一对靶向猪RelA基因的sgRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体而言，设及一对祀向识别猪RelA基因的 sgRNA及其应用。
【背景技术】 阳00引 ZFN和TALEN打祀技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是运两种技 术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶。而CRISPR/tas9系统对特 异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可W有一系列的crRNA组成，每个针对特异 位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建 (CRISPR/tas9新型基因打祀系统的研究进展.江苏农业学报.李辉等，2013)。
[0003] (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免 疫防御机制。CRISPR/化s9利用一段小RNA来识别并剪切DNAW降解外来核酸分子。 Cong等(MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems.Science. 2013) 及Mali等（RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science.2013)证 明化s9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的祀向酶切，非同源重组 (NHEJ)、同源重组（HR)效率在3-25 %之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多 个祀点可W同时进行祀向酶切。但是，随后的研究表明，Cas9存在较为明显的脱祀效 应化igh-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbyCRISPR-Casnucleasesin humancells.NatureBiotechnology.Fuetal，2013 ;High-throughputprofilingof off-t曰rgetDNAcle曰V曰gereve曰IsRNA-programmedC曰s9nucleasespecificity.Nature Biotechnology.化ttanayaketal，2013)。麻省理工学院化叫Zhang团队使用双切刻技 术将化s9 的特异性提高了 50 倍^上值oublenickingbyRNA-guidedCRISPRCas9for enhancedgenomeeditingspecificity.Cell.Ranetal，2013)，维护了化39在基因打革己
技术领域的地位。借助于运一技术，动植物基因功能研究及育种等等都将得到迅猛的发展。
[0004] RelA是NFKB转录因子最重要的一个亚基。猪RelA与仔猪蓝耳病毒、猪攝病毒及 伪狂犬病毒抗体水平有显著关联化ietal. ,2011)，其单个氨基酸的改变可引起家猪对非 洲猪攝病毒（ASFV)感染能力的显著变化（Palgraveetal. ,2011)。由此可见，猪RelA基 因可作为猪抗病育种的一个重要候选基因。在细胞或个体水平上对猪RelA基因进行敲除 或修饰，可解析猪RelA基因的功能，为猪的抗病育种服务。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的在于提供一对祀向猪RelA基因的SgRNA。本发明利用编码运对SgRNA部分序列的短片段DNA构建表达载体，该表达载体能够表达出运对SgRNA,运对SgRNA 能够特异性地识别猪RelA基因。本发明还利用运对SgRNA引导化础η核酸酶（即化s9切 割酶）对猪RelA基因进行准确、高效地祀向修饰。
[0006] 具体地，本发明的目的是运样实现的：
[0007] 一对祀向猪RelA基因的sgRNA，由sgRNA-F和sgRNA-R组成；sgRNA-F和sgRNA-R 分别由102个核巧酸组成，其中5'末端第2-21位的RNA片段（2化t，分别命名为sgRNA-F20 和sgRNA-R20)可W识别猪染色体上RELA基因的特定序列，其余82nt称为骨架RNA序列。 第22-102位的RNA片段可形成发夹结构，与Cas化核酸酶结合，从而引导化础η核酸酶切 割祀标DNA单链，两个单链切口导致双链断裂值SB)，细胞利用自身修复功能，使得祀标位 点附近的序列发生变化；另外，运对sgRNA识别的DNA祀序列呈"头对头"的排布方式（即 二者的5'末端相互靠近），二者相距化P，即有化P的间隔。
[0008] 所述SgRNA-F具体可如序列表的序列2所示。
[0009] 所述SgRNA-R具体可如序列表的序列4所示。
[0010] 本发明另一个目的在于提供一对DNA分子（命名为特异DNA分子对），由编码所述 SgRNA-F的DNA分子甲和编码所述SgRNA-R的DNA分子乙组成。 W11]所述DNA分子甲具体如序列表的序列1所示。 阳01引所述DNA分子乙具体如序列表的序列3所示。
[0013] 本发明第Ξ个目的是提供上述SgRNA对在特异识别和祀向修饰猪RelA基因中的 应用。所述猪RelA基因，其NCBI登录号为ΝΜ_001114281. 1。
[0014] 本发明第四个目的是提供上述SgRNA对在构建猪RelA基因突变库中的应用。所 述猪RelA基因，其NCBI登录号为ΝΜ_001114281. 1。
[0015] 与现有技术相比，本发明提供了一对特异识别猪RelA基因的SgRNA,并提供了一 对该SgRNA的编码DNA片段，从而通过化s9系统在细胞或个体水平上对猪RelA基因进行 敲除或修饰，W解析猪RelA基因的功能、构建猪RelA基因突变库，为猪育种服务。
【附图说明】
[0016] 图1为SgRNA祀点设计结果示意图，其中箭头处代表单链切刻位点（两个单链切 口产生一个双链断裂）。
[0017] 图2为质粒对pX335-sgRNA-F与pX335-sgRNA-R共转染猪胎儿成纤维细胞72小 时后提取DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果（突变序列）。
【具体实施方式】
[0018]W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培 养细胞。
[0019]pX335载体购自Addgene，货号42335。抓SI内切酶购自肥B公司，货号R0539S。 DNA寡核巧酸均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0020]实施例1、SgRNA表达质粒对的构建
[0021] 1、SgRNA祀点设计
[0022] 在NCBI登录号为ΝΜ_001114281. 1的序列中提取猪RelA基因第十外显子的编码 区巧59-1033,如下所示），使用麻省理工学院在线软件化ttpV/crispr.mit.edu/)设计革己 标位点。
[0023] GACCCACCGACCCCC GGCCTGCAAC CCGGCGCATT GCTGTGCCTT CCCGCAGCTC AGCTTCCGTC CCCAAGCCAG
[0024] 正向祀序列是TCAGCTTCCGTCCCCAAGCC巧4-73)、反向祀序列是 GGAAGGCACAGCAATGCGCC(28-47)。两个祀序列呈"头对头"的排布方式，二者相距化p，即有 6bp的间隔。分别命名为正向祀标T1、反向祀标T2。祀标设计如图1所示。 阳0巧]2、sgRNA表达质粒对