一种与植物抗盐性相关的基因及其在植物育种中的应用的制作方法

专利名称：一种与植物抗盐性相关的基因及其在植物育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种脱氧核糖核酸及其在植物育种中的应用。
技术背景目前，世界上有100多个国家存在着不同类型的盐碱地10亿公顷，约占全球可耕地面积 10%。我国就有216乂107公顷，其中耕地约61X1()S公顷，主要分布在新疆、甘肃等西北干 旱半干旱地区。随着工业污染加剧、灌溉农业的发展和化肥使用不当等原因，次生盐碱化土 壤面积有不断加剧的趋势，给农业生产造成重大损失。因此综合治理盐渍土、提高植物的耐 盐性、开发利用盐水资源已成为未来农业发展及环境治理所亟待解决的重要课题。近百年来，人们从基因工程角度对植物抗盐性进行了大量研究，取得了很大的进展。1987 年Hickock发现蕨类植物Cerat叩teris的配子体中的与抗盐性有关的两种单基因核突变stl,和 stl2，这两个基因位于配子体1023品系的核基因组中，该品系自交产生的同源孢子体也具有 明显的抗盐性，在孢子体第一叶期遗传分析表明，所有突变体结和型相都抗能60mmol/L NaCl，而野生型不能，其中十/stl!和stl,/stl2两种基因型的植株能在含有10Ommol/L NaCl的 培养基上生长，但对其它逆境的抗性却不如野生型(郭善利、王秀芝(1998)。"植物抗盐性 及其遗传工程"聊城师院学报自然科学版11(002): 53-58。)。热激蛋白是一种分子陪伴(moleculerchaperon)，可以使因温度升高而构型发生改变的蛋白 质恢复并维持原有的三维构象，不致丧失功能而使机体得以存活。已有研究表明，除在热胁 迫表达提高外，热激蛋白基因还在其它许多逆境如冷、干旱、重金属、病原菌等胁迫下高表 达，是植物对逆境胁迫的一种防御机制，它可作为调控基因表达的转录因子，从而调控基因 的表达，提高植物对逆境的耐受能力，如寒冷、干旱、盐渍等。唐国强等人发现用水杨酸处 理香蕉幼苗的抗寒性明显提高，并用mRNA差异显示法分离出其中两个差异片段G和A，其 中G片段的序列与大豆的两个与冷胁迫相关的高表达基因片段的部分序列有92%同源性，A 片段未发现其同源性基因片段(康国章，朱国辉，等。(2004)。"用mRNA差异显示法分 离冷胁迫香蕉幼苗叶片内水杨酸诱导表达的基因。"植物生理与分子生物学学报30(002): 225-228。)，表明这两个基因片段可能属于新的基因，但该文对这两个基因片段所在的基因 全序列以及功能均未提及。 发明内容本发明的目的在于提供一种与植物抗盐性相关的基因。 本发明的另一目的在于提供该基因在植物育种中的应用。本发明实现上述目的的技术方案是—种与植物抗盐性相关的Fl基因，其特征在于该基因的编码区序列为SEQ NO. 1。 本发明基因是从经过0.5mmol/L水杨酸和7。C冷胁迫处理的香蕉幼苗叶片中分离出来的， 命名为F1，编码区序列长1251bp，编码由416个氨基酸组成的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为 SEQ NO. 2。通过在genbank中的比对结果发现，本发明Fl基因与所编码的氨基酸序列与玉 米的热激蛋白AAC08009有88%的同源性，与水稻的热激蛋白AAX95135也有88%的同源性， 与其他基因的同源性都较低，因此可以推断本发明Fl基因所编码的蛋白质可能属于热激蛋 白。本发明人发现，将本发明F1基因转入普通植株后，植株的抗盐性明显提高，这可能与该 基因的表达产物能调节植物体内活性氧代谢系统的平衡有关。在盐胁迫下，植物体内活性氧 代谢系统的平衡受到影响，活性氧的含量大大增加，抗氧化系统的活性大大降低。本发明F1 基因在植物中表达后，其表达产物可能是作为调控基因表达的转录因子，调控活性氧代谢系 统相关基因的表达，提高细胞的抗氧化系统的活性，从而增强了植物对盐的耐受性。另一方 面，已有实验证明钙离子对盐胁迫信号调节也起着非常重要的作用，而F1基因的表达可能也 有助于维持细胞体内钙离子的内稳态。本发明F1基因可用于抗盐胁迫转基因植物的育种，具体方法可以是采用基因直接导入法 将F1基因重组整合到植物基因组中，也可以通过构建F1基因的植物表达载体并转染到植物细 胞中。所述的采用基因直接导入法将所述Fl基因重组整合到植物基因组中的方法由以下步骤 组成(1) 用引物SEQ NO. 21和SEQ NO. 22扩增所述Fl基因获得序列为SEQ NO. 1的DNA片段；(2) 将序列为SEQNO. 1的DNA片段正向插入到表达载体中构建出含有序列为SEQNO. l的DNA片段的重组载体；(3) 将序列为SEQNO. 1的DNA片段的重组载体转化到农杆菌中，然后按照农杆菌介 导转基因法将含有序列为SEQ NO. 1的DNA片段的重组载体以重组的方式整合到植物的基 因组DNA中；(4) 通过所用表达载体携带的标记筛选出成功转入序列为SEQNO. l的DNA片段的重组 载体的植株，然后将所得植株正常培养，最后收获种子，即可。其中步骤(3)中所述的农杆菌介导转基因法(floral dip)的具体操作步骤参见《A shnpUfied method for /4gro6a"en'wm-mediated transformation of i4f"6iWo; s!'s ^i"/!.a"a》(Clough SJand Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for爿gro6a"en'ww-mediated transformation ofJraZ>i<3fc /w/"/w//a"a户/a"/J16: 735-743)


