贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物领域，尤其设及贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时 巧光定量PCR方法。
【背景技术】
[0002] Q热怕化ver)是一种能使人和多种动物感染而产生发热的一种疾病，病程可分 为急性期和慢性期。急性感染的症状包括：高热、颤抖、肌肉疼痛和头疼等，更严重的会导致 肺炎或肝炎。怀孕期间被感染时，有可能导致胎儿流产或新生儿早产。大约有1%的感染最 终转变成慢性疾病。1950年，我国首例发现Q热病例，随后在屠宰场、农牧场等地多次暴发 流行，病原体分别从五十多种野生动物中分离出。目前此病已遍及全世界，中国已有十多个 省份存在此病。
[0003]Q热于1937年初在澳大利亚的布里斯班大规模爆发后，化.HeraldRaeCox 等成功地分离了除了病原菌，并用他们的名字命名为贝纳特氏立克次体巧ickettsia burneti)，又名贝氏立克次体（Coxiellaburnetii),属立克次体。近几年研究将其从斑点 热立克次体中分离出来，属于非斑点热群立克次体，该菌为革兰阴性菌。其致病性、免疫原 性与其脂多糖、质粒、表面蛋白等方面密切相关。对理化因子有特殊的抵抗力，在外界环境 中可长期存活，可通过气溶胶广泛传播，通过飞沫方式使人和动物发生感染。贝氏立克次体 是立克次体族中目前已知唯一含有质粒的病原菌，现已发现4种质粒型怕pHI、化RS、化DV、 化DG)和无质粒（plasmidless)。每种质粒各有其特异序列，并且质粒的类型与Q热的临床 类型无关。大多病症是亚临床症状或不被确诊。
[0004] 检测贝氏立克次体最可靠依据是从样本中分离到贝氏立克次体，可用动物分离、 鸡胚分离、细胞分离等手段，但是贝氏立克次体的分离耗时、繁琐、敏感性差，在一般实验室 难W进行。目前，最常用的贝氏立克次体检测方法是血清特异性抗体检测，由于高水平的特 异性抗体出现较晚，所W特异性抗体的检测结果难W用作Q热的早期诊断，也无法用于检 测样品是否携带该病菌。因此，急需提供一种能够准确、快速检测贝氏立克次体的试剂盒及 其方法。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时巧光定 量PCR方法。采用该引物组及其检测试剂对贝氏立克次体进行检测，能够具有良好的特异 性、重复性和灵敏性。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种贝氏立克次体的检测引物组，包括如SEQIDNO:1所示核巧酸 序列的上游引物和如SEQIDNO:2所示核巧酸序列的下游引物。
[000引本发明还提供了一种贝氏立克次体的实时巧光定量PCR检测试剂，包括如SEQID NO:1所示核巧酸序列的上游引物、如SEQIDNO:2所示核巧酸序列的下游引物和如SEQID NO:3所示核巧酸序列的探针。
[0009] 本发明W贝氏立克次体的保守序列作为检测祀目标，提供用于贝氏立克次体的巧 光定量检测的探针和引物，W该引物和探针对贝氏立克次体进行检测，能够具有良好的特 异性、重复性和灵敏性。
[0010] 在本发明中，如SEQIDNO: 3所示核巧酸序列的探针的3'端连接有FAM巧光标记 基团。
[0011] 作为优选，本发明提供的检测试剂中还包括dNTP、Taq酶和/或PCR反应缓冲液。
[0012] 作为优选，本发明提供的检测试剂中还包括d地2〇、96孔板和/或光学反应盖膜。
[0013] 本发明还提供了一种非诊断目的检测贝氏立克次体的实时巧光定量PCR方法，包 括如SEQIDN0:1所示核巧酸序列的上游引物、如SEQIDN0:2所示核巧酸序列的下 游引物扩增待测样品DNA，W如SEQIDN0:3所示核巧酸序列的探针检测，经实时巧光定量 PCR获得巧光信号。
[0014] 作为优选，实时巧光定量PCR的反应体系为：
[0015]
[0016]
[0017] 采用本发明提供的实时巧光定量PCR反应体系进行扩增能够获得良好的扩增曲 线，提高实验的准确性。
[0018] 作为优选，实时巧光定量PCR的程序为：
[0019]
[0020] 烙解溫度灯m)是引物的一个重要参数。运是当50%的引物和互补序列表现为双 链DNA分子时的溫度。Tm对于设定PCR退火溫度是必需的。在理想状态下，退火溫度足够 低，W保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，W减少非特异性结合。本发明提供 的巧光定量PCR引物退火溫度为57°C，W此溫度检测，能够提高实验的特异性。
[002。 作为优选，SEQIDN0:1所示核巧酸序列的上游引物的浓度为lOpmol/L;SEQID N0:2所示核巧酸序列的上游引物的浓度为lOpmol/L。
[0022] 作为优选，SEQIDN0:3所示核巧酸序列的探针的浓度为lOpmol/L。
[0023]根据巧光信号值及扩增曲线获得样品中是否含有贝氏立克次体，具体为：
[0024] 巧光信号Ct值< 28. 0,并出现典型的扩增曲线，试验有效；
[00巧]无巧光信号Ct值或无扩增曲线，待测样品为阴性，不含贝氏立克次体；
[0026] 巧光信号Ct值《30.0,并出现典型的扩增曲线，待测样品为阳性，含有贝氏立克 次体。
[0027] 本发明提供了贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时巧光定量PCR方 法。该引物组包括如SEQIDNO: 1所示核巧酸序列的上游引物和如SEQIDNO:2所示核巧 酸序列的下游引物。本发明至少具有如下优势之一：
[0028] 1、采用本发明提供的引物组进行实时巧光定量PCR方法扩增效率为101%，相关 系数为0. 999,说明误差小，结果客观准确；
[0029] 2、采用本发明引物组进行实时巧光定量PCR方法对贝氏立克次体进行检测，具有 良好的特异性，通过扩增只有贝氏立克次体出现扩增曲线，其它未有S型曲线扩增；
[0030] 3、本发明重复性检测的巧光PCR的Ct变异系数最小可达0. 16%，梯度重复性良 好，表明本发明检测方法重复性良好且稳定，所检测到的Ct值近似或根据稀释倍数呈现梯 度曲线；
[003。4、本发明实时巧光定量PCR方法能检出的最低拷贝数为1.55Xl05copies/yL，巧 光PCR的敏感度均较高。
【附图说明】
[0032] 图1示按照实施例1的反应体系及条件分别对不同菌进行检测的结果；线1示贝 氏立克次体扩增曲线，其余菌未扩增出扩增曲线。
【具体实施方式】
[0033] 本发明公开了贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时巧光定量PCR方 法，本领域技术人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有 类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本 发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内 容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本 发明技术。
[0034] 本发明提供的贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时巧光定量PCR方法 中采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0035] 贝氏立克次体标准品的制备方法为：
[0036] 首先，根据NCBI公布的贝氏立克次体ISllla基因序列合成目的基因（序列见SEQ IDN0:4,上海生物工程有限公司合成）与PMD18T载体灯AKARA公司）连接后转入大肠杆 菌里，直接提取质粒DNA;
[0037] 质粒作为贝氏立克次体标准品进行实验。质粒的260nm/280nm比值为2. 0,浓度为 56.OOng/μL〇
[0038] 提取待测样品DM所用缓冲液ATL、缓冲液AL、缓冲液AWl、缓冲液AW2、缓冲液AE、 QIAampMinispincolumn收集管来自DM提取试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司。
[0039] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
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