专利名称：一种用于肿瘤基因治疗的重组单纯疱疹病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种采用重组单纯疱疹病毒来治疗肿瘤的基因治疗方法。
特别的，涉及一种定点缺失一包含ICPO， ICP4，和ICP34.5基因的重复区 段(IR)的缺陷型重组I型单疱渗病毒，及其在治疗肺瘤中的应用。本发 明进一步涉及含有上述病毒的药物組合物。
背景技术：
肿瘤是影响人类健康甚至危及生命的常见病、多发病，对肿瘤的治疗 通常是采用手术、放疗、化疗或中药治疗方案，但对中晚期肿瘤的疗效欠 佳。
自19卯年French Anderson等把腺嘌呤脱氨酶(ADA)基因成功地 治疗了 ADA缺陷病，开创了利用人基因治疗疾病的先例，最初基因治疗 仅用于基因缺陷的遗传性疾病(Anderson et al. ， Science, 1992)。随着基因 克隆技术的t艮和基因治疗的思路拓宽，人们又将人体基因应用于对肿瘤 的治疗。
随着肿瘤分子生物学研究的深入，发现肿瘤发生的分子机制是极其复 杂的，通常是因原癌基因的序列突变、移位、扩增和过度表达而导致异常 激活，或/和由于抑癌基因的突变、缺失而导致基因失活所致，从而引起 细胞的恶性增生和凋亡失控而致癌。但目前大部分肿瘤的基因治疗仍处于
初期阶段，仅有少数进入n/迈期临床试验。
肿瘤基因治疗中存在的主要问题是(1)肿瘤治疗所选择的治疗性基 因往往摆脱不了遗传缺陷病的基因治疗模式，治疗基因单一，难于完全纠 正肿瘤组织细胞中致瘤相关的多种基因异常，因此治疗效果不太理想。
(2)目前用于肿瘤基因治疗的载体均不同程度存在一些缺陷携带治疗 基因的质粒栽体，虽然操作方便也很安全，但转染效率低，治疗基因不能 获得长期稳定和有效的表达，其疗效受限；携带治疗基因的病毒栽体尽管 可克服质粒载体的一些缺陷，但也不同程度存在薄弱环节，早期常用的病 毒载体大多为复制缺陷型的腺病毒(AdV)和逆转录病毒(RV)。这类载 体的最大的问题是在肿瘤内的扩散性很差。由于病毒的体积和表面所带的 电荷，使之在肿瘤实体内物理扩散的能力极差，如果不能在肺瘤中自行 复制，则只能依靠"旁观者效应，，达到增加疗效的作用。正因上述原因， 目前肿瘤的基因治疗的临床疗效仍没有发生重大突破，大部分I期临床试 验结果只显示出较低的临床疗效，往往还需要借助联合放疗、化疗、手术 治疗等临床上常用的治疗方案方能增效。
针对上述非复制型病毒的不足之处，近几年来能够在胂瘤内特异性地 复制并造成肿瘤细胞裂解的融瘤型病毒已成为在基因的肿瘤治疗方面的发 展趋势。融瘤型病毒的特点是利用病毒栽体在肿瘤细胞中选择性的发生条 件性复制而裂解肿瘤细胞，病毒释放后又可通过的生物扩散而不断扩展融 瘤功效。因此选择性复制裂癌病毒载体的溶瘤作用在肿瘤治疗中可能比携 带治疗基因的病毒表达载体显得更加有效，具有更加良好的应用前景。病 毒只有在敏感细胞中借助细胞的翻译机器和能量才能大量复制，有些病毒 经组装后，可通过裂解的细胞而大量释放，并产生明显的细胞病理效应
(CPE)。随着病毒学和分子生物学的深入研究和发展，人们对肿瘤发生
的分子机理和病毒复制及调控的分子机制有了更深入的了解，进而通过自
然筛选(如呼肠病毒)和基因改造(如腺病毒、疱渗病毒)建立了用于杀
死癌细胞的裂癌病毒，使之能选择性地在肿瘤细胞中进行条件性复制，进
而仅对肿瘤细胞发生特异裂解，但对正常细胞不引起伤害。
人I型单纯疱渗病毒(HSV-1)属于疱渗病毒科，单疱病毒属，为
一种双链DNA病毒，常感染人的眼、口腔和面部皮肤粘膜，是一种肿瘤
基因治疗常用的融瘤型病毒载体。
HSV-1的基因组DNA (该基因组全序列NCBI序列号为NC_001806，
基因组全长152261bp)通过共价连接的长节段(L)和短节段(S)组成，在每 个节段的两端，含有反向重复序列，包括末端重复序列(TR)和内部重复 序列(IR)。通常，HSVDNA—旦ii^细胞核内，线状DNA就可通过两端 的末端重列(TR)连接形成环状，而在宿主细胞核内的病毒基因组则以 级联反应的方式表达病毒蛋白，根据基因表达时序的不同，HSV基因被 分为极早期(oc)、早期(P)和晚期(Y)基因。a基因在感染极早期转录，其 产物(如ICP4、 ICP27)共同调节P基因及一些Y基因转录，P蛋白主 要参与病毒核酸代谢，同时也是病毒复制所必需的，y基因又分为Yl、 Y 2， Y 1基因(如Y 34.5 )在感染相对早期表达，不依赖于病毒DNA合 成，而y2基因只在晚期表达，主要编码病毒的结构蛋白(Roizman B. The function of herpes simplex virus genes :a primer for genetic engineering of novel vectors[J.Proc Natl Acad Sci USA，1996 ，93 :11307 - 11312 )。
