一种沉默水稻过氧化氢酶基因OSCAT2的sgRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种抑制0SCAT2基因表达的SgRNA及应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 过氧化氨酶（Catalase,CAT)是第一个被发现的抗氧化酶，Loew将其命名为 Catalase。氧化氨酶是生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一。其生物学 功能是催化细胞内过氧化氨的分解防止过氧化。CAT与S0D、P0D、ASP-起被称为酶保护系 统。前认为植物中CAT主要存在于过氧化物酶体与乙醒酸循环体中，同时与叶绿体和线粒 体存在着密切联系。一个典型CAT相对分子质量大约为200~340ku，是由4个亚基构成 的聚合体，每个亚基各含有1个亚铁血红素分子，保守序列存在于催化位点和亚铁血红 素的结合位点，在簇基末端存在着可能识别过氧化物酶体的多肤序列PTSUperoxisomal targetingsignal),结合的NADPH可能对维护自身结构的稳定性起到重要作用。
[0003]CATs家族由多基因编码，在烟草、拟南芥、玉米、南瓜和大米等都发现Ξ种过氧化 氨酶基因。研究发现，CAT的表达具有组织和器官特异性。在正常生长条件下，玉米CAT2在 盾片、叶、上胚轴及未成熟果实内均有表达；拟南芥CAT2、CAT2和CAT3在花序和种子内都 表达，CAT2和CAT3在叶中表达量高；藍麻CAT2主要在胚乳和胚轴中表达。机械损伤、盐胁 迫、低溫和高溫胁迫和紫外胁迫等都能导致CAT基因表达量的明显变化。
[0004] 随着研究的不断深入，过氧化氨酶在植物防御、胁迫应答W及控制细胞的氧化还 原平衡等方面起着重要的作用越来越受到人们的关注，其抗低溫、干旱、病毒W及除草剂的 功能已经在转基因植物中得到验证。过氧化氨酶作为信号分子的过氧化氨是植物复杂信号 传导中的一个重要组成部分，它介导了多种植物胁迫反应并对其平衡的维持和调控起到 了非常重要的作用。越来越多的研究证实了胁迫反应中过氧化氨酶与过氧化氨含量的变化 有一定的关系，同时又和其它信号因子存在着交互作用。
[0005]CRISPR/tas9是一种来源于原核生物的新型核酸酶系统，它由导向序列SgRNA和 核酸酶化s9两种元件组成。SgRNA可识别基因组中核甘酸序列为5'-NGG-3'的前间区序列 邻近基序（PAMmotif),依据碱基互补配对原则与祀向序列结合，Cas9在sgRN的导向下，特 异性切割祀向序列，导致序列变化。与ZFN、TALEN相比，CRISPR/tas9系统具有操控性强、 特异性高、用途广泛等优点。
[0006] 精确祀向目标基因是BGK03能否特异性沉默目标基因的先决条件，无论是脱祀还 是错误祀向，都会影响BGK03对目标基因的特异性沉默。设计、制备出精确性和特异性祀向 目标基因的SgRNA成为BGK03基因沉默的关键技术。
[0007] 水稻的ryza sativa L.)是最主要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口都W 水稻作为主粮。水稻不仅是一种重要的粮食作物，也是一种重要的模式生物，对相关基因 进行功能研究具有重要的作用。CAT基因在植物的胁迫反应中发挥着越来越重要的作用， 但其是否还具有其它功能还不清楚，我们的研究发现水稻中0SCAT2基因的沉默会影响植 株的分葉及育性，运暗示其可能在水稻的营养和生殖生殖发挥作用。通过在水稻体内降低 OsCAT2基因的表达水平为将为水稻的遗传改良提供重要的理论依据和新思路。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种抑制水稻过氧化氨酶基因0SCAT2的方法，提供了一种 沉默水稻过氧化氨酶基因0SCAT2的sgRNA，及祀向沉默水稻过氧化氨酶基因0SCAT2的载体 构建方法。
[0009] 本发明中，一种沉默水稻过氧化氨酶基因0SCAT2的sgRNA，其DNA序列如SEQ IDN0. 1 所示。
[0010] 本发明中，祀向沉默水稻过氧化氨酶基因0SCAT2的载体，其特征在于：含有特异 性祀向0SCAT2基因第Ξ外显子的sgRNA的表达载体和化s9蛋白的体外转录载体，其中 sgRNA序列上游为水稻U6启动子，化s9上游为玉米加强型启动子，筛选标记为潮霉素。
[0011] 本发明祀向沉默水稻过氧化氨酶基因0SCAT2的载体构建方法，按W下步骤进行：
[0012] (1)根据在线软件ht1:p://c;risp;r.mit.edu/捜寻 0SCAT2 (X0C_0s06巧 1)基因的合 适的祀标序列，0SCAT2的序列特征见SEQNO6所示，祀标序列见SEQIDN0. 2所示。
