专利名称：mRNA茎环结构探针及其制备方法以及它在EMSA中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种mRNA茎环结构探针及其制备方法，以及它在 EMSA中的应用。
背景技术：
无论是真核细胞还是原核细胞，mRNA不仅含有遗传信息，而且含有调控元件。已经发现，调控元件位于5'端或3'端非翻译区(UTR)，由局部区域形成的双链结构，呈"发夹型"(hairpin)结构，也称为"茎环结构"(stem-loop)。不同的调控元件参与不同功能的调节。细胞中含有相应的特异结合蛋白，称为RNA结合蛋白(RNA-binding proteins),它在与靶mRNA上特异的茎环结构结合后，对mRNA的稳定性(半衰期)及其蛋白翻译的启动或肽链的引伸等过程发挥重要的调节作用，从而调控蛋白合成或表达水平，这种现象属于转录后调节(posttranscriptional regulation)。这种调节在细胞生理稳态或病理情况下发挥重要的调节作 用。由于mRNA中存在的茎环结构在细胞中发挥重要的调节作用，目前研究的焦点是，第一 方面是，对茎环结构进行研究，包括研究哪些mRNA存在茎环结构，或同一种mRNA存在 多少以及什么样的茎环结构；第二方面是针对已知的茎环结构，研究细胞内是否存在特异的 RNA结合蛋白；第三方面是，对于已知的茎环结构及其在细胞内特异的结合蛋白，进一步研 究两者之间相互作用的特点、功能和意义。对于上述研究的第二和第三方面，涉及两个关键 性技术一个关键性技术是，需要设计和制备一种RNA探针，它是含有茎环结构特异序列的带 有标记信号的RNA片段。当用于上述第二方面的研究时，通过探针与细胞蛋白提取液孵育， 可寻找或筛选细胞内可能存在的结合蛋白，或通过探针与目前已知某种茎环结构的结合蛋白 进行结合反应，可以了解与该探针相应的茎环结构是否也是己知的结合蛋白的耙点。当用于 上述第三方面的研究时，所制备的探针与其结合蛋白进行孵育，可以是对相互作用的特点进 行分析，也可以是用于观察不同生理情况下或病理情况下对结合蛋白的改变进行检测分析。 此外，在上述第二或第三方面的研究中，有时还需要针对茎环结构特异序列设计突变的RNA 片段，用于观察结合反应的特异性或用于对茎环结构中蛋白结合位点的观察。另一个关键技术是，要使标记的探针与蛋白在合适的条件中孵育，进行特异的结合反应， 并采取适当措施将探针一蛋白复合物与游离的即未与蛋白结合的探针进行分离，从而对所形 成的复合物进行分析和检测。凝胶电泳迁移方法(Electrophoretic mobility shift assays, EMSA) 或其延伸的凝胶电泳超迁移方法(Electrophoretic mobility supershift assays, EMSSA)是一种检 测蛋白质和核酸相互结合或相互作用的理想技术，能够有效地实现探针一蛋白复合物与游离 探针分离，并具有操作简单、价格低廉、可以用于定性和定量观察等优点，因此，该技术不 仅在DNA及其结合蛋白的相互作用中得以广泛应用，在RNA与其结合蛋白的研究中也成为 优先使用的技术。上述两方面的关键性技术是相辅相成的。对于探针的设计、合成和标记等一系列方面、 结合反应体系的组成和条件、检测分析方法，需要统筹考虑。例如，探针的结构决定了与蛋 白反应的特异性，而这种特异性结合的实现，需要合适的结合反应体系的组成和反应条件， 此外，探针的标记方法的选择决定了相应的检测方法及检测的灵敏度。因此，尽管EMSA技 术本身上面提到的若干优点，但是，在具体操作中实验结果常常很不理想，表现为反复失败， 实验观察的重复性差等现象，其主要原因是来自于探针制备方法的选择及其决定的反应体系和检测方法等方面存在的问题。当前在研究mRNA茎环结构及其结合蛋白方面所采用的相关技术用于研究mRNA茎环结构及其结合蛋白的RNA探针的制备方法，有别于核酸杂交技术 中所使用的RNA探针。 