子，室溫放置lOmin。为了去除残留的酒精，否则会严重影响 回收得率和后续实验结果。 W例（10)在吸附膜中央加入15-30μLd地20。室溫静置5min，9000xg离屯、Imin。！. 5血 EP管底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20°C保存。
[0070] 2. 6DNA回收片段与PMD-19T载体连接
[0071] 根据PMD19-T载体使用说明书，在灭过菌的PCR反应管中将Vector与回收DNA片 段进行T-A克隆连接，反应体系如下：
[0072]
[0073] 轻轻混匀后16°C过夜连接lOh W上，转化D册α感受态。
[0074] 2. 7连接产物转化D册α感受态
[00巧]转化感受态具体操作步骤如下：取出适量D册α感受态细胞并至于冰上冻融。在 超净工作台内向冰冷的感受态细胞中加入上述连接混合液，并用移液器吸头轻轻吸打混 匀。置于冰上20min。快速平稳放入42°C水浴中60s(热激，使细胞膜开放，重组质粒进入 细胞），并迅速放入冰水混合物中，保持2min(使细胞膜关闭）。加入500μL无抗LB液体 培养基，37°C恒溫振荡培养比。室溫下4000巧m离屯、5min，弃掉上清（保留少许培养基，约 50μL)。超净台内，用枪头轻轻吸打并重悬菌液，涂于氨节抗性平板。倒置琼脂平板于37°C， 平板通常在37°C溫育14h。
[0076] 2. 8重组子的筛选和鉴定
[0077] 用10μL小号枪头挑取平板上至少5个单菌落（每个菌落均做好标记），并置于含 有800μLLB培养基（含相应抗生素）的1. 5血ΕΡ管中，37°C振荡培养4h左右至培养基 浑浊，并对培养基浑浊的菌样进行菌检验证，菌检验证载体构建成功的菌液取ImL送上海 生工测序。利用BLAST、CLUSTALMEGA4. 0等软件对序列进行分析。
[0078] 2. 9表达载体的构建
[0079] 将测序获得完全正确的序列，提取质粒后用化ηI和甜aI双酶切中间载体 和表达载体PCAMBIA13011 (PC13011)，再用T4连接酶连接经过双酶切的PC13011载体和 miR166d前体片段，然后转化到大肠杆菌中提取质粒酶切验证。
[0080] 2. 10转化农杆菌
[0081] 2. 10. 1电击杯的处理
[0082] (1)用移液枪吸取d地20反复冲洗电击杯3-5次。
[0083] 似用75%的乙醇反复冲洗电击杯3-5次。
[0084] (3)将电击杯浸泡在无水乙醇中2h，然后倒掉乙醇，置于超净工作台中让残余酒 精挥发。
[00化](4)酒精挥发完全后，盖好电击杯盖子，室溫保存备用。
[0086] 2. 10. 2电转化
[0087] 采用仪器为伯乐公司GenePμLserXcell电穿孔仪进行感受态细胞的转化。主要 参数为：电脉冲2. 5μF、电压2. 5kV、电阻200Ω。操作步骤如下；
[0088] (1)取出保藏的农杆菌GV3101感受态细胞放置冰上融化。
[0089] 似取1 μ L质粒加入到解冻的感受态细胞中，轻轻混匀。
[0090] (3)将混合液加到电击杯中（-20°C预冷），在电脉冲为2. 5μF、电压2. 5kV、电阻 200Ω的参数条件下电击。
[0091] (4)取出电击杯，迅速加入800μL预热的无抗的YEP液体培养基，悬浮细胞后，转 移到1.5mL的离屯、管中。
[0092] (5) 28°C，220巧m震荡培养化左右。
[0093] (6)取30-40μL菌液，用无菌的涂布棒将菌液均匀的涂在含有相应抗生素YEP平 板上，倒置放入28Γ培养箱培养2-3天。
[0094] 2. 10. 3电转化农杆菌及其检测 阳0巧]将酶切验证正确的PC1301l-miRNA166d质粒转化到农杆菌GV3101中，再从农杆菌 中提取质粒后，转化到大肠杆菌中提质粒，酶切验证。验证正确的含有pC1301-miRNA166d 质粒的农杆菌，-70°C保存菌种。
[0096] 2. 11拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选
[0097] 2.11.1拟南芥的种植
[0098] (1)将野生型拟南芥种子均匀撒在1/2MS固体培养基中。
[0099] (2) 4°C冰箱避光春化处理3天。
[0100] (3) 3天后，移至培养室培养，条件为溫度23°C，光强7000-900化X，光照16小时，黑 暗8小时。 阳101] (4)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后，将其移植到含基质的盆中，继续培养。 阳102] 2. 11. 2拟南芥的遗传转化 阳10引 （1)农杆菌菌液的准备：配制含有卡那霉素和利福平的YEP固体培养基，倒平板， 划线W活化保存的农杆菌，28Γ倒置培养2天。挑单菌落至ImL含相应抗生素的Y邸液体 培养基中，28°C培养2天，再转移至lOOmL相同的培养基中扩大培养，直至培养液浑浊变为 澄色，测其0D值达到1. 2时停止培养。