图1是在3，-RACE中，通过5' CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3'和3' RACE Outer Primer引物对香蕉cDNA扩增的PCR产物电泳图，得到一条llOObp的条带。其中1为 DNA Marker DL2，000， 2为Outer PCR产物。图2是在3 ，-RACE中，通过5' CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3'禾n 3' RACE Inner Primer引物，以Outer PCR产物为模板扩增的PCR产物，其中1为DNA Marker DL2,000， 2为用Inner primer和Outer PCR产物作模板扩增的条带。图3是通过5， -RACE得到的片段的电泳图，其中，M: DNA Marker DL2, 000; 1: PCR 产物(57。C退火)；2:阴性对照(57。C退火)；3 : PCR产物(55。C退火)；4:阴性对照(55 'C退火)。图4是用引物FIFl和FlRl扩增Fl基因获得的编码区片段的电泳图。其中，2为Takara 的2000bp的Marker, 1为目的基因F1 PCR扩增产物。图5是转F1基因拟南芥植株的PCR鉴定。其中，1:质粒pMD/Fl对照，2:野生型拟 南芥植株对照，3 9: 7株转基因拟南芥的PCR结果，M: Takara的2000bp的Marker。图6是野生型和转Fl基因拟南芥幼苗含有NaCl和不含NaCl的1/2 MS固体培养基上生 长情况。其中，6-A为在不含NaCl的1/2 MS固体培养基中的生长情况图，黑线左边的是转 Fl基因拟南芥幼苗，黑线右边的是野生型拟南芥幼苗；6-B为在含有lOOmM NaCl的1/2 MS 固体培养基中的生长情况图，黑线左边的是转F1基因拟南芥幼苗，黑线右边的是野生型拟南 芥幼苗；6-C为在含有150mM NaCl的1/2 MS固体培养基中的生长情况图，黑线左边的是转 Fl基因拟南芥幼苗，黑线右边的是野生型拟南芥幼苗。图7是野生型和转Fl基因拟南芥幼苗含有NaCl和不含NaCl的1/2 MS固体培养基上生 长情况的柱型比较图，其中翻表示野生型的根长度，圜表示转F1基因型的根长度。
具体实施方式
例l本发明Fl基因的分离1、 水杨酸诱导冷胁迫香蕉幼苗差异基因的表达用0.5mmol/L水杨酸(salicylic acid, SA)在常温下以喷洒和灌根的方式对香蕉(威廉姆 斯8188M^a"c"w/"a)幼苗进行处理，常温放置1天后，而后对香蕉幼苗进行7'C低温胁迫 处理3天。2、 RNA的提取以7'C低温胁迫3天后SA处理的香蕉幼苗最上部刚全展叶片，和不施用SA(施用蒸馏水) 的低温胁迫香蕉幼苗最上部刚全展开叶片为材料，提取总RNA (核糖核酸)，再进一步分离 mRNA (信使核糖核酸)，RNA分离方法见上海生工生物工程技术服务有限公司UNIQ—10柱 式mRNA抽提纯化试剂盒使用说明。3、 cDNA的合成通过反转录将上述mRNA转录为cDNA (互补脱氧核糖核苷酸)，具体方法见上海生工 生物工程技术服务有限公司MMLV第一链cDNA合成试剂盒使用说明。4、 对上述SA处理和对照的cDNA进行差异显示分析 用两对锚定引物SEQN0.3: 5,-AAgCTuA-3， SEQ NO .4: 5 ， - A AgCT)C-3 ，和8对随机引物SEQN0.5: 5'-AAgCTTgATTgCC扁3， SEQN0.6: 5'-AAgCTTcgACTgT-3， SEQN0.7: 5'-AAgCTTTggTCAg-3' SEGN0.8: 5，-AAgCTTCTCAACg-3， SEQNO.9: 5，-AAgCTTAgTAggc-3， SEQNO.10: 5,-AAgCTTgCACCAT-3' SEQNO.ll: 5'-AAgCTTAAcgAgg-3， SEQN0.12: 5'-AAgCTTTTACCgc-3'共做了 16个引物组合的扩增，以上述SA处理和对照的cDNA为模板进行PCR扩增。 扩增程序为94" 5分钟；30个循环的94'C 15秒，65°C 30秒，72°C 2分钟；最后在 72'C延伸10分钟。扩增产物经PAGE电泳后，再进行银染显色。每个组合的银染图谱上大约 有15-50条带，共显示出的带有500多条，其中有100多条差异带。对SA诱导的高水平表 达的或诱导新出现的条带进行了回收，共回收了18条差异带。对差异片段进行反向Northern杂交，以鉴定这些差异片段的真假，发现其中7个点的杂 交亮度存在着明显差异，其中一个片段在水杨酸处理的叶片中髙表达，而在对照叶片中表达 量非常低，差异非常显著。扩增这个片段所用的引物组合为5，-AAgCTTAAcgAgg-3， ( SEQ NO.U )和 5'-AAgCT"C-3， (SEQN0.4)。把此片段回收后，克隆进pEGMeasyT载体中，然后再转入大肠杆菌中，通过蓝白斑筛选，挑选白色单菌落斑，经菌落PCR扩增验证后，对能扩增出目的条带的白色菌落进行摇菌， 取部分菌液进行测序(大连宝生物公司用ABI377测序仪测序)，测序结果表明此片段的碱基 序列为SEQ N0.13,长度为254bp。 5、基因全长的获得(1) 3'-RACE:试剂TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒(Code No. D314)，购自TaKaRa。 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A)购自TaKaRa。特异性引物SEQ NO. 14: 5' CGAGGAGGATGACGATATGCATGG3' SEQNO.15: 5' TGTCGTTGTGGTAACCTTGTGGCT 3'。 方法.-使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0，以香蕉总RNA为模板合成cDNA;以cDNA 为模板，5' CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3'和3' RACE Outer Primer—对引物进 行Outer PCR扩增。取5 pil进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示；以Outer PCR产物为 模板，5' TGTCGTTGTGGTAACCTTGTGGCT 3'和3' RACE Inner Primer两条引物，进行Inner PCR扩增。取5 ^进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示；使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A )切胶回收目的片段，并将此片段克隆到 pMD18-T上，经蓝白斑筛选，挑选阳性菌落，进行摇菌，测序，得到基因的3'端序列SEQ N0.16。