一方面，这种探针具有茎环结构并用于与结合蛋白发生结合反应，不 同于在核酸杂交(RNA-DNA或RNA-RNA)试验中用于与DNA或RNA结合的RNA单链探 针，另一方面，探针中的茎环结构要能够与特异的结合蛋白的特异位点结合，因此，探针不 仅要呈现与mRNA中目的茎环结构相同，才能在体外重建与细胞内发生的该茎环结构与结合 蛋白的特异性结合，从而用于研究mRNA与结合蛋白的相互作用，或者用于特异性检测结合 蛋白。此外，由于这种探针属于RNA单链片段，又容易被环境中的RNase水解，因此，在 设计、制备和贮藏等方面受到很多方面的限制，往往难以借用于DNA-蛋白相互作用及其相 关检测中DNA双链或单链探针的设计和制备方法。当前采用的方法(RNA探针的制备方法、 靶核酸的检测方法以及RNA探针的制备试剂盒，专利申请号02122265.7，公丌号CN1405325,
公开日2003.03.26) (M. J. Rincker, S. L. Clarke, R. S. Eisenstein, J. E. Link, and G M. Hill-Effects of iron supplementation on binding activity of iron regulatory proteins and the subsequent effect on growth performance and indices of hematological and mineral status of young pigs. J Anim Sci. 2005, 83:2137—2145) (H. A. Barton, R.S. Eisenstein, A. Bomford叫d H. N. Munro. Determinants of the interaction between the iron-responsive element binding protein and its binding site in rat L-ferritin mRNA. J Biol Chem, 1990， 265(12):7000陽7008.)及其存在的主要问题是(1) RNA探针的设计和合成方法当前普遍采用的是体外转录合成单链RNA探针，可以是采用克隆技术合成，也可以是 由公司最近所推出的试剂盒进行体外转录合成。无论是前者还是后者，其原理均是利用T7 或T3等启动子，在依赖于DNA的RNA聚合酶的作用下，以四种rNTP为底物，以cDNA 为模板在适当条件下合成RNA片段。在上述技术中，需要根据RNA的序列预先合成高纯度 的DNA模板，若模板中混杂其他DNA片段，则会产生干扰。在克隆技术中，尽管可以在一 次克隆后可随时合成，但是，其后的每次合成和纯化等一系列操作复杂，价格比较昂贵，如 果对载体的酶切作用不完全或不当，则在探针合成过程中超螺旋DNA可合成极长的RNA， 从而有可能带上质粒的序列而降低探针的特异性。应用试剂盒体外转录法，虽然克服了该问 题，但是，价格也昂贵。此外，由于RNA对RNase特别敏感，即使对所用的器皿试剂等处 理以及对操作严格控制，在制备RNA探针过程中的降解和探针不宜长期保存甚至成为不可避 免的缺点。(2) RNA探针的标记方法当前普遍采用的是在上述体外转录反应体系中加入经放射性同位素标记的NTP，从而在 探针合成过程中同时对探针进行放射性同位素标记。从标记效果考虑，这种在RNA合成期间 实现标记的方法属于高效标记，以放射性同位素作为标记物又具有灵敏度高的特点。但是， 放射性同位素的应用不仅涉及价格昂贵、半衰期短、实验室安全和放射性废物处理等诸多问 题，而且对于实验结果的检测必须依赖于应用胶片曝光等方法进行放射自显影，既耗时长， 又难以进行定量分析。尽管放射性同位素标记法存在很多的局限性，但是，到目前为止还没有发现应用非同位 素标记法尤其是荧光直接标记法标记茎环结构RNA探针的报道。事实上，非同位素标记如化 学致发光、地高辛标记、生物素标记等技术已经得到广泛应用，但主要应用于核酸杂交试验 中RNA探针或DNA探针的标记，或用于DNA-蛋白相互作用中DNA探针的标记，或用于 RNA与核因子相互作用中RNA的标记。荧光标记法是较为理想的标记方法，但目前主要应 用于PCR、报告基因分析等技术中，也有用于DNA—结合蛋白相互作用观察中DNA探针的标记。