(C1551) 、 pCDFDuet-力o7-peZ^和
pACYCDuet-/ e似转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至OD卿为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1画1/L， 20。C至37 'C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋 白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析， 可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例3
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种sp. PCC7120的全序列已经测定完成， vK Ja7w'/ os"s sp. PCC7603和Ca7oz^ri义sp. PCC7601部分序列已经测定。Z朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pec万、aZrt W7、
M 7a/w'"os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(/ ec5); Ca2"Arj> sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(peM和pe/^)。通过基因工程方法，将^ja力朋朋 sp.PCC7120中的a/^^/7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a7r^W乙在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将力朋Z^朋sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫 pC0LADuet-^-pec5，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅 基蛋白藻红蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-/ o/-pe/^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(/ eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-; e似，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因pe^拼接后连接到pC0LADuet的^bd I和户W I之间；裂合酶基因W7^W7在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点《^HI和J力oI之间； PEB合成酶基因是3个(力o 、 /7e/W和peZ^)，力o7和peM在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点I和尸W I之间，/ eM在第二个多克隆位点yW/e I和J/w I之间，; eM 在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点勘JII和I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-aZrt^77、 pC0LADuet-s『; ec5、 pCDFDuet—力o7—peZ^和pACYCDuet-pe^ 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37T振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯 得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例4
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种」朋6朋朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 7a/w'/ os〃s sp. PCC7603和CW"力n';f sp. PCC7601部分序列已经测定。力/ a6ae/7a sp. PCC7120
在GeneBank中编号为BA000019,可从所査到序列中找到所需基因(pec仏WrW77、 i/J柳i加ms sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，可从所查到序 列中找到所需基因(pec5); Ca2ot力/"A sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679,可从所査到序列中找到所需基因。eZ^和peZ^)。通过基因工程方法，将^7a&e朋 sp.PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a7^rt W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将^7a6ae/7asp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5(C1551)和链霉 亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pC0LADuet中，所得质粒叫 pC0LADuet-sa-; ec5(C1551)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标 记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和/7e65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe力A在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因。e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peW，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因^和脱辅基蛋白基因pec^(C1551)拼接后连接到pCOLADuet的fcoR I和尸"I之间；裂合酶基因WrW77在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点>^711和i7 o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o入peZ^和pe/;5)，力o7和； e/^在同一个载体pCDFDuet-1 中，力o7在第一个多克隆位点Ate I和尸"I之间，peM在第二个多克隆位点Atofe I和J力o I 之间，pe似在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点和o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生
素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5 )将pETDuet-aZrt W7、 pC0LADuet-sa^ec5(C1551) 、 pCDFDuet-力o7-pe/^和
pACYCDuet-peW转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工 程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lramol/L， 2CTC至37 。C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋 白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N;T亲和层析， 可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例5
(1)从GeneBank中可以查到，藻种J朋6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， i/. 7a/w'/ os"s sp. PCC7603和"7"力rj';f sp. PCC7601部分序列已经测定。Z朋力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(pec仏a化W77、力o7); 尨7柳j'/70SiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序列中找到所需基因(pec万)；sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(peM和peM)。通过基因工程方法，将力朋6朋朋 sp. PCC7120中的ah^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位点，藻红蓝蛋白类 脱辅基蛋白基因pec^和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-1 中第一位点，所得质粒叫pETDuet-幼-; ec^-3^^677，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶以 及链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力W和； eZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力W-; e/^,在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 质粒叫pACYCDuet-pe似，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因； ec5拼接后连接到pETDuet的化oR I和At I 之间，Wr。W7处于第二个多克隆位点《WII禾卩J力ol之间；PEB合成酶基因是3个(Zw厶 / e似和peZ^)，力o7和pe/ 5在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点Afco I和 户"I之间，pe/^在第二个多克隆位点厨e I和J力o I之间，； e^在pACYCDuet-l中第二个多 克隆位点《^ II和Z力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-st/ ec^^Zrt^77、 pCDFDuet-力o7-pe/^和pACYCDuet-/ e/W转入大肠杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7.0的LB培 养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时， 生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例6
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力朋力ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， yK 7柳i/7o "ssp. PCC7603和Ca7ot力r"sp. PCC7601部分序列已经测定。^Wae/ asp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(pec仏WrM77、力o7); 必h肌V7os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(pec^); 6^"/ n', sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因。eW和peM)。通过基因工程方法，将A7a6ae朋 sp. PCC7120中的Wr^^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位点，藻红蓝蛋白类 脱辅基蛋白基因/ ec^(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的 pETDuet-1中第一位点，所得质粒叫pETDuet-幼-pec5(C1551) -aJr^^77，在大肠杆菌中能表 达beta裂合酶以及链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(/ W和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-/w7-pe/^，在大肠杆菌中能同时表达HOI和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因/ e" (C155I)拼接后连接到pETDuet的￡boR I和尸WI之间，alrt^77处于第二个多克隆位点5g7ll和之间；PEB合成酶基因是3 个(力o厶/ eW和； eM)，力o7和peZ^在同一个载体pCDFDuet-1中，/ o/在第一个多克隆位 点yVco I和尸"I之间，peM在第二个多克隆位点Ato I和i7w I之间，pe/W在pACYCDuet-1 中第二个多克隆位点^71I和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-sa"/ ec机C155I)-aZr。《7;7、 pCDFDuet-Z o卜peZ^和pACYCDuet-; eZ^转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯 得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例7
