一种重组慢病毒及其在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种重组慢病毒及其在制备治疗可卡因成癒的药物中的用途。
【背景技术】
[000引可卡因（Cocaine)又称古柯碱，化学名为苯甲酯甲基芽子碱（methyl benzoylecgonine)，一般呈白色晶体状，无臭，味苦而麻，其最早用于局部麻醉和治疗哮 喘，是最强的天然中枢兴奋剂，因其对中枢神经系统的兴奋作用而导致滥用，1985年起成为 世界性主要毒品之一。
[0003] 可卡因成癒，是一种慢性复发性脑部疾病，属于药物依赖（化Ug(kpendence)类疾 病，可卡因成癒会引起大脑结构和功能的可塑性变化，相关脑区包括伏隔核、纹状体、前额 皮质、海马和腹侧被盖区，健康也受到多方面的危害，包括精神颜废、人格缺损、屯、智功能素 乱、并发相应的感染合并症W及吸毒者不顾一切地寻求和使用毒品而诱发各种违法犯罪活 动。
[0004] 可卡因成癒的主要特点表现为即使患者在知晓用药的严重后果后，依然强迫性索 取和使用W满足欲望、对药物的寻觅和索取失去控制、对事物失去兴趣、成癒记忆十分深 亥IJ，即使经过戒断治疗若干年后，接触与成癒有关的刺激（如毒友、与过去用药有关的环境 等）都可能诱发复吸。
[0005] 鉴于可卡因成癒危害甚大，找到合适的治疗祀点和药物，治疗可卡因成癒迫在眉 睫。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一类治疗可卡因成癒的药物。
[0007] PRMT1:蛋白精氨酸甲基化转移酶1。
[0008] PRMT1抑制剂：抑制蛋白精氨酸甲基化转移酶1的酶活或者表达的物质。
[0009] 本发明提供了一种沉默PRMT1表达的基因治疗剂。
[0010] 首先，本发明提供了一种核巧酸序列，其核巧酸序列如下：
[0011]TGCTGAGGACATGACATCCAAACTCGAGTTTGGATGTCATGTCCTCAGCTTTTTC(沈QIDNO. 1)。
[0012] 本发明还提供了一种核巧酸序列，其核巧酸序列如下：
[001 引TCGAGAAAAAGCTGAGGACATGACATCCAAACTCGAGTTTGGATGTCATGTCCTCAGCA(SEQID NO. 2)ο
[0014] 本发明还提供了一种重组质粒，其特征在于：它包括沈QIDNO. 1和沈QIDNO. 2 所述核巧酸序列的重组质粒。
[0015] 优选地，所述重组质粒是重组化LU2G质粒。进一步优选地，所述重组质粒的核巧 酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0016] 本发明还提供了一种重组慢病毒，它包含前述任意一项的重组质粒。
[0017] 本发明还提供了前述的核巧酸序列、重组质粒或重组慢病毒在制备PRMTl抑制剂 中的用途。
[0018] 本发明还提供了前述的核巧酸序列、重组质粒或重组慢病毒在制备可卡因成癒的 药物中的用途。
[0019] 优选地，所述药物是降低H4R3me2a的表达水平的药物。进一步优选地，所述药物 是降低基因Cdk5和CaMKII的表达水平的药物。
[0020] 本发明还提供了一种治疗可卡因成癒的药物，它是W前述的核巧酸序列、重组质 粒或重组慢病毒为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
[0021] 优选地，所述制剂是注射制剂。
[0022] 本发明沈QIDNO. 1和沈QIDNO. 2所示shRNA、包含前述shRNA的重组质粒 化LU2G-shPrmtl-3W及包含该重组质粒的重组慢病毒LV-shPRMTl，可W沉默PRMT1基因， 下调PRMT1的表达，进而降低H4R3me2aW及可卡因成癒相关基因(Mk5和CaMKII的表达， 可W制备成为治疗可卡因成癒的药物，临床应用前景良好。
[0023]W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0024] 图1小鼠条件性位置偏爱箱
[0025] 图2自发活动检查箱.
