的构建
[00%] 首先根据设计的祀序列送北京六合华大基因科技股份有限公司合成单链寡核巧 酸，具体序列如下： 阳0八]T1-FiCACCG TCAGCTTCCGTCCCCAAGCC
[0028]Tl-R：AAAC GGCTTGGGGACGGAAGCTGA C 阳0巧]T2-FiCACCG GGAAGGCACAGCAATGCGCC
[0030]T2-R：AAAC GGCGCATTGCTGTGCCTTCC C 阳03U 其中Tl-F与Tl-R退火获得带粘性末端的双链DM片段，经抓s I酶切，连入pX335 载体中，获得pX335-sgRNA-F载体；T2-F与T2-R退火获得带粘性末端的双链DM片段，经Bbs I酶切，连入PX335载体中，获得pX335-sgRNA-R载体。两个质粒均送北京六合华大基 因科技股份有限公司测序验证，测序引物化sR的序列为：5' AAAGTCCCTATTGGCGTTAC 3'。
[0032] 实施例2、通过测序验证实施例1构建的SgRNA表达质粒对的生物活性
[0033] 阳F细胞（猪胎儿成纤维细胞）：从流产的猪胎儿中分离得到阳F细胞（分离方法 参见文献：李红，魏红江，许成盛，汪霞，卿玉波，曾养志；版纳微型猪近交系胎儿成纤维细 胞系的建立及其生物学特征；湖南农业大学学报（自然科学版）；第36卷第6期；2010年 12 月；678-682)。 W34] 1、将重组质粒pX335-sgRNA-F与pX335-sgRNA-R各4yg通过电转化的方式 共转染1X106PEF细胞，得到重组细胞。转染的具体步骤是：使用核转仪（Amaxa，型号：AAD-1001巧及配套的哺乳动物成纤维细胞转染试剂盒（Amaxa，货号：VPI-1002)进行转染。 首先使用0.05%膜蛋白酶（Gibco,货号：610-5300AG)消化贴壁细胞，用胎牛血清（Gibco， 货号：16000-044)终止消化，憐酸盐缓冲液（Gibco,货号：10010-023)洗涂细胞两次，添加 转染试剂，使用程序T-016转染细胞。
[0035] 2、将步骤1得到的重组细胞37°C培养72小时，然后收集细胞。具体步骤是：首先 使用0. 05%膜蛋白酶（Gibco,货号：610-5300AG)消化贴壁细胞，用胎牛血清（Gibco,货号： 16000-044)终止消化，憐酸盐缓冲液（Gibco,货号：10010-023)洗涂细胞两次，添加200微 升细胞裂解液GAOlANGEN公司DNA提取试剂盒DP304中的组分）。 W36] 3、提取步骤2收集的细胞的基因组DNA并作为模板，用PCRF与PCRR组 成的引物对进行PCR扩增（PCRF:5 'CGGATTGAGGAGAAACGCAAAAGG3 ';PCRR: 5'AGAAACAGGAGCCCAACAGAGGG3')，回收37化P的PCR扩增产物。DNA提取具体步骤是： 使用TIANGEN公司DNA提取试剂盒（货号：DP304)提取DNA。在上一步所得裂解产物中添 加20微升蛋白酶K溶液，混匀。加入200微升缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟， 溶液变清亮，简短离屯、W去除管盖内壁的水珠。加入200微升无水乙醇，充分振荡混匀15 秒，简短离屯、W去除管盖内壁的水珠。将上述溶液加入一个吸附柱CB3中，12000巧m离屯、 30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500微升缓冲液GD， 1200化pm离屯、30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CBS中加入700微 升缓冲液PW，12000巧m离屯、30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3 中加入500微升缓冲液PW，12000巧m离屯、30秒，倒掉废液。将吸附柱CB3放回收集管中， 1200化pm离屯、2分钟。将吸附柱CB3置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残余的 漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200微 升洗脱缓冲液TE，室溫放置5分钟，12000rpm离屯、2分钟，将溶液收集到离屯、管中。
[0037] 4、将步骤3得到的PCR扩增产物与PMD18-T载体（宝生物，货号：D101A)连接，得 到连接产物。具体的连接步骤是：在微量离屯、管中配置下列DNA溶液：PMD18-T载体1微升， PCR产物4微升。加入5微升SolutionI。16°C反应30分钟。
[0038] 5、取5微升连接产物加入50微升D册α感受态细胞（宝生物，D9057巧中，冰上 放置25分钟。42 °C加热45秒，再在冰上放置5分钟。加入500微升LB培养基，37 °C振荡 培养45分钟。涂布于氨节青霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养，随机挑取20个克 隆并进行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而估算出该对sgRNA质粒的效率。 结果发现8个克隆在预期切割位点附近出现突变（详见图2)，即重组质粒pX335-sgRNA-F 与pX335-sgRNA-R组成的质粒对在阳F细胞基因组中的切割效率达40%。
[0039]
[0040] <400> 4 gg控aag谷cac a谷caaugc谷c c谷uuuua径ag cua呂aaauag ca江guueiaaa u注aggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag ug貸c过ccgag ucggugcuuu uu 102
【主权项】
1. 一对靶向猪RelA基因的sgRNA，由sgRNA-F和sgRNA-R组成，sgRNA-F和sgRNA-R分 别由102个核苷酸组成，其中5'末端第2-21位的RNA片段能识别猪染色体上RelA基因， 第22-103位的RNA片段为能与Cas9n核酸酶结合的骨架RNA片段；所述的sgRNA-F如序列 表的序列2所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列4所示。2. -对DNA分子，由编码权利要求1中的所述sgRNA-F的DNA分子甲和编码权利要求 1中的所述sgRNA-R的DNA分子乙组成。3. 如权利要求2所述的一对DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子甲如序列表的序 列1所示。4. 如权利要求2所述的一对DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子乙如序列表的序 列3所示。5. 权利要求1所述的sgRNA在特异以别和靶向修饰猪RelA基因中的应用。6. 权利要求1所述的sgRNA在构建猪RelA基因突变库中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一对靶向猪RelA基因的sgRNA，该sgRNA对由sgRNA-F和sgRNA-R组成，sgRNA-F和sgRNA-R分别由102个核苷酸组成，其中5’末端2-21位的RNA片段能识别猪染色体上RelA基因，第22-102位的RNA片段为能与Cas9n核酸酶结合的骨架RNA片段；所述的sgRNA-F如序列表的序列2所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列4所示。本发明通过Cas9n系统在细胞或个体水平上对猪RelA基因进行敲除或修饰，以解析猪RelA基因的功能、构建猪RelA基因突变库，为猪育种服务。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/11, C40B40/08
【公开号】CN105255886
【申请号】CN201510398717
【发明人】李和刚, 赵金山, 张宝珣, 李培培, 刘华伟, 江科, 王建华, 侯乐乐, 杨培培, 孙友德
【申请人】青岛市畜牧兽医研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年7月9日