(2) 5，-RACE: 试剂First Choice RLM-RACE试剂盒，购自AmbionTaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A)购自TaKaRa 7b/:ai a丄J 7^ ,购自ro^a及aTaKaRa DNA Ligation Kit<Mighty Mix〉(Code No.D6023)，购自Kr/:a及" pMD 18-T simple Vector (Code No. D104),购自r"/:ai c(。 特异性引物SEQNO.17: 5' ATTAGGGTTCGGTCGGCAAGATGT 3' SEQNO.18: 5' AGCCACAAGGTTACCACAACGACA 3'。方法-使用First Choice RLM-RACE试剂盒对香蕉Total RNA进行去磷，去帽并与5' RACE Adaptor连接后反转录成cDNA。然后使用ra《ai a " 7^ ，以5' RACE Outer Primer和5'ATTAGGGTTCGGTCGGCAAGATGT-3' —对引物进行Outer PCR扩增，再以Outer PCR产物为模板，5' RACE Inner Primer和5' -AGCCACAAGGTTACCACAACGACA-3'为引物进行Inner PCR扩增。取5pl进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A)切胶回收上述片段。使用TaKaRa DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Code No.D6023)中的连接酶，将上述PCR产物(CTA856-1)与 pMD18-T simple Vector (Code No. D104)连接后，热转化至大肠杆菌(CodeNo.D9052)中， 涂布平板，37'C过夜培养，挑选阳性菌落摇菌，提取质粒后，将质粒DNA进行测序，得基 因的5'端序列SEQN0.19。把此序列与上述通过差异显示得到的片段序列进行同源性比较分析，发现存在着许多相 同的序列，表明得到了完整的5'端序列。(3)全长的获得把通过差异显示得到的基因片段、3'-RACE和5'-RACE得到的序 列进行拼接，从而得到了此基因的全长序列SEQ NO.20,全长1783bp，包括221bp的5'-非编码区、299bp的3'-非编码区、1251bp的编码区、终止子和12bp的多聚腺苷酸尾，其编 码区位于基因全长的第222bp-1472bp之间。6、基因全长的同源性比较本发明基因的CDS为SEQNO.l, 1251bp，编码了417个氨基酸，其中富含亲水性氨基 酸，在GenBank中进行对其编码域(CDS)序列进行同源性比较，结果显示，未发现同源性 高的的基因，证明本发明基因为新的香蕉基因。本发明基因所编码的氨基酸与玉米的热激蛋 白AAC08009有88%的同源性，与水稻的热激蛋白AAX95135也有88%的同源性，表明所获 得的全长基因可能是一种热激蛋白基因。本发明F1基因编码的氨基酸与玉米AAC0800热激蛋白的比较结果如下所示 Identities = 372/419 (88%), Positives = 397/419 (94%), Gaps = 3/419 (0%)F1 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKNASQEDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPK+ASQ+DLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV AAG0800 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKSASQDDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60-NPFDIFESFFGGNPFGGGGSSRGRRQRRGED 119LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGG H +PFDIF SFFG + GGGGSSRGRRQRRGEDAAC0800 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGSHVDPFDIFSSFFGPSFGGGGGSSRGRRQRRGED 120F1 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICQKCKGKGSKSGASMKCSGCQGSGMKVTIRQLG 179V+HPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVIC KCKGKGSKSGASM+C GGQGSGMKVTIRQLGAAC0800 WHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICSKGKGKGSKSGASMRCPGCQGSGMKVTIRQLG 180F1 PGM IQQMQHPCNECKGTGETINDKDRCPQCKGEKWPEKKVLEVIVEKGMQNGQKITFPG 239P MIQQMQ PCNEGKGTGE+IN+KDRCP CKGEKV+ EKKVLEV VEKGMQ+ QKITFPG AAC0800 PSMIQQMQQPCNEGKGTGESINEKDRCPGCKGEKVIQEKKVLEVHVEKGMQHNQKITFPG 240F1 EADEAPETVTGDIVFVLQQKDHPKFKRKGDDLFYEHALSLTEALCGFRFVLTHLDNRQLL 299EADEAP+TVTGDIVFVLQQKDH KFKRKG+DLFYEH LSLTEALCGF+FVLTHLDNRQLLAAC0800 EADEAPDTVTGDIVFVLQQKDHSKFKRKGEDLFYEHTLSLTEALCGFQFVLTHLDNRQLL 300F1 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMRGKLYIHFTVDFPDSMTPEQCKALEAVLPP 