猪6号染色体上用于溯源的snp分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全领域，设及一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及 其检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着社会的发展，食品供应链中的环节在不断增加，从农场、牧场到食品企业的加 工、包装、储藏、运输和销售，食品供应的各个环节存在食品的安全隐患，食品安全问题常有 发生。因此需要进行肉制品的可追溯管理，建立从产地到餐桌的各个环节的追溯体系，从而 为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的 不安全隐患。从20世纪90年代中期的食品安全危机开始，肉产品的追溯已经作为一种安 全控制措施，受到世界多个国家的高度重视。肉产品追溯系统加强了政府部口对肉产品质 量安全的监管能力，因此许多国家纷纷建立肉产品追溯系统用W降低肉产品质量安全中存 在的风险。
[0003]肉产品溯源技术有标签溯源技术、同位素溯源技术、矿物元素指纹溯源技术、有机 物溯源技术虹膜特征技术和DNA标记溯源技术（或DNA溯源技术）等，其中DNA溯源技术因 为检测手段简单、快速、难W伪造等特点成为世界各国广泛应用的快速溯源技术。与其他标 记方法相比，DNA标记具有特有放入优越性：它直接WDNA形式出现，在生物体的各个组织、 各发育时期均可检测到，不受环境因素的影响，并且标记数量多，遍及生物体整个基因组。
[0004]SNP标记是指基因组同一位点上单个核巧酸的变异，一般表现为二等位基因，非常 适宜高通量自动化分析，所W日益成为动物身份识别最受关注的分子标记。
[0005] 但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一般的SNP标记，对于单个的SNP标记，它 必须至少具有W下特征：（1)变异度高，在品种或品系中等位基因频率接近；(2)品种间等 位基因分布频率差异小；（3)杂合度大于等于0. 3。
[0006] 在长期的育种工作中，研究者积累了大量的SNP标记，由于单个SNP溯源标记是无 法完成溯源的，因此，需要一组相互独立的SNP标记才能实现溯源。W现有的13个已知SNP 分子标记作为溯源标记组合，在经过高度选择引进的猪群体中，使用该组标记进行溯源时， 会出现某些个体不能区分的情况。
[0007] 另外，在长期的育种工作中，积累的大量的SNP标记往往集中分布在某些染色体 上，而另外部分染色体，如5号，6号，8号，14号，15号和18号染色体等则缺乏SNP标记，容 易导致分子标记间出现连锁现象，分子标记之间不能互相独立，缩小溯源实验的检测范围， 导致实际可检测范围小于预期可检测范围。因此，为了满足对猪肉产品进行DNA溯源的要 求，需要开发其他染色体上用于溯源的SNP标记，提高溯源检测范围及准确度。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及其应用， 该SNP分子标记在商品猪培育中，可W广泛用于猪肉产品DNA溯源，特别是用于猪肉产品的 安全性溯源，完善了现有标记组合，提高溯源检测准确度，扩大溯源规模。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0010] 一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记，该SNP分子标记的DNA序列如SEQ IDNO. 1所示，共55化P，且第362位碱基处有一个碱基替换，为362A或362G。
[0011] 进一步，所述的SNP分子标记由化Π限制性内切酶特异识别。
[0012] 所述的SNP分子标记是通过NCBI数据库序列比对获得的，并在包括10个猪品种 或品系的试验群体（共计245个个体）中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的 分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种 或品系间等位基因频率分布差异小，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。
[0013] 所述的猪6号染色体上的一个可用于溯源的SNP分子标记的获得方法，采用 PCR-Tail-RFLP方法进行，包括W下步骤：
[0014] 1)在NCBI上捜索猪6号染色体的DNA序列信息，设计正、反向引物分离猪6号染 色体的DNA片段；
[0015] 2)利用NCBI数据库在线进行序列比对，寻找存在碱基替代的位点；
[0016] 3)建立PCR-化il-RFLP检测方法及检测替换位点；
[0017] 4)采集10个品种和品系的耳组织样，共计245个个体；
[0018] 5)检测SNP分子标记在试验群体的分布，统计分析，并进一步试验验证是否适用 于猪肉产品溯源中。
[0019] 其中，上述获得SNP分子标记的方法中，所述的分离猪6号染色体上DNA片段的 正、反向引物序列如下：
[0020] 正向引物：5' -AAATGAAGAACAGGCAAGG-3'（如沈QIDNO. 2 所示）；
[00引]反向引物：5' -CTTCCCAGTAAACTTAGGAGATA-3'（如沈QIDNO. 3 所示）。
[002引在DNA溯源过程中，每增加一个溯源位点，就能进一步扩大检测样本的数目，准确 性也就更高，理想的SNP位点应该是均匀分布在猪不同的染色体上，而现有的SNP位点中缺 乏6号染色体上的溯源标记。
[0023] 本发明通过NCBI数据库序列比对检测到猪6号染色体上的存在的SNP分子标记， 在包括10个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分 布情况，发现该分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或 品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0. 3,初步判定该SNP标记可用作猪肉 产品DNA溯源W及猪肉产品的安全性溯源中。
[0024] 由于单个SNP溯源标记是无法完成溯源的，因此在溯源模拟试验中，将本发明获 得的猪6号染色体上的新SNP分子标记位点与其它现有已公开的SNP分子标记位点结合在 一起（共计14个SNP位点）进行溯源实验。本发明在溯源实验中，增加商品猪来源，在屠 宰场共挑选了来自多个不同猪场的300个个体，从300个个体中随机挑选100个个体，检测 该100个个体中14个SNP位点的基因型，统计每个个体的基因型结果，发现100个个体均拥 有各自不同的基因型，能实现个体区分；同时，随机在运100个个体中挑取20份肌肉样，同 样检测统计14个SNP分子标记位点的基因型，然后跟100个个体的基因型进行比对分析， 发现均能找到与20份肌肉样品基因型完全一致的个体，即通过溯源在100个个体中找到20 份猪肌肉的来源个体，因此判定本发明的该SNP分子标记可W用于猪肉产品溯源。
[00巧]与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0026] 本发明的SNP分子标记位于猪的6号染色体上，能进一步完善标记的检测覆盖面， 提高溯源的准确性，并扩大了已有分子标记的检测范围。
【具体实施方式】
[0027]W下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
[002引实施例1分子标记的查找
[002引 （1)引物设计
[0030]W猪6号染色体的DNA序列（Genbank:FN675082)为模板，设计引物分离猪的DNA片段（W-头杜洛克猪的DNA为PCR扩增的模板），引物如下：
[00引]正向引物：5,-AAATGAAGAACAGGCAAGG-3,（如沈QIDNO. 2 所示）
[0032]反向引物：5,-CTTCCCAGTAAACTTAGGAGATA-3'（如沈QIDNO. 3 所示）
[0033] PCR反应总体积为20μ1，其中猪基因组DM约lOOng，含IXbuffeHPromega公 司），1. 5mmol/LMgClz，dNTP(上海生工生物公司）终浓度为150 ymol/L，引物终浓度为 0. 2 μ mol/L 2U Taq DNA聚合酶（Promega公司）。
[0034]PCR扩增：94°C4min，（94°C30s，60°C退火 30s，72°C30s)循环 30 次，最后 72°C延 伸lOmin。
[0035] PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检 测。
[003引 似克隆测序分析
[0037] 将得到的猪6号染色体的DNA片段按照如下方法进行克隆。
[0038] PCR产物的纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段