山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因功能领域，更具体地设及山核桃miR166d在提前植物花期或植物 分生组织发育中的应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物中，含有茎环结构的miRNA前体，经过 Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（18-25个核巧酸）。miRNA通过在转录水平或 者转录后水平对基因组上的祀基因抑制其翻译或者切割祀基因来调控基因表达，在基因表 达中起负调控其祀基因作用。miRNA在植物从成花诱导到花器官特征属性形成的整个花发 育过程均发挥着关键作用。
[0003] 山核桃（CaryacathayensisSarg.)属胡桃科山核桃属植物，雌雄同株，主要分布 于浙江西部地区W及安徽地区，是我国特有的名优干果和木本油料树种，是山区农民脱贫 致富的重要途径；然而，山核桃从种子播种到结果需要10余年的时间，从而较大程度抑制 了山核桃的产量，如何缩短童期促进早实是山核桃研究者亟待解决的难题。
[0004] miR166是一种广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中的miRNA。在植物众多 miRNA中，研究表明miR166通过调节其祀基因：同源异型域一亮氨酸拉链蛋白化omeodoma in-leucinezippe巧rotein，皿-Zip)，在植物对逆境胁迫的响应过程中发挥着重要作用。裝 襲首猜中过量表达miR166会造成植株根瘤和侧根数目减少，维管系统发育异常。受干旱诱 导表达的miR166通过影响根的数量和维管组织，从而来调节植物的抗干旱能力。在缺水 胁迫下裝襲首猜根中miR166表达上调，且野生型裝襲首猜在缺水胁迫下的表型与过表达 miR166的转基因的植株表型相似。干旱胁迫下野生二粒小麦和大麦根中的miR166均表达 下调，可能存在其他的未鉴定的祀基因。盐胁迫下玉米的miR166表达下调。山核桃miR166 在植物开花或植物分生组织发育的作用未知。
【发明内容】
阳0化]本发明提供了山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用。 阳006]山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用，所述山核桃miR166d的碱基序列如沈QIDNO. 1所示。
[0007] 优选地，所述植物是拟南芥或烟草。
[0008] 优选地，所述植物是拟南芥。
[0009] 获得山核桃miR166d转基因植株的具体方法包括：将包含所述山核桃miR166d的 前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。 阳010] 由于山核桃成熟miR166d本身序列很短，只有2化P，而其前体序列相对较长，连接 到载体上，有利于转化实现，优选地，所述前体基因的碱基序列如SEQIDNO. 2所示。
[0011] 本发明公开了山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用。应 用山核桃miR166d，有望调控山核桃的花期和分生组织发育；更具体地，有望调控山核桃的 花期和分生组织上的表型，例如降低山核桃的高度，增加分支数。
【附图说明】
[0012] 图1为山核桃花芽的总RNA 阳01引 图2为山核桃miR166d前体的中间载体菌液PCR检测
[0014] 图3为山核桃miR166d前体的表达载体菌液PCR检测
[0015] 图4为山核桃miR166d转基因拟南芥植株的抗性筛选
[0016] 图5为山核桃miR166d转基因拟南芥的PCR检测
[0017] 图6为野生型、拟南芥miR166d突变体和山核桃miR166d转基因拟南芥的叶片数 目统计
[0018] 图7为观察到的野生型、拟南芥miR166d突变体和山核桃miR166d转基因拟南芥 的表型
【具体实施方式】
[0019] 1.材料
[0020] 1.1实验材料
[0021] 山核桃花芽采自浙江省杭州市临安板桥村，选取不同株山核桃树进行采样。样 品采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80°C冰箱保存待用。另外，购买拟南芥 miR166d转基因的拟南芥突变体种子（购于美国ABRC)。
[0022] 1. 2实验试剂与仪器 阳02引 DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物 工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份 有限公司。PCR仪为美国PE9700PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。 [0024] 1.3引物合成及测序
[00巧]引物合成及测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。 阳0%] 2.方法
[0027] 2. 1山核桃花芽总RNA的提取 阳02引采用改良CTAB巧rizol法提取花芽样品总RNA，步骤如下：