现有技术中，已有多个研究小组在HSV-1的^5*上构建了用于肿瘤 治疗的缺陷型单纯疱渗病毒载体。
裂癌HSV-1突变林(美国G207 )(由HSV-1F的R3616突变抹改造 而来)缺失Y34.5基因(编码10 34.5蛋白)，并在ICP6基因(编码病毒 核苷酸还原酶)的第二个BamHI位点插入LacZ标记基因，使ICP6基因 发生插入失活。该病毒毒力极低，在人神经元等正常细胞中不能复制增殖， 因此不损害人体正常细胞，但能在增殖活跃的恶性胶质瘤细胞中增殖，因 该瘤细胞由于增殖的活跃，可为该缺陷的病毒提供足够的外源性核苷酸还 原酶，弥补了病毒复制的缺陷而能在胞内大量增殖，最终导致恶性胶质瘤 细胞的裂解，并释放出大量病毒，并向周围细胞发生生物扩散，而不断扩 大裂癌效果(Toshihiro M， Samuel D R， Takahito Y，et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus - 1 for the treatment of malignant gliomas[J.Nat Med，1995 ，1 :938-940 )。
英国也构建了不同于美国G207的HSV-1 Y34.5缺失突变的1716株，
其与G207—样目前正在进行临床实验，1716林与G207二者的区别在于，
美国的G207是由HSV-1F的R3616突变林改造而来，其中含有ICP6和
Y34.5基因的双基因缺失，而且在ICP6区段插入了 LacZ基因，而英国
的1716是由HSV-1-17毒抹改造而来，1716是仅仅造成Y 34.5基因缺失，
ICP6没有缺失，也不携带任何外源基因，其毒性略高于G207，用于恶性
脑胶质瘤的I期临床试验的结果表明，使用剂量高达3xl(^Pfu时，仍无
明显的毒副作用出现(Rampling R， Cruickshank G， Papanastassiou V， et al.
Toxicity evaluation of replication-competent herpes simplex virus(ICP 34.5
null mutant 1716) in patients with recurrent malignant gliomaJ.Gene
Ther，2000，7:859國866;和MarkertJM， Medlock M D， Rabkin S D， et al.
Conditionally replicating herpes simplex virus mutant,G207 for the
treatment of malignant glioma :results of a phase I trialJ.Gene Ther
2000 ，7 :867-874 )。
近年来在中国也构建了既不同于G207也不同于1716的Brainwel裂
癌缺陷病毒(CN 1397642 A )，已用于治疗人脑胶质瘤的I期临床试验。
初步实验结果表明，Brainwel与G207和1716 —样在对人脑胶质瘤治疗
中是安全的。Brainwel是由HSV-1F林改造而来，其位于Y34.5基因两个
拷贝均已部分去除而失活，同时在ICP6基因区段也被部分去除并在
BamHI切点插入了 Endostatin和Angiostatin的抑制肿瘤血管形成的融合
基因，更优于G207。
但是，对于现有技术中已进入临床实验阶段的上述第一代用于肿瘤基
因治疗的重组单疱瘆病毒进行研究发现，无论是G207还是Brainwel株或
1716抹重组病毒，其均存在如下缺陷由于野生型HSV-1中存在一约15kb
的重复区段(Internal Repeat, IR )，该重复区段中包括ICP0， ICP4和
ICP34.5基因的重复基因序列，从而在野生型病毒中上述基因存都存在两
个拷贝(参见图1)，这造成有可能在病毒复制过程中出现重组现象，从
而出现基因表型不一致的情况。这种重组现象会严重影响病毒制剂的质
量稳定性和具有潜在的安全性隐患.为了克服上述现有技术中的重组单纯 疱渗病毒在肿瘤基因治疗中的缺陷，本发明人构建了一种全新的缺失型重 組单纯疱療病毒载体用于肿瘤的基因治疗。
发明内容
为了克服现有第 一代用于基因治疗的重组单疱渗病毒的上述缺陷，本 发明人构建了 一种新的用于基因治疗的单疱疹病毒栽体，所述栽体为 一定
点缺失一包含ICPO， ICP4,和ICP34,5基因的重复区段(IR)的缺陷型重 组I型单疱渗病毒，具有安全性高、结构稳定和溶瘤效果好的特点，可大 大改进目前单疱渗病毒基因治疗过程中的安全性问题。