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ja&e朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 7柳i/ os^ sp. PCC7603和CWo&r&sp. PCC7601部分序列已经测定。力朋力ae/7a sp. PCC7120
在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pec5、 a7/^W7、力o7); 必7a7w7 ams sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(pec^); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为
AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pe似和peM)。通过基因工程方法，将力朋&e/7a sp.PCC7120中的WrM77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a^rt W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将M 7s啦V70s"s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因； ec5和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-sa-pec5，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表 达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋 白藻红蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-; e似，在大肠杆菌中能表达PebA。即链霉亲和素基因sa在pET30中在《; /j I和a^II两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因 pecW在pET30中是在fcoRV和i7 o I两个酶切位点之间；裂合酶基因aZr 77在pETDuet-l 中，处于第二个多克隆位点份7II和J力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o厶peZ^和peZ^)， 力o7和peZ^在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点lo I和/^t I之间， 在第二个多克隆位点AWe I和i7 o I之间，peW在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点5g7II和 勘I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-a^rt W八pET30-sa^; ec厌pCDFDuet-力o卜pe/^和pACYCDuet-z eZ^转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1扁1/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯 得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例8
(1)从GeneBank中可以査到，藻种勘a力朋朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， #. 7aw'"os"ssp. PCC7603和CW"力n';rsp. PCC7601部分序列已经测定。^ a6ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pec5、 a介。W7、力o7); i/.7柳i/2os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(pec5); CW"力w';f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pe似和peZ^)。通过基因工程方法，将^7a6ae/ a sp.PCC7120中的aZrt ^ 7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a7^ W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将必"肌'/70s"s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^(C1551)和链 霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-sa-pec万(C1551)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o卜/ e/^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-/ e/W，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa在pET30中在和^ill两个酶切位点之间，脱辅基蛋白基因 /^cA(C155I)在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间；裂合酶基因a7r^77在 pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点5WII和J力ol之间；PEB合成酶基因是3个(力o入 pe似和peM)，力o/和peM在同一个载体pCDFDuet-l中，力o7在第一个多克隆位点Afco I和 尸"I之间，peZ^在第二个多克隆位点A^e I和i7 o I之间，pe^在pACYCDuet-l中第二个多 克隆位点5g7II和o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5 ) 将 pETDuet-slrt W7 、 pET30-sa~pec5(C155I) 、 pCDFDuet-力o7-pe6i9和 pACYCDuet-peZ^转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工 程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-13-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37 'C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋 白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析， 可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例9
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^ a6ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 髮Ja/w'/70s"s sp. PCC7603和C3J"/ r"sp. PCC7601部分序列已经测定。y/y a力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(pec仏alrt W7、力o7); M Ja/w'; o幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(/^cS); 6^ot力ri;f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因。e似和；^力5)。通过基因工程方法，将力/7a&e/7a sp. PCC7120中的a^rt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a7r^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，禾U用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将M Zg肌'/70s"s sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒叫 pC0LADuet-^-链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中 能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅 基蛋白藻红蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o卜/7eM，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-; eZ^，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因幼和脱辅基蛋白基因pe^拼接后连接到pCOLADuet的￡coR I和尸" I之间；裂合酶基因Wr^W7在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点《WII和之间； PEB合成酶基因是3个(力o/、 / eW和peZ^)，力o7和pe/^在同一个载体pCDFDuet-l中，/ o 在第一个多克隆位点〃co I和尸"I之间，peM在第二个多克隆位点I和Wo I之间，pe/^ 在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点5^ II和Wo I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: 1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-aZrt W7、 pC0LADuet-sa~/ ec5、 pCDFDuet-力o7-pe65和pACYCDuet-pe/W 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1國1/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯 得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例10
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， vK 7a/M'/ asi/s sp. PCC7603和C^"力rAsp. PCC7601部分序列已经测定。力/7a力aey a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(pec^、 aZrt W7、力o7); #. h迈i/70ws sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(pec^); Ca7"力ri7 sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因。eW和peM)。通过基因工程方法，将七a6ae朋 sp.PCC7120中的W/Y^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-alr^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，禾U用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将M 7a迈/7 osiAS sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec^ (C155I)和 链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet中，所得质粒 叫pCOLADuet-幼-(C1551)，链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后， 在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和 素标记的脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力W和pe^9)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力W-peM，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因ss和脱辅基蛋白基因； ec^(C1551)拼接后连接到pCOLADuet的fcoR I和尸W I之间；裂合酶基因Wr^W7在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点^g^II和J力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o厶； eZ^和pe/^)，力W和/ e/^在同一个载体pCDFDuet-l 中，力o7在第一个多克隆位点Afco I和At I之间，peM在第二个多克隆位点vWe I和i7 o I 之间，pe^在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点《WII和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生