[0026] 图 3M:lOObpDNAladder;Lanel, 8, 15:阳性对照；Lane2-7 :pDown-shP;rmtl-l-eGFP①~⑧克隆；Lane9-14 :pDown-shP;rmtl-2-eGFP①~⑧克隆；Lane16-21 : pDown-shP;rmtl-3-eGFP①~⑧克隆。
[0027] 图4筛选shRNA干扰PRMT1表达序列。化uro2A-shPrmtl-3最大程度抑制PRMT1 表达。
[0028] 图5慢病毒载体结构图谱
[0029] 图6病毒滴度测定稀释图。10倍梯度稀释，稀释范围为10 5-10 9
[0030] 图7验证慢病毒在伏隔核中表达，卡通示意图取自小鼠脑图谱冠状1. 5mm切片。
[0031]图8LV-shPRMTl特异性干扰PRMT1 表达。Student'Sttests，*p<0. 05，LV-GFP η= 6,LV-shPRMTln= 6〇
[003引图9伏隔核内注射LV-shPRMT1特异干扰PRMT1蛋白的表达。（A)LV-shPRMT1 干扰伏隔核PRMTl蛋白的表达；度)LV-shPRMTl不影响伏隔核PRMT4蛋白的表达；似LV-shPRMTl不影响伏隔核PRMT5蛋白的表达；Actin作为内参蛋白，Student'Sttests, *p<0. 05,LV-GFPn= 4,LV-shPRMTIn= 40
[0033] 图10伏隔核内注射LV-shPRMTl不影响纹状体PRMT1，PRMT4和PRMT5的表达。（A) LV-shPRMTl不影响纹状体PRMTl蛋白的表达；度)LV-shPRMTl不影响纹状体PRMT4蛋白的 表达；(C)LV-shPRMTl不影响纹状体PRMT5蛋白的表达；Actin作为内参蛋白，LV-GFPη= 4,LV-shPRMTIn= 4〇
[0034] 图11伏隔核内注射LV-shPRMTl明显改善可卡因诱导行为可塑。（A)伏隔核内注射 LV-shPRMTl抑制可卡因诱导的奖赏行为，One-wayAN0VA，*i)<0. 05, **p<0. 01，***p<0. 001，LV-GFPSalineη= 13,LV-shPRMTlSalineη= 13,LV-GFPCocaineη= 11， LV-shPRMTlCocainen= 12。度）伏隔核内注射LV-shPRMTl减弱可卡因诱导的 自发活动行为，Two-wayAN0VAanalysisfollowedbybonferronipost-tests, *p<0.05, **p<0. 01and***p<0. 001，LV-GFPSalinen= 11，LV-shPRMTlSalinen= 12， LV-GFPCocainen= 12,n= 13LV-shPRMTlCocaine。
[0035] 图12PRMTl调控可卡因奖赏行为与低表达PRMTl相关。（A)PRMTl调控可卡因奖赏 行为与低表达PRMTlmRNA相关，One-way AN0VA，卸<0. 05, **p<0. 01，η= 6/ 组。度)PRMT1 调控可卡因奖赏行为与低表达PRMTl蛋白相关，化e-way AN0VA，卸<0. 05，**卸<0. 001，η= 3/组。
[0036]图 13PRMTl调控H4R3me2a和a地3Κ9/Κ14 的修饰。（Α)低表达PRMTl降低H4R3me2a 的修饰，One-wayAN0VA，*pi<0. 05，**p<0. 01，n.S.表示没有统计学差异，η= 4/组。度）低 表达PRMTl通过控制H4R3me2a的修饰影响a地3Κ9/Κ14的表达，One-wayAN0VA，卸<0. 05， η.S.表示没有统计学差异，η= 4/组。
[0037] 图14H4R3me2a和a地3Κ9/Κ14调控(Mk5基因转录。（Α)在可卡因重复给药模型 中，H4R3me2a和a地3K9/K14在(Mk5基因启动子位点结合增加，S化dents't-test，卸<0. 05， N= 3/组，4只动物伏隔核样本并入一个样本（视为N= 1);度）可卡因重复给药上调伏隔 核（MkSmRNA的表达，Sl:udents't-test，*p<0. 05,η= 5/ 组。
[0038] 图15H4R3me2a和a地3Κ9/Κ14调控CaMKII基因转录。（A)在可卡因重复给药模 型中，H4R3me2a和a地3K9/K14在CaMKII基因启动子位点结合增加，SUidents't-test， *p<0. 05, N= 3/组，4只动物伏隔核样本并入一个样本（视为N= 1);度）可卡因重复给药 上调伏隔核CaMKIImRNA的表达，SUidents't-test，*p<0. 05, η=5/组。
[0039] 图16可卡因重复给药增高H4R3me2a的表达。可卡因重复给药增加伏隔核 H4R3me2a的表达，增高H4R3me2a的表达状态至少维持到可卡因戒断后第7天。伏隔核样本 检测时间分别为可卡因戒断1天值1)、7天值7)、14天值14)、28天值28)和42天值42)， Actin作为内参蛋白，卸<0. 05表明与生理盐水组相比较有统计学差异，η= 3/组。
[0040] 图17可卡因重复给药降低伏隔核册脚me2的表达。降低册脚me2的表达在可卡因 戒断第7天即恢复正常水平。伏隔核样本检测时间分别为可卡因戒断1天值1)、7天值7)、 14天值14)、28天值28)和42天值42)，Actin作为蛋白内参，卸<0. 05表明与生理盐水组 相比较有统计学差异，η= 3/组。
[0041] 图18可卡因重复给药降低伏隔核册K36me3的表达。降低册K36me3表达在可卡因 戒断第7天即恢复正常水平。伏隔核样本检测时间分别为可卡因戒断1天值1)、7天值7)、 14天值14)、28天值28)和42天值42)，Actin作为蛋白内参，卸<0. 05表明与生理盐水组 相比较有统计学差异，η= 3/组。
【具体实施方式】
[0042] 实施例1本发明干扰PRMTl表达慢病毒的构建
[004引 1设计序列
[0044] 根据祀基因PRMTl设计并合成shRNAoligo,oligo序列如下表：
[0045]shRNAPRMTloligo序列
[0046]
[0047] 2构建载体
[0048] 2.lOligoDNA的退火
[0049] 把待退火DNAoligo用DEPC处理的水配制成50μΜ，溶解退火缓冲液巧X)， 混匀备