在下文中，本发明人将所构建的新的单疱渗病毒载体命名为 HEPAWEL，并对其进一步详迷。
HEPAWEL的病毒基因组结构
HEPAWEL病毒是以I型单纯疱渗病毒(HSV-1) F林为骨架构建的 融瘤型病毒载体。该病毒的遗传特点是去除了病毒基因组中内重复区段 (Internal Repeat ， IR)大约15KB的DNA。该区段包含有HSV-1病毒 的ICPO, ICP4和ICP34.5基因，去除这一区段，使得重組病毒HEPAWEL 只包含有上述三个基因的各一个拷贝(图1为重组病毒HEPAWEL的基 因结构图)。图中野生型HSV-1的基因组中a-b与A-B以及c与C为两个 反向重复区，而UL和Us则为长非重复段和短非重复段，分别包含HSV-1
病毒其他基因的编码区。
HEPAWEL的病毒生物学特性
基于现有技术对HSV病毒基因组的基础理论研究表明，IR片段对 HSV-1病毒的复制不是必须的(Poffenberger， 1983; Meignier， 1988 )。去 除该区段后的重组病毒的基因组比野生型病毒的略短。特别是，在野生病 毒中，由于a-b和A-B以及c和C的重复序列的存在，在复制时不可避 免地出现重组而导致子代病毒是包含有具有不同方向的1^和Us区段的基 因表型的病毒的混合。在去除了 IR的重复序列之后，病毒在复制时不再
出现重组，呈现稳定的基因组结构。上述稳定的基因组结构有助于提高
HEPAWEL在肿瘤基因治疗中的安全性。 本发明的HEPAWEL的特点在于
首先HEPAWEL最重要的生物学特征是野生型病毒所携带的3个主 要的极早基因ICP0， ICP4和ICP34，5在HEPAWEL里各被去除了一个 拷贝，从而显著地降低了病毒的毒性，从而应用于人体基因治疗更安全。
其次，IR缺失的重组病毒作为融瘤病毒可用于肿瘤的治疗，如随后 具体实施例结果所示，无论在体内还是体外均具有良好的抑瘤效果。 HEPAWEL的IR基因缺失后还保存有野生型的ICP6基因，从而提高了 融瘤效果，使得病毒的效率大大提高而不影响安全性。
再次，去除IR片段的重組病毒结构由于去除了基因组内的重复区段， 因此结构更为稳定。在小鼠脑内接种后回到体外细胞培养，如此反复9次 传代后仍然保持原来的基因组结构，证明了其病毒基因组的高度稳定性。
再次，IR缺失重组病毒用于基因治疗优于目前用于临床的单疱病毒 载体。本发明的IR缺失重组病毒是属于第二代用于肿瘤基因治疗的单疱 病毒。最早在临床上用于肿瘤治疗的、目前均已iiX用于恶性脑胶质瘤治 疗的临床实验阶段的第一代融瘤单疱病毒例如，美国的G207，英国的 1716，其共同特点是都去除了病毒ICP34.5基因的两个拷贝。本发明的IR 缺失病毒(HEPAWEL)与上述第一代单疱融瘤病毒相比，最大的不同在 于只去除了 ICP34.5基因的一个拷贝。与G207等第一代病毒相比，本发 明的IR缺失病毒(HEPAWEL)还保存有野生型的ICP6基因。完全去 除ICP34.5和ICP6基因使得HSV病毒的毒性大大降低，但是同时其复 制能力也明显地低于野生型的病毒(McAuliffe， 2000; Bennett, 2002)。从 而理论上可以推定，本发明的HEPAWEL与第一代病毒相比具有更好的 融瘤效果。
最后，由于HEPAWEL重组病毒载体在重组构建时没有采用tk基因 而用了 GFP (绿色荧光蛋白)进行选择性标记，因此构建后HEPAWEL 病毒基因组本身的tk基因未发生变化。而在那些基因组tk基因被修饰的
重组病毒中，由于tk基因修饰后，低水平的tk表达会影响该病毒对 gancyclovir ( GCV )和acyclovir( ACV )的敏感性.Acyclovir和Ganciclovir 在临床上已实践多年，能有效地控制疱渗病毒感染，从而一旦临床基因治 疗失控，上述药物可有效的抑制病毒生长，从而中断感染，为进行基因治 疗的个体提供了进一步的安全防护。因此在临床治疗时如果需要控制病毒 的扩散而使用上述抗病毒药物时，HEPAWEL的安全有效性将大大提高。 因此从单疱病毒的安全性角度来说，HEPAWEL对GCV更敏感，从而安 全性更高。
具体而言，本发明涉及一种命名为HEPAWEL的重组单疱渗病毒， 其特征在于其特异性缺失了野生型HSV-1病毒基因组的第117071至第 131534g对的序列，从而使重组病毒中只包括一个拷贝的ICPO， ICP4， 和ICP34.5基因。
本发明还涉及一种构建重组单疱渗病毒的方法，其特征是，特异性缺 失了野生型HSV-1病毒基因组中的内部重复区段，从而使重组病毒中只 包括一个拷贝的ICP0， ICP4，和ICP34.5基因。