[001引 似将祀标序列去除末端TGG，获得sgRNA序列，其DNA序列见SEQIDN0. 1所示； 将SEQIDN0. 1序列反向互补获得sgRNA的反向互补序列，其DNA序列见SEQIDN0. 3所示。
[0014] 做在SgRNA序列的5端引入6个额外的碱基TGTGTG获得SEQIDNO. 4序列；在 SgRNA反向互补序列的5端引入4个额外的碱基AAAC，3端引入2个额外的碱基CA获得SEQ IDNO. 5序列。人工合成沈QIDNO. 4和沈QIDNO. 5的序列后并将其制备成Oligo二聚 体；
[0015] (4)将制备好的Oligo二聚体连接至载体BGK03的U6启动子上游，然后转化大肠 杆菌D册a获得载体BGK03-0SCAT2。
[0016] 本发明的有益效果是载体BGK03-0SCAT2转化水稻后，即可实现高效、快速、特异 对水稻0SCAT2基因进行沉默。转基因水稻植株叶片变小、分葉数增多及育性降低的表型。 可直接用此做研究材料来探讨0SCAT2基因的功能和作用机理，为在生产实践上更好利用 0SCAT2基因进行遗传改良奠定基础。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的水稻0SCAT2基因的目标祀位点。小写字母代表内含子，大写字母 代表外显子。
[0018] 图2为本发明的转基因水稻中0SCAT2基因目标祀序列的比对结果。A为野生型水 稻9522,B-C为转基因水稻，阴影部分为目标祀序列。
[0019] 图3为本发明的转基因水稻中0SCAT2基因突标祀序列的峰图。A为野生型水稻 9522,B-C为转基因水稻，框内所示序列为目标祀序列。
[0020] 图4为转基因水稻植株；其中A，C，E为野生型，B，D，F为转基因水稻。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，运些实施例仅用于举例说明 本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0022] 实施例中所设及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、化q DM聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司（大连）产品，质 粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，BGK03载体购自杭州百格生物技 术公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学W及基因工程实验室常用仪器。所 有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无 特别说明均为常规方法。
[0023] 实施例1 :水稻0SCAT2基因目标祀序列的获得
[0024] 利用tigr在线数据库查找水稻0SCAT2基因L0C_0s06g51并下载。根据在线软件 httpV/crispr. mit.edu/捜寻0sCAT2基因5' (N)20NGG-3'序列，并根据祀向位点，错配碱 基数、错配位置等进行优化，最后选择其反义链上的"GTGGAGAACCGAACAATAACTGG"作为目标 祀序列，见图1.
[00巧]实施例2 :水稻BGK03-0SCAT2载体的构建
[002引 （1)sgRNA序列：目标祀序列反向互补后去除5端序列TGG得到sgRNA序列
[0027] "GTGGAGAACCGAACAATAAC"
[0028] 似SgRNA反向互补序列：将SgRNA序列反向互补获得反向互补序列
[0029] "GTTATTGTTCGGTTCTCCAC"。
[0030] (3)根据选择的载体BGK03的酶切位点，在SgRNA序列的5端引入6个额外的碱基 TGTGTG获得SEQ ID NO. 4序列；在SgRNA反向互补序列的5端引入4个额外的碱基AAAC，3 端引入2个额外的碱基CA获得SEQ ID NO. 5序列。将SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的序 列交由上海生物工程技术公司进行人工合成分别得到UPOligo和LowOligo。
[0031] (4)Oligo二聚体的制备：
[0032] 将合成的Oligo加水溶解至10μM，按下列反应体系混合后，95°C加热3分钟，然后 W约0. 2°C/秒缓慢降至20°C，反应在博日PCR上进行。反应体系为：
[0033]BufferAnneal 18ul
[0034]UPOligo 1μ 1
[0035]LowOligo 1μ 1
[0036] 巧）将Oligo二聚体构建至BGK03载体。
[0037] 按下列反应体系在冰上混合各个组分