既然应用非同位素标记法尤其是荧光标记法有其明显的优点，那么，为什么没有应用 于茎环结构RNA探针的标记，其原因不清楚。可能的原因是，或许是考虑到在体外转录合成 探针期间可以同时进行放射性同位素标记，或许是担心某些非同位素标记可能影响茎环结构 与蛋白的结合，也有可能是由于非同位素标记的灵敏度低，不易检测。(3) EMS A如前已述及，尽管EMSA试验本身比较简单，但是影响因素很多，涉及探针制备、反应 体系的优化及EMSA技术本身存在很多环节，往往或者不出现核酸一蛋白复合物条带，或者 在出现核酸一蛋白复合物条带的情况下，背景不清晰。这些问题是在核酸杂交和DNA—蛋白 相互作用研究中普遍存在的问题，在这方面，不少公司因此采取了不同的标记方法并推出了 各种EMSA试剂盒。而在有关RNA—蛋白相互作用时所面临的上述问题更为明显，尽管使用 放射性同位素标记法标记探针具有极高的灵敏度，但仍然需要花费很多的时间去优化结合反 应条件和凝胶电泳的条件。综上所述，当前对于mRNA—蛋白相互作用远不及DNA-蛋白或核酸杂交的^f究那样广 泛，但由于这种相互作用在细胞蛋白表达水平的重要调节作用，研究潜力巨大。探针的制备 尤其是具有茎环结构的探针的设计、合成和标记以及EMSA反应条件等方面的优化是当前需 要解决的瓶颈。发明内容针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种mRNA茎环结构探针，及其 在设计、合成和标记方法方面进行优化，使探针在EMSA中与结合蛋白的结合反应达到高特 异性、高稳定性和有利于定量检测的要求。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是 一种mRNA茎环结构探针，其特征在于， 由以下方法制得根据目的茎环结构的核酸序列，采取化学合成法直接合成核酸序列长度不 超过70nt的探针，然后采用荧光标记法对探针进行标记。上述mRNA茎环结构探针的制备方法是根据目的茎环结构的核酸序列，采取化学合成法 直接合成核酸序列长度在不超过70n的探针，然后采用荧光标记法对探针进行标记。其中，RNA探针的序列与长度的设计毫无疑问，RNA探针应当是与所要研究的mRNA 中目的茎环结构的核酸序列相同。对于核酸序列的长度，在不同的报道中不尽相同，包括几 十到上百个核苷酸。本发明主要策略是，限制探针的核酸序列长度，与所要研究的mRNA中 目的茎环结构的核酸序列的长度相同或相近。核酸长度控制在70nt或70nt以下， 一般在10nt 一50nt之间即可。如果mRNA中目的茎环结构的核酸序列较短，则在其茎环结构区邻近两侧 做适当的延长，如果mRNA中目的茎环结构的核酸序列较长，可将茎环的茎适当縮短。所说的RNA探针的合成方法，以体外直接化学合成单链RNA片段方法取代一直沿用的体 外转录技术。 一方面，可严格控制RNA探针的长度，达到设计的要求，另一方面，不仅合成 简单、错误率低，而且价格低廉。关于RNA探针的标记，以荧光标记物取代普遍使用的放射性同位素标记法，最好是采取 末端直接标记法，对RNA探针的5'端或3'端标记，不仅可获得高标记效率的探针，并且尽 量避免对蛋白结合的位点的影响。本发明推荐优先应用FAM (6-羧基荧光素)标记探针的5' 端。本发明方法制备的探针可以应用于以下情形之一①针对RNA中已知的茎环结构及其特异结合蛋白，研究其相互作用及其改变。例如，为了研究其相互作用的特点及其在不同生理情况下或病理情况下的变化和意义， 设计特异的RNA探针并作荧光标记，通过探针与特异结合蛋白，可观察结合反应的特点或变 化，或检测结合蛋白含量的变化。在研究特异结合部位或观察基因突变的影响时，还可根据 茎环结构中碱基位点的突变设计相应的探针，观察特异结合的改变。② 针对潜在的茎环结构，证明是否特异调控元件，筛选或证实其特异结合蛋白例如，在利用生物信息学手段搜索RNA序列或其他任何手段所获得RNA中可能存在的 茎环结构时，构建具有相应茎环结构的探针并作荧光标记，通过与已知的RNA结合蛋白进行 结合反应，可用于证明是否属于功能相关的调控元件，或通过与细胞蛋白提取液孵育，观察 细胞内是否存在相应的结合蛋白， 一旦发现存在特异结合反应，不仅可用于判断是否属于调 控元件，而且可利用这种探针作为相应结合蛋白的提取、分离纯化和鉴别中的检测工具。