本发明还涉及一种如上文所述的构建重組单疱渗病毒的方法，其特征 在于
首先，将野生型HSV-1病毒的第114517碱基对的Sall到第117071 ^J^对的EcorRI之间2554bp片段，及第131534碱基对的EcoRI到笫 133520 4^对的Xhol之间1986bp片段分别克隆到pbluescriptKS的Sstl 和Xhol多克隆位点中构建成pKSdelIR质粒；
在质粒pKSdelIR的两个HSV片段中间的Notl切点上插入GFP表 达盒，构建成质粒pKSdelIRGFP;
将质粒pKSdelIRGFP与HSV-1病毒DNA，共转染的Vero细胞上， 挑选出表达GFP蛋白的绿色病毒蚀斑；
经3次纯化得到重组病毒HepaGreen;再将质粒pKSdelIR与重组病 毒HepaGreen 的病毒DNA共转染的Vero细胞；
从绿色病毒蚀斑挑选出无色病毒蚀斑，经纯化和鉴定为缺失了 IR的 HEPAWEL。
本发明还涉及一种以如上文所述的重组单疱病毒为骨架的携带其他外 源性基因的重組病毒，其包括能造成肿瘤细胞凋亡的基因，能抑制血管生成 的基因，以及能刺激免疫活性的基因。
本发明涉及一种如上文所述的重组单疱疹病毒在制备用于治疗肿瘤的 药物中的应用。
本发明还涉及一种用于治疗肿瘤的药物，其特征在于含有上文所述的 重組单疱渗病毒作为活性成分。
本发明还涉及一种如上文所述的重组单疱渗病毒在制备用于治疗肿瘤 的药物中的应用，其特征在于肿瘤治疗中可以通过各种给药途径，包括但 不限于全身静脉注射，局部肿瘤血管内给药以及肿瘤内给药方法。
本发明还涉及一种如上文所述的重组单疱疹病毒在制备用于治疗肿瘤 的药物中的应用，其特征在于肿瘤治疗中可与各种其他治疗手段的结合，包 括但不限于化学药物疗法，局部或瘤内放射疗法，免疫及其他生物制剂疗 法。
图1为野生型HSV-1和本发明构建的缺陷病毒HEPAWEL的基因图
谦；
图2为本发明的HEPAWEL与现有的几种缺陷病毒的基因图谱比较；
图3为本发明的HEPAWEL基因重组示意图4为鉴定治疗pKSdelIR的限制性内切酶图谱；
图5为重组病毒HepaG reen的荧光照片；
图6为重组病毒HEPAWEL的限制性酶切图镨；
图7为本发明的HEPAWEL的病毒复制性实验结果比较；
图8为本发明的HEPAWEL对GCV的敏感性实验结果；
具体实施例方式
除特别说明以外，本发明具体实施方案中所用的质粒、载体、酶及引
物均购自美国Gibco爿^司。
(一 )HEPAWEL的构建 实施例1 HSV-1核酸提取
取野生型HSV-1病毒F林(购买于Gibco公司，并于本室保存，其 基因组全序列和具体基因结构见NCBI,其NCBI序列号为NC一001806 ) 在MOI-l的条件下感染培养的Vero细胞。24-36小时后，待大部细胞呈 现细胞病变(CPE)时，收集细胞并转入15ml离心管离心去除细胞培养液。 加入0.3ml细胞裂解液(含:100Mm NaCl， 10Mm Tris.HCl pH 8.25Mm EDTA pH8和0.5。/。SDS)裂解感染细胞并用RNaseA (10mg/ml)65匸处理1 小时，上述裂解液先用等体积的酚再用等体积的酚/氯仿(l:l)混合液抽提， 含DNA的水相溶液转移到新的离心管后加入1/2体积的7.5M醋酸胺和2 倍体积的无水酒精，静置IO分钟后离心得到病毒DNA沉淀，用20-100ul Tris/EDTA緩沖液溶解后于4X:保存。
实施例2 IR片段的缺失
如图3所示，将基因组中笫114517碱基对的Sall到第117071威基对 的EcorRI之间2554bp片段，及第131534碱^i^的EcoRI到第133520 4^gjit的Xhol之间1986bp片段分别克隆到pbluescriptKS的Sstl和Xhol 多克隆位点中。构建成pKSdelIR质粒。
在质粒pKSdelIR的两个HSV片段中间的Notl切点上插入GFP表 达盒，构建成质粒pKSdelIRGFP。
将质粒pKSdelIRGFP与HSV-1病毒DNA，共转染的Vero细胞上， 挑选出表达GFP蛋白的绿色病毒蚀斑。经3次纯化得到重組病毒
HepaGreen。再将质粒pKSdelIR与重组病毒HepaGreen的病毒DNA共 转染的Vero细胞。从绿色病毒蚀斑挑选出无色病毒蚀斑，经纯化和鉴定 为缺失了 IR的HEPAWEL。
实施例3重组病毒的鉴定
如图4、 5和图6所示。经过显微镜下观察到重组病毒的绿色荧光， 和酶切检测验证，得到重組病毒，并将其保存。经基因組测序结果表明， 重组病毒HEPAWEL与野生型HIV-1序列相比较，缺失了第117071碱基 对到第131534 ^对之间的序列.