359IKS+PGEWKPDQFKAINDEGMP+YQRPFM+GKLYIHFTV+FPDS+ PEQCKALE VLPPAAC0800I KSDPGE雨PDQFKA INDEGMPIYQRPFMKGKLYIHFTVEFPDSLAPEQCKALETVLPP 360F1 KPASQMTDMELDEGEETTLHDV-NIEEEMRRKQAQ-AQEAYEEDDDMHGGAQRVQCAQQ 416+P+S++TDME+DEGEETT+HDV NIEEEMRRKQA AQEAYEEDD+M GGAQRVQCAQQAAC0800 RPSSKLTDMEIDECEETTMHDVNNIEEEMRRKQAHAAQEAYEEDDEMPGGAQRVQCAQQ 419 本发明所述的Fl基因编码的氨基酸与水稻AAX95135热激蛋白的比较结果如下所示:Identities = 371/418 (88%), Positives = 391/418 (93%), Gaps = 4/418 (0%)F1 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKNASQEDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPK ASQ+DLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEVMX95135 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKTASQDDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60F1 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGGH-NPFDIFESFFGGNPFGGGGSSRGRRQRRGED 119LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGG H +PFDIF S P GGGSSRGRRQRRGED AAX95135 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGSHVDPFDIFSS--FFGPSFGGGSSRGRRQRRGED 1189F1 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICQKCKGKGSKSGASMKGSGGQGSGMKVTIRQLG 179VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNV+G KGKGKGSKSGASM+G GCQGSGMK+TIRQLG AAX95135 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVLCAKCKGKGSKSGASMRCPGCQGSGMKITIRQLG 178F1 PGM IQQMQHPCNEGKGTGETINDKDRGPQGKGEKVVPEKKVLEVIVEKGMQNGQKITFPG 239P M睡Q PCNECKGTGE+麵DRCP CKGEKV+ EKKVLEV VEKGMQ+ QKITFPG AAX95135 PSMIQQMQQPCNECKGTGESINEKDRCPGCKGEKVIQEKKVLEVHVEKGMQHNQKITFPG 238F1 EADEAPETVTGDIVFVLQQKDHPKFKRKGDDLFYEHALSLTEALCGFRFVLTHLDNRQLL 299EADEAP+TVTGDIVFVLQQKDH KFKRKGDDLFYEH LSLTEALGGF+FVLTHLDNRQLL AAX95135 EADEAPDTVTGDIVFVLQQKDHSKFKRKGDDLFYEHTLSLTEALCGFQFVLTHLDNRQLL 298F1 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMRGKLYIHFTVDFPDSMTPEQGKALEAVLPP 359IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFM+GKLYIHFTV+FPDS+ PEQCKALEAVLPP AAX95135 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMKGKLYIHFTVEFPDSLAPEQCKALEAVLPP 358F1 KPASQMTDMELDEGEETTLHDV-NIEEEMRRKQAQAQEAYEEDDDMHGGAQRVQCAQQ 416KPASQ+T+ME+DEGEETT+HDV NIEEEMRRKAQEAY+EDD+M GGAQRVQCAQQ AAX95135 KPASQLTEMEIDECEETTMHDVNNIEEEMRRKAQAAQEAYDEDDEMPGGAQRVQCAQQ 416例2转Fl基因拟南芥的制备 1、实验材料拟南芥(Arabidopsis thaliana)， Columbia生态型(Col-O)，在温室中(22 ± 2°C，长 日照16 h光照，8h黑暗)种植取拟南芥种子灭菌后，均匀地平铺1/2 MS+kan抗生素固 体培养基(1.0 %的琼脂)上，在超净台上将平板吹干。4'C冰箱放置春化培养3天后，22°C 光照培养箱中培养7天或8天，挑选生长到一定程度且长出绿色叶片的幼苗转种到营养土中， 供给适宜水分，在温室中培养。pMD载体，由Scofield, S. R.教授惠赠，该载体相关的文章发表在《Molecular basis of gene-forgene specificity in bacterial speck disease of tomato》(Scofield， S.R.， Tobias, C.M.， Rathjen，丄P., Chang,丄H.， Lavelle, D.T., Michelmore, R.W. and Staskawicz, B.丄(1996) Molecular basis of gene-forgene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science274:2063-2065.)