[0104] (2) 4000巧m，离屯、lOmin，倒掉上清液，用浸染介质悬浮菌体。 阳1化](3)浸花法转化拟南芥
[0106]a.选取开花初期的拟南芥，将花序浸入含有目的基因农杆菌的转化介质中，约 10-20 秒。
[0107] b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养24小时。
[0108] C.第二天，放置正常条件下继续培养。 阳109]d.收获拟南芥种子，干燥。
[0110] 2. 11. 3拟南芥转基因种子的筛选及种植 阳11U (1)将转基因种子均匀撒在1/2 MS的固体培养基中（培养基中潮霉素的浓度为 50mg/L)。同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培养基中，作为对照。
[0112] 似4°C避光春化处理3天。
[0113] (3)3天后将撒有野生型拟南芥种子的培养皿打开，置于培养室中正常培养，而含 有转基因种子的培养皿则避光培养。
[0114] (4) 48小时后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。转基因成功的植株 就会生长，反之不生长。
[0115] (5)待拟南芥长出2-4片真叶后，移植到含有泥炭的盆中，继续培养。 阳116] (6)观察对照拟南芥（野生型拟南芥和拟南芥miR166d的突变体）和山核桃 miR166d转基因拟南芥的表型。
[0117] 3.实验结果
[011引 3. 1山核桃花芽总RNA提取分析
[0119]利用改良CTAB+TRizol法提取山核桃花芽总RNA，并通过紫外分光光度计测定每 个RNA样品260nm及280nm的吸光度，并W此计算RNA的浓度及纯度，并在1 %琼脂糖凝胶 电泳检测RNA的完整性。所提山核桃RNA的光密度比值均在2. 0-2. 2之间，说明总RNA基 本无糖类、酪及蛋白质的污染；电泳结果则显示RNA样品的18s和28s两条带非常清晰，可 推断RNA没有降解，符合下步实验的要求（见图1)。 阳120] 3. 2山核桃miR166d前体序列的克隆 阳12U 根据所设计的引物序列，使用PCR扩增，产物经连接到pMD19-T(simple)，菌检PCR 进行检测（图2)，并送到上海生工测序，验证了山核桃miRNA166d前体的存在。 阳122] 3. 3山核桃miR166d功能验证
[0123] 依据3. 2中所获得前体序列，进行表达载体的构建，将miRNA166d前体序列连接 至IJPC13011表达载体上，转化到D册α感受态细胞中，同时对其进行菌液PCR检测（图3)， 将连接成功的单克隆提取质粒，转化到上壤农杆菌GV3101中，进行拟南芥转基因。对山核 桃miR166d转基因拟南芥植株进行抗性筛选（如图4)，将筛选出的拟南芥提取DNA，进行 PCR检测（图5)，对转基因株系进行种植培养直至纯合后，对其表型进行观察可W发现转 基因植株叶片数目在2015年3月26日-2015年4月4日期间，明显少于野生型和拟南芥 miR166d突变体植株（图6);同时观察发现，转基因植株与拟南芥miR166d突变体和野生型 相比，花期提前（图7)。另外，转基因植株出现顶端分生组织发育受到影响，侧枝数目增多 的表型（图7)。表明：山核桃miR166d与植物的花发育及分生组织发育有关。
[0124]W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用，所述山核桃 miR166d的碱基序列如SEQIDNO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物是拟南芥或烟草。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物是拟南芥。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括：将包含所述山核桃miR166d的前体 基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述山核桃miR166d的前体基因的碱基序 列如SEQIDNO. 2所示。
【专利摘要】本发明公开了山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用。应用山核桃miR166d，有望调控植物的花期和分生组织发育。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/113
【公开号】CN105255890
【申请号】CN201510645465
【发明人】王正加, 黄坚钦, 孙志超
【申请人】浙江农林大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月8日