(二) HEPAWEL的复制性及安全性实验
实施例4 HEPAWEL的病毒复制性
纯化后的HEPAWEL病毒首先在培养的Vero细胞上用毒斑测定法滴 定，以确定病毒有效浓度，已知滴度的HEPAWEL和其他对照病毒林分别 用MOI=0.01感染在6孔培养i上培养的单层Vero细胞，感染后的细胞 每隔24小时收获一次，每种病毒每次收获各两孔，直至5天为止，收获的 细胞在冻融三次之后离心去除细胞残渣，含有病毒的上清液再次用Vero细 胞滴定，取当日收获的两孔细胞含病毒的平均值作为该日病毒的浓度。
实验结果如图7所示，实验结果说明本发明的HEPAWEL仍然保持 了与现有临床实验中使用的G207和F林相当的病毒复制能力。
实施例5 HEPAWEL对GCV的敏感性实验
HEPAWEL, G207和Brainwel林病毒分别以MOI=0.01的滴度感染 在含10%血清的DMEM培养液中正常生长的Vero细胞.分别在不加或加 有不同浓度的GCV的培养液中生长，在感染后48小时收获细胞并继而 进行毒斑滴定。
具体实验结果如图8所示。
由于gancyclovir ( GCV)在临床上已实践多年，用于治疗疱渗病毒 感染，从而一旦临床基因治疗失控，其可有效的抑制病毒生长，从而中断 感染，为进行基因治疗的个体提供了进一步的安全防护。本实验结果表明 HEPAWEL完全床留了野生型病毒HSV F林对GCV的敏感性，其安全 有效性大大高于重组病毒G207。
(三)HEPAWEL的抑瘤试验的结果 实施例6 HEPAWEL的体外抑瘤试验
试验方法如下将对数生长期细胞3><104个(H印G2生长緩慢，适当 加大细胞接种量，如3xl()5个)移入96孔板内，200fil/孔，5%C0237'C 培养24h，以使细胞长至覆盖瓶底约70%。小心吸去培养基，加入不同接 种滴度(0.0001-10的HEPAWEL 50fU /孔，以65°C 10min灭活的 HEPAWEL为对照，每滴度均设双复孔。5%<:0237'。孵育0.5h后，再加 入含2%小牛血清的培养基150nI/孔，用MTT法测定96h时各孔OD值。 测定前(92h时)加入MTT液(5mg/ml) 10jU，继续培养4h后加入细胞 溶解液100nl过夜，待结晶溶解后，于酶联免疫检测仪上570 nm波长测 定每孔吸光度(OD)。细胞生长抑制率=(对照组OD均值-实验组OD均 值)/对照组OD均值x100。/。。
将以上计算的抑制率与病毒滴度(pfu)值对应填入计算程序"IC50计算"，
计算HEPAWEL对不同细胞的半数抑制量(pfu值)。
部分结果
1. 对人胃癌BGC-823细胞抹，IC50=1745.9 pfu;
2. 对人大细胞肺癌NCI-H460细胞株，IC50=2334.4 pfu;
3. 对AA慢性髓源性白血病K562细^#， IC50=953.7 pfu;
4. 对人肝癌HepG2细胞林，IC50=3532.7pfu; 5，对人肝癌SMMC-7721细胞林，IC50=823.5 pfu;
以上Multiplicity of Infection(MOI,指病泰接种量与接种细胞的比值)约 在102—103。
上述体外实验结果说明，本发明的HEPAWEL在体外具有良好的抑 瘤效果，可非常有效的抑制肿瘤生长，具有良好的治疗前景。
实施例7 HEPAWEL的体内抑瘤实验
具体实验方法如下取对数生长期的S180、 H22细胞2xl(^个，每鼠 200|iU接种于同性别昆明种小鼠右腋窝下，约第四、五天肿瘤生长至体积 约为60-100mm3 (长度以游标卡尺量取，体积按0.5x长径x短径2计算) 时，将动物随机分组，分别通过瘤内多点注射或静脉注射给予HEPAWEL。 第十四天处死小鼠，剖取肺瘤称重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(对 照组肺瘤重量均值-实验组肿瘤重量均值)/对照組肺瘤重量均值 xlOO%。
QGY-7701细胞2x106个，每鼠200jal接种于雄性棵鼠右腋窝下，约 第20天肿瘤生长至体积约为60-100mm3 (长度以游标卡尺量取，体积按
0. 5.长径x短径2计算)时，将动物随机分组，通过瘤内多点注射给予 HEPAWEL。本次试验结果为第35天时的值。
肿瘤抑制率-(对照组肿瘤重量均值-实验组肿瘤重量均值)/对照组肿 瘤重量均值xl00。/。。
1. S180瘤抹
瘤内多点注射，隔天给药一次共3次，lxl07pfu/mouse，抑瘤率70.9%;
2. H22瘤林瘤内多点注射，隔天给药一次共3次。
a. lxl07pfu/mouse，抑瘤率60.4%;
b. 5xl04pfu/mouse，抑瘤率42.9%;
c. lxl04pfu/mouse,抑瘤率31.4%;
3. H22瘤林瘤内多点注射。
a. 每3天给药一次共3次，lxl07pfu/mouse，抑瘤率53.3%;
b. 每7天给药一次共2次，lxl07pfu/mouse，抑瘤率44.4.0%; 4. H22瘤林尾静脉注射，隔天给药一次共3次。
a. 5xl07pfu/mouse，抑瘤率68.0%;
b. 5xl04pfu/mouse，抑瘤率30.7%;
c. lxl()4pfu/mouse，抑瘤率24.5%;
5. H22瘤林尾静脉注射。
a. 每3天给药一次共3次，lxl07pfu/mouse,抑瘤率26.0%;
b. 每7天给药一次共2次，lxl07pfu/mouse，抑瘤率22.5%;
6人体肝癌QGY-7701