③ 可以是真核细胞和原核细胞或组织，其中任何一种有关上述①②的研究和检测。④ 可以是在基因工程技术中利用RNA与其结合蛋白相互作用的有关检测。 可以是用于实验室研究检测，也可以是用于临床相关疾病的体外诊断性检测。⑥ 优先应用于EMSA及其延伸方法如EMSSA、双向电泳或作为Western blotting的前处 理。也可能用于ELISA或蛋白芯片的RNA与蛋白之间的杂交。⑦ 本技术也可延伸到具有茎环结构的DNA与其结合蛋白相互作用的研究和检测。 本发明还提供了上述方法制备的探针在EMSA中的应用。蛋白样品可以是纯化的蛋白，部分纯化的蛋白，或细胞提取液。由于探针长度较短，为避免非特异结合的增加，在探针一 蛋白结合反应体系中适当增加肝素浓度或BSA浓度，并适当降低凝胶的交联度，推荐使用 8。/o非变性聚丙烯酰胺凝胶(60: 1)。本发明具有以下有益效果① 探针制备的价格低廉。由于探针片段短，可在核酸合成仪上直接合成，荧光标记方便，合成并荧光标记20D的这种探针，按照当前的价格计算，大约在800元左右，相当于当前应 用体外转录合成和同位素标记所需经费的10%以下。② 探针的制备方便。可随时在核酸合成仪上合成，荧光标记简单。而体外转录合成法不 仅需要应用克隆技术，而且在其后的每次转录时耗费时间长，对实验室条件要求高，由于操 作复杂， 一般需要一周左右的时间才能完成。③ 探针的可贮藏时间长。这种既是短小的RNA探针，又由于是茎环结构对RNase有对 抗能力，因此，以RNA干粉方式低温保存(例如一20'C)的标记探针可以保存一年。相比较 而言，放射性同位素标记的探针由于所使用同位素的半衰期很短，只能在几天内使用。④ 探针的特异性高、灵敏度高。由于采取与体内茎环结构的核酸序列相同或相近的长度， 茎环结构不存在或具有较短的尾巴，又采用5'端标记不影响探针的蛋白结合位点，因此，探 针的特异性较高。由于采用荧光标记技术，所标记的探针要比化学发光标记法具有较高的灵 敏度。此外，还避免了当前普遍采用的放射性同位素标记技术所面临的实验室安全和对同位 素的垃圾处理的问题。⑤ 满意的信噪比。实验已经证明，可获得清晰的背景和理想的特异条带。⑥ 可获得稳定的实验结果。由于探针的特异性、荧光的高灵敏度及其极高的标记效率、 直接合成的探针具有纯度高、长度一致等特点，大幅度改善了 EMSA的实验结果，EMSA不仅 具有很高的成功率，而且提高了实验结果的稳定性和可重复性。⑦便于定量分析并能实现实验结果的标化。应用荧光扫描仪直接扫描，避免了放射自显 影在定量方面的不足。由于荧光标记效率高，荧光信号强度又与被检测物浓度具有良好的线 性关系，探针分子量趋于一致，此外，在EMSA中的电泳期间，可选择一个空白泳道，加入己 知量的标记探针，在EMSA完成后与样品泳道同步荧光扫描，以此为marker,不仅可以消除 由于电泳条件本身以及独立实验之间由于图像分析软件中背景设定差异对分析结果的影响， 从而可对样品进行绝对定量。上述这些优势还可对不同实验之间以及不同实验室之间对实验 结果进行标准化(Normalization)处理。
图1是非变性凝胶的浓度对结果的影响。图2是结合反应体系中蛋白加样量对结果的影响。图3是饱和试验的结果。图4是结合反应中BSA加入的重要性。图5是蛋白样品制备中不同离心速率对结果的影响。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理解的 含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只 是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试 剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂 如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。 