，在各国菌种保藏中心或生物公司均可购得。LB培养基配方:10g Trypton, 5g Yeast extract, 5g NaCl， 1.5g琼脂，pH 7.3-7.4。质粒提取试剂盒(UNI&—10柱式质粒小量抽提试剂盒)，DNA回收试剂盒(UNIQ—IO柱 式DNA胶回收试剂盒)以及PCR相关试剂均购于上海生物工程有限公司。未说明的试剂，如配制MS培养基的药品、琼脂糖、酚、氯仿、异戊醇、甲醇、乙醇、甲 酸等，均为国产分析纯以上等级试剂。引物由上海生物工程有限公司合成。2、转F1基因拟南芥的制备 (1)目的基因的处理将实施例1所得F1基因用以下引物进行PCR扩增F1F1 (SEQN0.21): 5' CGGGATCCATTAGGGTTCGGTCG 3'，F1R1 (SEQNO. 22): 5' CGGGATCCTCACTGCTGAGCACATTG 3';反应体系为5 nl 3 pl 1 pl 3 |dl 3 pl 1 pl 1 |il 33 ^d;10x Buffer MgC12 d,F1F1 (SEQ NO. 20) F1R1 (SEQ NO. 21) Temple Taq ddH20反应程序为 94 'C变性3 min; 94 。C变性60sec 55 。C复性80sec卜30个循环； 72 。C延伸60sec 一 72 。C延伸10 min。 PCR扩增结果如图4所示。 (2) pMD载体的处理a.用质粒提取试剂盒并按说明书中的方法从含有pMD质粒的大肠杆菌中提取出pMD质粒;b. 用BamHI酶切所得pMD质粒，使其线性化，方法是取pMD质粒150(al、 10x Bam Buffer 20nl和BamHI 3^1，混合，用无菌水补充到20(^1， 37。C反应过夜。c. 用碱性磷酸酶处理己线性化的pMD质粒，使其去磷酸化，方法是取已线性化的载体 500 ng、 10X Buffer 3^1和碱性磷酸酶(CIAP， 2 U/nl)lpl，混合，用无菌水补充到30pl， 点动离心，然后37'C条件下温育30 min;再加入lpl CIAP， 37"C条件下温育30 min;最后 加入O. 1M EDTA(pH 8.0)，使其终浓度为5mM， 65。C条件下处理1 h，终止反应。(3) Fl/pMD重组质粒的构建将步骤(1)所得的扩增产物和步骤(2)所得产物用T4 DNA连接酶混合，于16'C反应 过夜。(4) 转F1基因拟南芥的制备① 将Fl/pMD重组质粒转化DH5a，提取Fl基因正向插入的Fl/pMD重组质粒。a. 感受态细胞的制备将-2CTC或-8(TC贮存的DH5a原始菌液于LB平板上37。C培养16 h 活化后，从该平板上挑取一个单菌落分别在LB、 LB/Amp和LB/kan三种平板上划线，37。C培 养16h，后二者用于检査保存的菌种是否被污染，如果后二者都没有DH5(x生长，表明菌种没 有没污染。挑取单菌落接种于IO ml LB液体培养基中，37°C， 250r/min培养过夜；取l ml 菌液转接到50ml 2xLB液体培养基(30。C预热)中，37°C、 250r/min培养大约3h到OD达到 0.45左右；冰上放置2h; 4°C， 3000r/min离心5min;弃上清，将沉淀重悬于25 ml预冷的 100mMCaCl2中，冰上放置30-60min; 4°C， 3000 r/min离心5min;弃上清，沉淀重悬于5 ml 冰上预冷的lOOmM CaCl2中；加入1. 6 ml 80%的甘油至终浓度为20%;液氮中速冻，置于-80 'C保存备用。b. 转化方法将步骤a制备的感受态细胞置于冰上，待其融化后，加入Fl/pMD重组质粒， 轻敲壁以混匀；置于混合物冰上30min;于42'C水浴中热激45s，迅速置于冰中静置2min， 然后加入800ul LB液，37'C 100r/min培养lh;涂布于LB/Kan抗生素固体培养基上，吹干，37 。C培养16h。c. 挑取LB/Kan抗生素固体培养基上的单菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，然后用 引物35S (SEQN0.23)和F1R1 (SEQN0.22)进行PCR扩增，能被扩增的质粒则为Fl基因正 向插入的Fl/pMD重组质粒。② 转化农杆菌。a.感受态农杆菌制备将农杆菌GV3101划线在LB (Gen 25pg/ml)固体培养基，28。C培 养48 h;挑取单菌落接种到50ml LB (Gen 25吗/ml)液体培养基中，250 rpm悬浮培养约24 h; 4°C， 8000 rpm，离心8 min;弃上清，用4。C预冷的100mM CaCl2重悬农杆菌；4°C， 8000卬m，离心8min;弃上清，加入原始菌液1/50体积的100mM CaCl2重悬菌体，置液氮中10秒 钟，放入一8(TC冰箱中保存备用；b.转化将感受态农杆菌置于冰上，加入Fl基因正向插入的Fl/pMD重组质粒，充分混 匀，置冰上30 min;置液氮中l分钟，迅速转入37t:水浴中，待其融化；加入lml LB液体 培养基，28°C， 250 rpm培养2 4 h; 6000 rpm离心2 min，将上清吸去500^1，振荡重悬 菌体，并涂布到LB (Gen25ng/ml， Kan50ng/ml)固体培养基上，吹干；28°C，培养48 h; 挑取单菌落接种到LB (Gen25ng/ml, Kan 50 pg/ml)液体培养基中，28°C， 250rpm培养48h。③ 将转化后的农杆菌于22'C、 5500rpm离心20min，去上清，用转化介质重悬；采用的 拟南芥转化方法是floral dip方法(Clough SJ and Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for々TO6wfe,/ww-mediated transformation of XraZ^o/w^ // "/z'a肌/V朋f J16: 735-743); 取出转化过的拟南芥植株，避光保湿过夜。④ 第二天将拟南芥放置在光下，正常培养，待其所有的角果完全枯黄、开裂时，即可收 种子。⑤ 取所收种子，重悬于10倍体积含0. 01% Triton X-100的5XNaC10溶液中，放置5min， 期间童悬数次；除去NaC10溶液，用0. 