接种棵鼠，瘤内多点注射，隔天给药一次共三次，lxl07pfu/mouse,抑瘤 率79.3%;
上述体内实验结果说明，本发明的HEPAWEL重组病毒在体内也完全具 有良好的抑瘤效果。
(四)HEPAWEL的毒性试验的结果 豚鼠为腹腔注射，模拟临床肝内介入治疗；兔为静脉注射，模拟临床 静脉给药方案。给药周期三个月，每周给药1次。免疫毒性试验、刺激、 过敏和溶血试验实验结果表明HEPAWEL对豚鼠和兔的毒性非常低。是 一种安全性很高的重组病毒。
参考文献 Anderson WF. Human gene therapy[J]. Science, 1992,256:808 Thomas C.E，Ehrhardt,A, Kay,M.A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene
therapy [J],Nat Rev Genet, 2003,4:346-358. [3] Hirschowitz， E.， Hidalgo, G.， Doherty, D. Induction of cyclooxygenase-2 in non-small cell lung
cancer cells by infection with DeltaEl， DdtaE3 recombinant adenovirus vectors[J]. Gene 7Tze -,
2002,9:81-4. Ma, H.I., Lin, S.Z.， Chiang, Y.H. et al. Intratumoral gene therapy of malignant brain tumor in a rat model with angiostatin delivered by adeno-associated viral (AAV) vector[J]. Gewe 2002,9:2-11. Kubo， H., Gardner, T.A.， Wada, Y., et al. Phase I dose escalation clinical trial of adenovirus vector carrying osteocalcin promoter-driven herpes simplex virus thymidine kinase in localized and metastatic hormone-refractory prostate[J] Cancer.7/ww Gew TTzer, 2003，14:227-41. Trudd， S., Trachtenberg, J.， Toi, A., et al, A phase I trial of adenovector-mediated delivery of interleukin-2 (AdIL-2) in high-risk localized prostate cancer[J]. Q wcer(7ewe TTzer, 2003， 10:755-63. Vasey， P.A.， Shulman， L.N,， Campos， S,， et al. Phase I triaof intraperitoneal injection of the ElB-55-kd-gene-deleted adenovirus ONYX-015 (dll520) given on days 1 through 5 every 3 weeks in patients with recurrent/refractory epithelial varian cancer[J], t/C7Z" (9wco/， 2002,20:1562-9. Post, L.E. Selectively replicating adenoviruses for cancer therapy: an update on clinical development[J]. Cw/r (9/ /" /"v柳.gZ)rag^， 2002,3:1768-72， Stolberg S G. The biotech death of Jesse Gelsinger[J] . N Y Times Mag ,1999 ,28 :136-140,149-150. Li Z，DuIlmann J ，Schiedlmeier B ，Schmidt M， et al. Murine leukemia induced by retroviral gene
marking[J] . Science ，2002 ，296:497. [11] Marshall E. Clinical research. Gene therapy a suspect in leukemia-like disease[J]
Science ，2002 ，298 :34-35. [12〗Marshall E. Gene therapy. Second child in French trial is found to have
leukemia[J] .Science ,2003，299:320. [13] Wildner O. Oncolytic viruses as therapeutic agents[ J]. Ann Med, 2001,33:291-304 [14] Norman K L，Farassati F ， Lee P W K. Oncolytic viruses and cancer therapy[J].