[0029] (1)在10血离屯、管中加入3血65°C预热的CTAB提取缓冲液（10%CTAB，10% PVP40，1.0MTris-HCl(抑 8.0),51 化C1，0.6M邸TA(p册.0))，加入 200μΙβ-琉基乙醇；
[0030] 似取-70°C保存的花芽2g，放入液氮充分预冷的研鉢中，于液氮中充分研磨至百 色粉末；
[0031] (3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65°C水浴30min， 期间振荡3-4次；
[0032] (4)在混合物中加入等体积的25:24:1(酸性饱和酪：氯仿：异戊醇），约3ml。混 合均匀后14000巧m离屯、lOmin(常溫）；
[0033] (5)取上清转入新的10ml离屯、管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1)上下颠倒 混匀，12000;rpm4°C离屯、lOmin后取上清；
[0034] (6)重复步骤4 一次，直至中间层消失；
[0035] (7)上清转移至1.5血离屯、管中，加入等体积的异丙醇后放置于-20°C冰箱冷冻 30min。12000巧m4°C离屯、lOmin弃掉上清，沉淀加入65°C预热好的SSTE400μL溶液至全 溶；
[0036] (8)溶液中加入1血TRIzol试剂，室溫静置5min。再加入200μL氯仿摇匀，室溫 静置 2-3min;
[0037] 巧）4°C12000巧m离屯、15min;
[0038] (10)吸取上清，加入等体积异丙醇，室溫静置lOmin;
[0039] (11)4°C12000rpm离屯、lOmin，弃掉上清，肉眼可见RNA沉于管底；
[0040] (12)加入1血预冷的75%乙醇洗涂沉淀，溫和振荡，800化pm4°C离屯、5min，弃掉上 清； 阳04U(蝴重复步骤11，并将沉淀真空干燥7-lOmin;加入适量DEPC水溶解沉淀，-80°C保存备用。
[0042] 2. 2cDNA合成
[0043] 使用TAKARA试剂盒PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit,详细 内容如下： W44] (1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系：
[0045]
[0046] (2) 65°C保溫5min，冰上迅速冷却。（模板RNA变性）
[0047] (3)再次配置反应体系如下：
[0048]
W例 （4)缓慢摇匀。 阳化0] (5) 42°C反应 30-60min。
[0051] (6)95°C5min酶失活后，冰上冷却。
[0052] 2. 3前体序列的引物设计
GCGTCGTTTCCGACCATAT-3'，克隆所需序列。
[0054] 2. 4PCR扩增反应
[0055] W山核桃cDNA为模板扩增，反应体系如下：
[0056]
[0057] PCR反应条件为：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸Imin。 30个循环后，72°C延伸lOmin。PCR反应完成后4°C暂时保存，其中退火溫度可根据Tm值进 行调整。
[005引 2. 5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收
[0059] 将PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE(40mMTris-乙酸盐， ImM邸TA)，核酸燃料为邸。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下： W60] (1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术 刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入1. 5mL离屯、管中。每个胶块尽量不要超过 400mg，否则将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴 露时间来降低对DNA的损伤。 阳〇6U 似根据胶块的质量和浓度，每lOOmg琼脂糖加300~600μL的比例加入Buffer B2〇
[0062] (3)置于55°C金属浴lOmin，期间混匀2~3次直至胶块完全溶化为止。 阳06引（4)当目的片段<500bp时，可加入1/3体积的BufferB2的异丙醇，混匀。若 >5(K)bp，则此步骤可W省略。
[0064] (5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,OOOxg离屯、30sec。倒掉收集管中的液体， 并将吸附柱放入同一个收集管中。 阳0化](6)加入500μLWashSolution, 9000xg离屯、30sec。再次倒掉收集管中的液体。
[0066] (7)重复一次步骤6。
[0067] (8)将带有收集管的吸附柱放入离屯、机，9000xg空离Imin。扔掉收集管，并将吸附 柱置于灭过菌的1.5mLEP管中。 W側 （9)打开吸附柱的盖