实施例一对于mRNA—蛋白相互作用的研究，较早丌展也是当前研究较为深入的是mRNA中铁反 应元件(Iron-responsive elements, IRE)与胞质中含有的铁调节蛋白(Iron-regulatory protein, IRP)的相互作用。研究已经清楚，转铁蛋白受体、二价阳离子转运体DMT1的IRE位于3， 端UTR，而铁蛋白(包括L型和H型)、S —氨基_ y —酮戊酸合成酶(ALAS)和ferroportinl 位于5，端UTR。在铁缺乏时，IRP与这些mRNA中的IRE结合，从而增强转铁蛋白受体和二 价阳离子转运体DMT1的mRNA的稳定性，并抑制铁蛋白ALAS和ferroportinl的mRNA的 蛋白翻译，而当铁过多时IRP与这些IRE解离，对mRNA发生相反的影响。因此，IRE-IRP 的相互作用在细胞铁摄入、铁贮存、铁利用和铁释放中发挥关键性的调节作用。IRE—IRP的 相互作用广泛存在于真核和原核细胞，研究己经发现，人类大约有70多种mRNA含有IRE。 目前还发现APP (amyloid precursor protein)和酒石酸盐拮抗性酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase)的表达也通过5'UTR端IRE接受铁状态的调控，K-C1复合转运体(红细胞特异)、 氨基肽酶A(降解铁转运相关蛋白)、Hexokinase III(信号转导途径)、MRP(multi-drug resistance associated protein)、禾n Uracil DNA glycosylase (参与DNA合成)等mRNA也含有IRE，从而 与参与细胞不同铁状态下的功能改变。实际上，最近的研究还发现IRE不仅与铁代谢调控，而且涉及其他微量元素代谢的调节。以IRE—IRP相互作用为例，采用本发明中探针制备及应用于EMSA检测大鼠肝脏组织 IRP的实施方式。(1) 探针的制备按照GENEBANK中查找包含大鼠L型铁蛋白的mRNA序列，其IRE是位于5'UTR内 的茎环结构，本例中取包括"环"在内的29个碱基作为探针的序列，艮口 5'國AUCUU GC UUC AACAGUGU UUGGACG GAAC-3'上述序列中不配对的碱基CAGUGU形成"环"的空间结构。其余部分形成"茎"。以这 个序列和长度(29nt)，在核酸合成仪上合成IRE探针，合成20D，对其中1个OD进行5， 末端FAM标记，剩余的l个OD不标记，用作特异抑制片段，进行竞争抑制实验。(2) 探针贮藏均以干粉形式一20'C下保存待用。(3) 在EMSA中的应用① 蛋白样品的准备取大鼠肝组织少量(100mg)，在裂解液中制备10%的匀浆，裂解液(pH7.4)的组成是， 20mMTris， 150mMNaCl， 1%TritonX-100， lmMPMSF，以及蛋白酶抑制剂(1 mM AEBSF、 HC1、 0.8 mM Aprotinin、 0.05 mM Bestatin、 0.015 mM E-64、 0.02mM Leupeptin Hemisulfate 和O.Ol mMPepstatinA)，匀浆在4'C环境中进行。以20，000g离心15min后，上清液转移至高 速离心管中，再次以100， 000g离心30min (如图5所示，经更高转速的离心，相对富集目 的蛋白，目的条带更深)，上清液转移至微量离心管中，立即采用BCA法进行蛋白定量，用 裂解液稀释蛋白浓度为5pg:l，并分装放入-8(TC冰箱保存待用。② 结合反应所有溶液的配制均使用DEPC水。5X反应缓冲液(50mMHEPES、 15mMMgCl2、 200 mMKCl、 25%glycerol、 5mMDDT、 1%NP40， pH7.6)。反应体系的组成和操作顺序是 无核酶水lO^ll蛋白溶液蛋白20吗(如图2所示，表明适中的蛋白量即能够提高条带清晰度又能避免上样量过高造成的拖尾) 结合缓冲液(5X): 4^1 RNase抑制剂40UBSA: 8ng(如图4所示，表明在反映体系中加入BSA，可提高条带清晰度) *以上总体积20^1,充分混匀后在0—4。C环境中孵育10min标记探针2.5—3nM*以上充分混匀后在室温下安置孵育30min肝素100(ag*以上充分混匀后在室温下安置孵育10min，离心取上清液准备电泳。③ 电泳制备8%非变性聚丙烯酰胺(60:1)凝胶(如图1所示，表明在右侧8%的非变性聚丙烯 酰胺凝胶中条带较左侧4%的更为清晰、紧密)，符合实验要求。在4'C环境中预电泳10min。上样8nl/每泳道X2，在冰箱中电泳，龟压9V/cm，在电泳开始后90min时暂停，加入标记 的RNA探针(用作参照)。注意，RNA探针加入量的多少应当尽可能与样品条带的荧光强度 相近，不要偏离过大。