Cytokine&Growth Factor Rev ，2001 ,12:271-282 [15 ] Smith R R， Huebner R J, Rowe W P ，et al. Studies on the use of viruses in the treatment of
carcinoma of the cervix[J]. Cancer，1956，9:1211-1218 [16] Bishoff J R， Kim D H， Williams A， et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in
p53-deficient human tumor cells[J]. Science ,1996 ，274 :373-376 [17] Kirn D .Oncolytic virotherapy for cancer with the adenovirus dll520( Onyx-015 ) :results of
phase I and II trials[J]. Expert Opin Biol Ther，2001 ，1 :525-538 [18]Willian Jia, Qun Zhou. Viral Vector for cancer Gene Therapy: viml dissemination and tumor
targeting[J], Current gene therapy. 2005,5(1):1画10 [19] Rochlitz， C.， Figlin， R.， Squiban， P， et al. Phase I immunotherapy with a modified vaccinia virus
(MVA) expressing human MUC1 as antigen-specific immunotherapy in patients with MUC1-
positive advanced cancer[J]. t/Gewe她d, 2003, 5:690-9. [20] Yu， D.C., Chen， Y., Dilley， J., ，et al. Antitumor synergy of CV787,a prostate cancer-specific
adenovirus, and paclitaxel and docetaxd[J].Cawer 2001,61:517-25. [21] Ron R, Eric R S ， Ho Y L， et al. Prostate attenuated replication competent adenovirus( ARC A)
CN706 :a selective cytotoxic for prostate -specific antigen-positive prostate cancer cells[J].Cancer
Res,1997，57:2559-2563 [22] Hamada, K.， Kohno， S.， Iwamoto， M， et al. Identification of the human IAI.3B promoter
element and its use in the construction of a replication-selective adenovirus for ovarian cancer
therapy[J]. 2003,63:2506-12. [23] Mizuguchi H， Koizumi N， Hosono T, et al. A simplified system for constructing recombinant
adenoviral vectors containing heterologous peptides in the HI loop of their fiber knob[J] ,Gene
Ther,2001 ，8:730、735 Helen R, Chad E G， Joseph Z ，et al. Modification of an adenoviral vector with biologically
selected peptides :a novel strategy fox gene delivery to cells of choice[J] . Human Gene
Ther,1999 ,10 :2615-2626 [25] Harari O A, Wickham T J,Stocker C J，et al. Targeting an adenoviral gene vector to cytokine-
activated vascular endothelium via E selectin[J] . Gene Ther ，1999 ，6 :801-807 [26] Fisher K D， Stall wood Y， Green N K,et al. Polymer-coated adenovirus permits efficient
retargeting and evades neutralizing antibodies[J].Gene Ther，2001,8:341-348 Wesseling J QBosma P J， Krasnykh V,et al .Improved gene transfer efficiency to primary and
established human pancreatic carcinoma target cells via epidermal growth factor receptor and
integrin-targeted adenoviral vectors [J] . Gene Ther，200I ,8 :969-976 [28] Bierma皿V， Volpers C,Hussmann S ,et al. Targeting of high-capacity adenoviral vectors[J].
Hum Gene Ther，2001,12:1757-1769 [29] Hashiro QLoh P C ， Yau J T. The preferential cytotoxicity of reovirus for certain tranformed cell
lines[J] Arch Virol, 1977,54:307-315 [30] No腿nKL,LeePWK. Reovirus as a,el oncolytic agent[ J] ,J Clinlnv,2000，105:1035-1038 [31] Duncan M R,Stanish S M,Cox D C.Differential sensitivity of normal and transformed human
cells to reovirus infection[J]. J Virol， 1978,28:444-449 [32] Mundschau L J，Faller D V, Endogenous inhibitors of the dsRNA-dependent eIF — 2 alpha
protein kinase PKR in normal and ras-transformed cells[J] . Biochimie，1994 ，76 :792-800 [33] Wilcox M E， Yang W,Senger D,et al .Reovirus as an oncolytic agent against experimental human
malignant gliomas[J] .JNatl Cancer Inst.2001 .93:903-912 [34] Roizman B, The function of herpes simplex virus genes :a primer for genetic engineering of
novel vectors[J] . Proc Natl Acad Sci USA, 1996 ，93 :11307 — 11312 [35] Toshihiro M， Samuel D R， Takahito Y，et al. Attenuated multirnutated herpes simplex virus —