1%的琼脂重悬种子，移至含50(ag/ml Kan的1/2 MS 固体培养基上，均匀地平铺，吹干；4t:冰箱放置2d，移至温室中，保证有充足的光照；约7 d左右即可分辨出已转入Fl/pMD重组质粒的拟南芥幼苗和野生型拟南芥幼苗已转入Fl/pMD 重组质粒的植株具有Kan抗性，所以子叶为绿色，下胚轴较长，并具有较长的主根；而野生 型没有Kan抗性，所以子叶为黄色，根较短；将绿色的拟南芥幼苗移至己用营养液浇透的营 养土中，用薄膜保湿过夜。第二天移至光下，同野生型一样正常生长。(5)转基因拟南芥的鉴定 ①提取转基因植株T1代叶片的DNA，用引物F1F1 (SEQ N0. 21)和F1R1 (SEQ NO. 22) 进行PCR扩增，PCR反应体系为DNA模板 10-100 ng10XPCR Buffer 2. 0 P 12 mM dNTP 2. 0 wl25 mM MgCl2 1.5" 10 raM F1F1 0. 2u 110 mM F1R1 0.2ul Taq Polymerase (5胁l) 0. 2|4 ddH20 补充到20 W。PCR扩增程序为-94。C 3 min; 94。C 1 min，55。C 1 min，卜35 cycles; 72°C 1 min， > 72。C 10 min; 4。C foreverc②取扩增产物5 iU在1.5%的琼脂糖凝胶上检测，检测结果如图5所示。3、盐胁迫条件对野生型和转Fl基因拟南芥幼苗的影响(1) 实验方法① 各取野生型和突变体种子50粒左右，装入1.5 ml离心管中。② 经过表面灭菌后，通过0.1%的琼脂将种子分散地铺在1/2 MS固体培养基上，吹干。③ 4'C放置2天后移入温室，竖直生长4天。④ 再将根长有1 1. 5 cm的野生型和突变体幼苗移至含有NaCl的1/2 MS固体培养基上。 (D倒置竖直生长5天，观察表型。(2) 实验结果如图6-A、 6-B、 6-C和图7所示，转Fl基因拟南芥在不含NaCl的1/2 MS 固体培养基中正常生长、和野生型没有明显差异；但在含100mM和150mM NaCl的1/2 MS固 体培养基中，野生型拟南芥的幼苗的根较短，植株瘦小，明显发育不良，而本发明转F1基因 拟南芥含lOOmM NaCl的1/2 MS固体培养基中仍能正常生长，生长情况和在不含NaCl的1/2 MS固体培养基中差异不大，在150mM NaCl的1/2 MS固体培养基中生长受到较明显抑制，但 总体生长情况也野生型的植株好。可见，本发明Fl基因转入植物体内后能在盐胁迫环境下表 达，并帮助植物提高对盐胁迫环境的抵抗能力。序列表<110>广州大学<120> —种与植物抗盐性相关的基因及其在植物育种中的应用<130〉康国章，朱国辉，等。(2004)。 〃用mRNA差异显示法分离冷胁迫香蕉幼苗叶片内水 杨酸诱导表达的基因。 〃植物生理与分子生物学学报30(002): 225-228。〈160〉 23<170〉 Patentln version 3.3<210〉 1〈211〉 1251〈212〉 薩〈213> Musa acumina〈220〉<221> CDS〈222> (1)..(1251)<400> 1atg ttc ggg agg gcg ccg aag aag agc gac aac acc aag tac tac gag 48 Met Phe Gly Arg Ala Pro Lys Lys Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Tyr Glu 15 10 15ate etc ggg gta ccg aag aac gcg teg cag gag gac etc aag aag gec 96 lie Leu Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Gin Glu Asp Leu Lys Lys Ala 20 25 30tac cgt Tyr Arg鄉 Lys 35gcc Alagcc Alaate lieaag LysAsn 40C3CHisccc Progat Asp犯g Lysggt Gly 45ggc Glygeit Aspcca Pro144gag aag Glu Lys 50ttc Phe鄉 Lysgag Gluttg Leugcc Ala 55Ginget Alatat Tyrgag Glugtt Val 60ctg Leuage Sergat Aspcct Pro192g3g aaa Glu Lys 65cgtGluatt lietat Tyr 70gat Aspcag Gintat Tyrggt GlyGlu 75gat Aspgcc Alaetc Leu卿 Lysg3gGlu 80240gg￡i atg Gly Metggt Glyggt GlyGly 85ggt Glyggc GlyC3CHisaac Asncca Pro 90ttc Phegat Aspate liettc Pheg3gGlu 95teg Ser288ttc ttc Phe Pheggt Glygga Gly 10033t Asnccc Prottc Phegga Glygga Gly 105ggc Glygga Glyage Ser3gtSercgc 110gga GlyCg3Arg336agg cag Arg Ginagg Arg 115agg Arggga Glygag Glugat Aspgtg Val 120ate liecat Hiscct Proctg Leu幼g lys 125gtg Valtct Serttg Leu384gag gac Glu Asp 130etc Leutac TyrAsnggg Gly3CCThr 135teg Ser鄉 LysLyseta Leutec Ser 140ctt Leuteg Seregg Argaat Asn432gtc ate Val lie 145tgc CysC33Gin卿Lystgc Cys 150aag Lysggg Gly卿 Lysggt Glyteg Ser 155肪g Lystct Serggt Glyget Alatea Ser 160480<formula>formula see original document page 17</formula>gtg ttg acc cat ttg gat aac aga cag eta ctg att aag tec aac ccc 912 Val Leu Thr His