检测分析拆除凝胶设备，擦干玻璃，使用Typhoon9400扫描仪对凝胶进行荧光扫描(激发波长 495nm，发射波长535nm)。根据参照的RNA的荧光强度以及探针含量，分别将其他泳道中 样品条带和游离探针的荧光强度分别换算获得条带和游离探针的量。在上述操作中，可通过改变标记探针的加入量或蛋白加入量，可进行饱和试验，获得理 想的饱和曲线(如图3所示，表明加入的探针已经达到饱和状态)。；在结合反应中加入未标 记的相同探针，可进行竞争抑制试验，获得理想的竞争抑制曲线；如果在上述分析基础上进 一步转膜杂交(Western blotting),可以对其杂交条带进一步分析；如果在结合反应中加入结 合蛋白的特异抗体，即进行凝胶电泳超迁移方法(Electrophoretic mobility supershift assays, EMSSA)试验，则可对以上进行的平行试验结果进行比较，可分析结合反应的特异性。⑤异常情况及其处理一般来说，与应用当前其他方法的实验结果比较，在上述操作后， 一个明显的优势是可 获得较为清晰的背景和理想的条带。当条带不出现时，应当考虑蛋白样品及其中结合蛋白含 量方面的问题，此时，可以增大结合反应中蛋白加入量。条带明显拖尾较长时表明蛋白加样 量过大。试剂盒试剂盒组成荧光标记探针2或40D。(探针序列按需提供)组织细胞裂解液(100ml)。5X结合反应缓冲液(lml)。特异抑制剂(4000U)。非特异抑制齐U(4000U)。DEPC水(10ml)以上可用于ioo次结合试验
权利要求
1. 一种mRNA茎环结构探针，其特征在于，由以下方法制得根据目的茎环结构的核酸序列，采取化学合成法直接合成核酸序列长度不超过70nt的探针，然后采用荧光标记法对探针进行标记。
2. —种权利要求1所说的mRNA茎环结构探针的制备方法，其特征在于，根据目的茎环 结构的核酸序列，采取化学合成法直接合成核酸序列长度不超过70nt的探针，然后采用荧光 标记法对探针进行标记。
3. 如权利要求2所说的mRNA茎环结构探针的制备方法，其特征在于，所说的探针的长 度是10nt—50nt。
4. 如权利要求2所说的mRNA茎环结构探针的制备方法，其特征在于，所说的探针的标 记方法是末端荧光标记。
5. 如权利要求4所说的mRNA茎环结构探针的制备方法，其特征在于，所说的末端荧光 标记是5'端荧光素标记。
6. 权利要求l所说的mRNA茎环结构探针，应用于凝胶电泳迁移试验、EMSA延伸的其 它试验方法、蛋白印迹的前处理，或其它基于RNA—蛋白结合反应对mRNA茎环结构或其 结合蛋白进行分析的实验方法。
7. 权利要求6所说的应用，其特征在于，应用于真核细胞和原核细胞中的任何一种，或 者是应用于任何一种mRNA的结合蛋白。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种mRNA茎环结构探针及其制备方法，以及它在EMSA中的应用。所说的mRNA茎环结构探针，由以下方法制得根据目的茎环结构的核酸序列，采取化学合成法直接合成核酸序列长度不超过70nt的探针，然后采用荧光标记法对探针进行标记。这种带有荧光标记的茎环结构的探针用于EMSA技术中，可获得高特异性、高灵敏度、可重复性和稳定性的优点，制备方法简单、价格低廉。
文档编号C12N15/11GK101270391SQ20081002534
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者梅 刘, 肖德生, 海 钱 申请人:江苏大学