1 for the treatment of malignant gliomas[J].Nat Med,1995 ，1 :938-940 [36] Walker J R，McGeagh K G，Sundaresan P， et al . Local and systemic therapy of human prostate
adenocarcinoma with the conditionally replicating herpes simplex virus vector G207[J]. Hum Gene
Ther，1999，10:2237-2243 Oyama M ， Ohigashi T， Hoshi M， et al.Oncolytic viratherpy for human prostate cancer by con 由tionally replicating herpes simplex virus 1 vector G207[J] . Jpn J Cancer Res ，2000 ，91 :1339-1344. Oyama M， Ohigashi T， Hoshi M, et al Antravesical and intravenous therapy of human bladder
cancer by the herpes vector G207[J]. Human Gen Ther,2000,11 :1683-1693 [39] Todo T， Martuza R L， Rabkin S D, et al .Oncolytic herpes simplex virus vector with enhanced
MHC class I presentation and tumor cell killing[].Proc Natl Acad Sci USA,2001 ，98:63%-6401 [40] Chahlavi A， Todo T， Martuza R L ，et al. Replication-competent herpes simplex virus vector
G207 and cisplatin combination therapy for head and neck squamous cell carcinoma[J] . Neoplasia
1999,1:162-169 Bradley J D， Kataoka Y，Advani S ,et al .Ionizing radiation improves survival in mice bearing intracraninal high-grade gliomas injected with genetically modified herpes simplex virus[J] . Clin Cancer Res， 1999,5:1517-1522 Rampling R,Cruickshank G， Papanastassiou V， et al. Toxicity evaluation of replication-competent herpes simplex virus(ICP 34.5 numutant 1716) in patients with recurrent malignant glioma[J]. Gene Ther,2000，7:859-866 Markert J M， Medlock M D，Rabkin S D， et al. Conditionally replicating herpes simplex virus mutant, G207 for the treatment of malignant glioma :results of a phase I trial[J]. Gene Ther 2000 ,7 :867-874 Miyatake， S,I,, Tani， S.， Feigenbaum， F.， et al, Hepatoma-specific antitumor activity of an albumin enhancer/promoter regulated herpes simplex virus in vivo[J]. Gewe 77^/% 1999,6:564-72. Nakamura， H.，殳asuya， H.， Mullen, J.T， et al. Regulation of herpes simplex virus gamma(1)34.5 expression and oncolysis of diffuse liver metastases by Myb34,5[J]. JC7Z; /"veW, 2002,109:871-82. Carew J F， Kooby D A，Halterman M W, et al. A novel approach to cancer therapy using an oncolytic herpes virus to package amplicons containing cytokine genes[J],Mol Ther,2001 ，4:250陽 25权利要求
1、一种命名为HEPAWEL的重组单疱疹病毒，其特征在于其特异性缺失了野生型HSV-1病毒基因组的第117071至第131534碱基对的序列，从而使重组病毒中只包括一个拷贝的ICP0，ICP4，和ICP34.5基因。
2、 一种构建重组单疱渗病毒的方法，其特征是，特异性缺失了野 生型HSV-1病毒基因组中的内部重复区段，从而使重组病毒中只 包括一个拷贝的ICP0， ICP4，和ICP34.5基因。
3、 如权利要求2所述的构建重组单疱渗病毒的方法，其特征在于 首先，将野生型HSV-1病毒的第114517碱^j"的Sall到第11707144&对的EcorRI之间2554bp片段，及第131534碱基对的EcoRI到第 1335204^JJ寸的Xhol之间1986bp片段分别克隆到pbluescriptKS的Sstl 和Xhol多克隆位点中构建成pKSdelIR质粒；在质粒pKSddIR的两个HSV片段中间的Notl切点上插入GFP表 达盒，构建成质粒pKSdelIRGFP;将质粒pKSdelIRGFP与HSV-1病毒DNA，共转染的Vero细胞上， 挑选出表达GFP蛋白的绿色病毒蚀斑；经3次纯化得到重组病毒HepaGreen;再将质粒pKSdelIR与重组病 毒HepaG 的病毒DNA共转染的Vero细胞；从绿色病毒蚀斑挑选出无色病毒蚀斑，经纯化和鉴定为缺失了 IR的 HEPAWEL。
4、 一种以如权利要求1所述的重组单疱病毒为骨架的携带其他外源 性基因的重组病毒，其包括能造成胂瘤细胞凋亡的基因，能抑制血管生成 的基因，以及能刺激免疫活性的基因。
5、 权利要求1所述的重组单疱疹病毒在制备用于治疗肿瘤的药物 中的应用。
6、 一种用于治疗肿瘤的药物，其特征在于含有权利要求1所述的重组单疱渗病毒作为活性成分。
7、 权利要求5所述的重组单疱疹病毒在制备用于治疗肿瘤的药物中 的应用，其特征在于肺瘤治疗中可以通过各种给药途径，包括但不限 于全身静脉注射，局部肿瘤血管内给药以及肿瘤内给药方法。
8、 权利要求5所述的重组单疱疹病毒在制备用于治疗肿瘤的药物中 的应用，其特征在于肿瘤治疗中可与各种其他治疗手段的结合，包括 但不限于化学药物疗法，局部或瘤内放射疗法，免疫及其他生物制剂 疗法。
全文摘要
本发明涉及一种采用重组单纯疱疹病毒来治疗肿瘤的基因治疗方法。特别的，涉及一种定点缺失一包含ICP0，ICP4，和ICP34.5基因的重复区段(IR)的缺陷型重组I型单疱疹病毒，及其在治疗肿瘤中的应用。本发明进一步涉及含有上述病毒的药物组合物。与现有的重组单纯疱疹病毒相比，本发明的重组病毒具有稳定性、安全性高，抑瘤效果好的特点。
文档编号C12N7/00GK101338302SQ20081002543
公开日2009年1月7日 申请日期2008年5月4日 优先权日2008年5月4日
发明者瞿伯荣 申请人:罗益(无锡)生物制药有限公司