Leu Asp Asn Arg Gin Leu Leu lie Lys Ser Asn Pro 290 295 300ggt gaa gtt gtg aag ccc gat caa ttc aag gca ate aat gac gag ggc 960 Gly Glu Val Val Lys Pro Asp Gin P'he Lys Ala lie Asn Asp Glu Gly 305 310 315 320atg ccg atg tac cag agg ccc ttc atg agg ggg aag etc tac ate cac 1008 Met Pro Met Tyr Gin Arg Pro Phe Met Arg Gly Lys Leu Tyr lie His 325 330 335ttc acc gtg gac ttc cca gat tea atg aca cca gaa cag tgc aaa gcg 1056 Phe Thr Val Asp Phe Pro Asp Ser Met Thr Pro Glu Gin Cys Lys Ala 340 345 350etc gag get gtt ctt ccc cca aag cct gca teg cag atg acc gac atg 1104 Leu Glu Ala Val Leu Pro Pro Lys Pro Ala Ser Gin Met Thr Asp Met 355 360 365gag ctg gat gag tgc gag gag acg aca ttg cat gat gtt aac ate gag 1152 Glu Uu Asp Glu Cys Glu Glu Thr Thr Uu His Asp Val Asn lie Glu 370 375 380gaa gag atg cgc agg aag cag get cag gca cag gag get tac gag gag 1200 Glu Glu Met Arg Arg Lys Gin Ala Gin Ala Gin Glu Ala Tyr Glu Glu 385 390 395 400gat gac gat atg cat ggt ggt gcc cag aga gtg caa tgt get cag cag 1248 Asp Asp Asp Met His Gly Gly Ala Gin Arg Val Gin Cys Ala Gin Gin 405 410 415tga 1251〈210〉 2<211> 416〈212> PRT<213〉 Musaacumina〈400> 2Met Phe Gly Arg Ala Pro Lys Lys Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Tyr Glu 15 10 15lie Leu Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Gin Glu Asp Leu Lys Lys Ala 20 25 30Tyr Arg Lys Ala Ala lie Lys Asn His Pro Asp l>ys Gly Gly Asp Pro 35 40 45Glu Lys Phe Lys Glu Uu Ala Gin Ala Tyr Glu Val Uu Ser Asp Pro 50 55 60Glu Lys Arg Glu lie Tyr Asp Gin Tyr Gly Glu Asp Ala Leu Lys Glu 65 70 75 80Gly Met Gly Gly Gly Gly Gly His Asn Pro Phe Asp lie Phe Glu Ser 85 90 95Phe Phe Gly Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Gly Arg 100 105 11019Arg Gin Arg Arg Gly Glu Asp Val lie His Pro Leu Lys Val Ser Leu 115 120 125Glu Asp Leu Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Lys Leu Ser Leu Ser Arg Asn 130 135 140Val lie Cys Gin Lys Cys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser 145 150 155 160Met Lys Cys Ser Gly Cys Gin Gly Ser Gly Met Lys Val Thr lie Arg 165 170 175Gin Leu Gly Pro Gly Met lie Gin Gin Met Gin His Pro Cys Asn Glu 180 185 190Cys Lys Gly Thr Gly Glu Thr lie Asn Asp Lys Asp Arg Cys Pro Gin 195 200 205Cys Lys Gly Glu Lys Val Val Pro Glu Lys Lys Val Leu Glu Val lie 210 215 220Val Glu Lys Gly Met Gin Asn Gly Gin Lys lie Thr Phe Pro Gly Glu 225 230 235 240Ala Asp Glu Ala Pro Glu Thr Val Thr Gly Asp lie Val Phe Val Leu 245 250 255Gin Gin Lys Asp His Pro Lys Phe Lys Arg Lys Gly Asp Asp Leu Phe 260 265 270Tyr Glu His Ala Leu Ser Leu Thr Glu Ala Leu Cys Gly Phe Arg Phe 275 280 285Val Leu Thr His Leu Asp Asn Arg Gin Leu Leu lie Lys Ser Asn Pro 290 295 300Gly Glu Val Val Lys Pro Asp Gin Phe Lys Ala lie Asn Asp Glu Gly 305 310 315 320Met