素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5 )将pETDuet—WrW77、 pC0LADuet_sa~/ ecMC155I) 、 pCDFDuet—力o7—peZ^禾口 pACYCDuet-;^M转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工 程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1腸1/L， 20。C至37 'C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋
白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，
可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例11
(1)从GeneBank中可以查到，藻种/!朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， #. h/w'/jos"s sp. PCC7603和Ca7"/ 77'x sp. PCC7601部分序列已经测定。^ a/ ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(/ ec仏a7/^W7、力o/); 必7柳i/7o^AS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(peci ); Ca7ot力rijr sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(peW和pe/^)。通过基因工程方法，将力朋6朋朋 sp. PCC7120中的a^^W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位点，将7a/M'/ ows sp. PCC7603中藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pec5和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆 于Novagen公司的pETDuet-1中第一位点，所得质粒叫pETDuet-幼-pec5 -aZr。W7，在大肠 杆菌中能表达beta裂合酶以及链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白。根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o/和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-/ o7-/ eZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因pec"拼接后连接到pETDuet的￡coR I和尸st I 之间，W/^W7处于第二个多克隆位点^^n和i7 oI之间；PEB合成酶基因是3个(力o厶 / eM和peM)，力o7和； e/^在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点vVco I和 尸"I之间，/ e/^在第二个多克隆位点A^e I和i7 o I之间，pe/^在pACYCDuet-1中第二个多 克隆位点《WI1和I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-sa^ec^alrt W7、 pCDFDuet-力o7-; e/^和pACYCDuet-pe^转入大肠杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培 养基中，37'C振荡培养至0D卿为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时， 生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞， 加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲 和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例12
(1)从GeneBank中可以查到，藻种」朋6a謹sp.PCC7120的全序列已经测定完成， Jayw'/7os"ssp. PCC7603和CaJ"力nisp. PCC7601部分序列已经测定。力朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因"ec仏alrW77、尨7a肌'770s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序列中找到所需基因(pec万)；6^"/ w';r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(peW和pe力5)。通过基因工程方法，将力朋&e朋sp. PCC7120中的alrt^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位点，将M h/w'/ os"ssp. PCC7603中藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pet^(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第一位点，所得质粒叫pETDuet-sa-pec^(C1551)-Wr^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶以及链霉亲和素和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o/和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-力W-; e/^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pe似，在大肠杆菌中能表达PebA。
即链霉亲和素基因和脱辅基蛋白基因pec^ (C155I)拼接后连接到pETDuet的fcoRI和At I之间，Wrf W7处于第二个多克隆位点《g7II和J力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o厶peM和pe/^)， Z o7和； e/^在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点Afco I和尸st I之间，peM在第二个多克隆位点We I和J7 o I之间，pe/W在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点^ 7II和Io I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-sa~/ ec5(Cl551)-aZr做77、 pCDFDuet-力o7-pe/^和pACYCDuet-转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯
得到相应的链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻红蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的beta裂合酶、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白、藻红胆素生物合成酶基因或其同源基因来制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了 GenBank中已公开全序列的蓝藻力;7a6ae/7a sp. PCC7120和已经部分测序的M h/MVwsM sp. PCC7603和Ca7"力ri;f sp. PCC7601为例对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容釆用其它原料实施本发明。
权利要求
1. 一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1)用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；(2)用基因工程方法，将藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因与链霉亲和素基因拼接后克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3)用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因ho1和pebB或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到ho1和pebB表达质粒；(4)用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到pebA表达质粒；(5)将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、ho1和pebB表达质粒及pebA表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。
2. —种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征 在于包括下述步骤(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基 因或其同源基因与链霉亲和素基因拼接后同时克隆于表达载体中，得到beta裂合酶和链霉亲 和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(2) 用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因力o7和pe/^或其同源基因克隆于第二 个表达载体中，得到力o7和； eZ^表达质粒；(3) 用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因peM或其同源基因克隆于第三个表达 载体中，得到pe^表达质粒；(4) 将beta裂合酶和链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、Ao7和peM表达质粒及 peW表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌， 应用此工程菌通过发酵工程生产链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；发 酵后，按常规蛋白质提纯技术，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白 类荧光蛋白质。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的beta裂合酶基因是指与力朋力ae朋sp. PCC7120中Wr。W7基因同源的基因。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因 是指与^ a6ae/ a sp. PCC7120或尨Ja/w'/Jos"s sp. PCC7603中pec5基因同源的基因。
全文摘要
本发明公开了一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素(PEB)的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻红胆素与链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质；本发明的方法应用生物过程生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。
文档编号C12N15/60GK101475951SQ20081002564
公开日2009年7月8日 申请日期2008年1月4日 优先权日2008年1月4日
发明者佟顺刚, 坤 夏 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司