Pro Met Tyr Gin Arg Pro Phe Met Arg Gly Lys Leu Tyr lie His 325 330 335Phe Thr Val Asp Phe Pro Asp Ser Met Thr Pro Glu Gin Cys Lys Ala 340 345 350Leu Glu Ala Val Leu Pro Pro Lys Pro Ala Ser Gin Met Thr Asp Met 355 360 365Glu Leu Asp Glu Cys Glu Glu Thr Thr Leu His Asp Val Asn lie Glu 370 375 380Glu Glu Met Arg Arg Lys Gin Ala Gin Ala Gin Glu Ala Tyr Glu Glu 385 390 395 400Asp Asp Asp Met His Gly Gly Ala Gin Arg Val Gin Cys Ala Gin Gin 405 410 415〈210〉 3 〈211> 16 <212> DNA <213>人工序列〈400〉 3aagctttttt ttttta 16<210> 4〈211〉 16<212> DNA <213〉人工序列〈400〉 4aagctttttt tttttc 16<210> 5<211〉 13〈212> DNA <213>人工序列〈400〉 5aagcttgatt gcc 13〈210〉 6<211> 13〈212> DNA <213〉人工序列〈400> 6aagcttcgac tgt 13〈210〉 7<211> 13<212> DNA 〈213〉人工序列<400> 7aagctttggt cag 13〈210> 8<211〉 13 <212>腿 <213>人工序列<400> 8aagcttctca acg 13<210〉 9〈211〉 13<212> 腿 〈213〉人工序列〈 9aagcttagta ggc 13<210> 10〈211〉 13〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈400> 10aagcttgcac cat 13〈210〉 11〈211〉 13〈212> 腿 〈213〉人工序列〈400〉 11aagcttaacg 3gg 13〈210〉 12<211> 13〈212> DNA 〈213〉人工序列<400〉 12aagcttttac cgc 13〈210〉 13〈211〉 254<212> 腿< 213 > Musa acumina<400> 13aagcttaacg aggaggatga cgatatgcat ggtggtgccc agagagtgca atgtgctcag 60 cagtgagcaa aaatcttttt ggaatcagct gagttcgtga tgagctccgt actctttcag 120ttgtctgcgt actgattact gtgtcgatca ttgtcgttgt ggtaaccttg tggccgaaca 180 ctatacctag ttcatgttgt cttgttcacg tttaaaccga tctcctcgat cttttctgga 2403333333333 gCtt〈210〉 14<211> 24〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈400〉 14cgaggaggat gacgatatgc atgg〈210〉 15〈211〉 24<212〉 DNA <213>人工序列〈400> 15tgtcgttgtg gtaaccttgt ggct〈210> 16<211> 370〈212> 腾<213> Musaacumina<400> 16254242425cgaggaggat gacgatatgc atggtggtgc ccagagagtg caatgtgctc agcagtgaac GOaaaaatcttt ttggaatcag ctgagttcgt gatgagctcc gtactctttc agttgtxtgc 120gtactgatta ctgtgtcgat cattgtcgtt gtggtaacct tgtggctgaa cactat&cct 180agttcatgtt gtcttgttca cgtttaaacc gatctcctcg atcttttctg gaaacattct 240cttattccat gagcatatgt gaggtgcaat cgaggcagaa gaacattact accatcgtta 300tttgtttgac tgatatttta 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权利要求
1、一种与植物抗盐性相关的F1基因，该基因的编码区序列为SEQ NO.1。
2、 权利要求1所述Fl基因在抗盐胁迫转基因植物育种中的应用。
3、 一种抗盐胁迫转基因植物育种的方法，该方法由以下步骤组成(1) 用引物SEQ NO. 21和SEQ NO. 22扩增权利要求1所述Fl基因获得序列为SEQ NO. 1 的DNA片段；(2) 将序列为SEQNO. 1的DNA片段正向插入到表达载体中构建出含有序列为SEQNO. 1的DNA片段的重组载体；(3) 将序列为SEQNO. 1的DNA片段的重组载体转化到农杆菌中，然后按照农杆菌介 导转基因法将含有序列为SEQ NO. 1的DNA片段的重组载体以重组的方式整合到植物的基 因组DNA中;(4) 通过所用表达载体携带的标记筛选出成功转入序列为SEQ NO. 1的DNA片段的重 组载体的植株，然后将所得植株正常培养，最后收获种子，即可。
全文摘要
本发明提供了一种与植物抗盐性相关的F1基因，该基因是从经过0.5mmol/L水杨酸和7℃冷胁迫处理的香蕉幼苗叶片中分离出来的，编码区序列为SEQ NO.1，编码由416个氨基酸组成的蛋白。本发明还提供了一种利用本发明F1基因培育抗盐转基因植物的方法，该方法是通过农杆菌介导将本发明F1基因以重组的方式整合到植物基因组DNA中。
文档编号C12N15/82GK101255428SQ20081002560
公开日2008年9月3日 申请日期2008年1月3日 优先权日2008年1月3日
发明者康国章, 杨礼香, 王正询 申请人:广州大学