生产转基因植物的方法

专利名称：生产转基因植物的方法
技术领域：
已经常规地大批量地且自动化地进行了植物的快速繁殖 (micropropagation)。在快速繁殖中，通常采取外植体，并将其置于一 种再生培养基中，后者在再生过程期间必须保持新鲜，以生成一系列的 植物。这与转化过程形成对比，后者设计用于生成新的转基因事件，且 要求外来DNA整合入植物细胞中。难以使植物组织培养过程、尤其是 转化过程自动化。植物组织经历不同的阶段，这些阶段需要不同种类的 生长培养基和条件。转化过程需要多个步骤和多种培养基。例如，在土 壤杆菌(^gra/^"eni/m )介导的转化中，该过程从分离可再生的且可转 化的外植体开始。然后，用在接种培养基中的土壤杆菌接种外植体。接 种后，通常去除多余的土壤杆菌，且将外植体和土壤杆菌一起共培养， 以允许DNA转移。共培养后，土壤杆菌的存在对植物组织培养是有害 的(例如，在后续操作和组织培养步骤中造成不希望的污染)，所以通常 将外植体移至含有抑制土壤杆菌生长的抗生素的新鲜培养基中。该培养
基可以含有或不含选择剂。如果不含有，则它称作延迟或静止培养基。 可以将外植体置于延迟培养基上，以允许生长一段时间，然后任选地置 于选择培养基上。其它规程将外植体直接置于选择培养基中，用于选择
转基因事件。选择方式依赖于选择剂和外植体系统广泛变化。经常使用 多个选择步骤，且不同的选择剂的量在不同步骤中是必需的。选择转基 因事件后，然后将活的转基因事件移至再生培养基，用于再生以后可以 移至土壤中的小植林。迄今为止，转化过程费时且费力，且不能大规模 实现。使转化过程自动化，可以允许用减少的劳动力、材料和人类工程 (ergonomic)负担生成大量转基因植物。
本发明通过提供在一个容器中进行一些或全部转化步骤和任选的 一些再生步骤的方法和装置，已经克服了前述转化中的限制。因而，本发明的方法通过消除继代培养植物组织和改变培养基所需的费时步骤， 克服了现有转化规程的缺陷。所述方法和装置特别适用于转化自动化、 再生自动化和/或转化的细胞、组织和植物的大规模生产。
基因组学的发明已经使得能鉴别和分离大量基因，且已使得对可靠 的且有效的高通量转化生产系统的需要成为必要的，所述系统通过将这 些基因转化进经济上重要的农作物例如玉米测试这些基因的效用。现有
的玉米转化方法至少需要4个转移步骤，从选择转化细胞的步骤至将转 基因植物移至土壤的步骤，从而需要更高的材料成本(例如，培养板和 培养基)和劳动力成本。由于重复移动，几种手工组织转移也增加人类 工程损害的危险。
因而，玉米转化领域需要用于植物转化、选择和再生的高通量自动 化系统，其可以生成大量转基因植物，用于测试基因和生产有用的植物， 同时降低材料和劳动力成本。本领域也需要可以降低人类工程损害的危 险的方法，从而使工作场所更安全。
在本文中，发明人提供了适用于高通量自动化系统的选择和再生转 化的玉米植物的玉米转化方法。该方法采用合适的支持基质以及液体选 择和再生培养基。使用该液体培养方法消除了对在选择和再生步骤中使 用固体培养基时正常需要的多个转移的需要。此外，该方法使得能实现 提前再生，迄今为止这是液体培养基的一个问题。另外，可以在单个容 器例如圣代(sundae)杯中实现选择转化的细胞和再生的步骤，直至将植 物移至土壤。
发明概述
本发明通过提供在容器中稳定地转化和任选地选择和部分地再生 植物的方法，提供了使植物转化过程自动化的新颖方法。在有些实施方 案中，单个容器可以用于进行本发明的方法。在其它实施方案中，为了 容易使用和最优化本发明，可以提供多个容器(例如，互连容器系统)。
在本发明的一个方面，提供了生产转基因玉米植物的方法。该方法 包含，得到可转化的玉米外植体；转化所述可转化的玉米外植体；在选
基1将^化的;田胞再生成植物，其中所述转化、选择和再生在相同^器 中实现。任选地，可以省略在容器中的选择，且转基因的小植抹或转基因植物可以在置于土壤中之后进行选择(例如，喷洒选择剂)。
所述容器可以是生物反应器、Petri板(Petri plate)、多孔板、烧瓶、 罐、弁瓦、壶、PlantConTM、暂时浸没系统(temporary emersion system) 和它们的组合，且配有提供和取出培养基的装置。在有些实施方案中， 所述容器是Petri板、多孔板、PlantCon或暂时浸没系统。
外植体可以选自愈伤组织、胚和细月包悬浮液。
培养基可以是液体培养基、固体培养基或它们的组合。在一个实施 方案中，选择培养基是固体培养基，且再生培养基是覆盖在固体选择培 养基上的液体培养基。
可以使外植体暂时接触培养基。在一个实施方案中，大约每12至 24小时，使外植体接触选择培养基和再生培养基约1至约5分钟。
在本发明的另 一个方面，提供了得到用于生产转基因玉米植物的外 植体的方法。该方法包含，将愈伤组织分成更小的愈伤组织块。在一个 实施方案中，所述愈伤组织是I型愈伤组织。
在本发明的另 一 个方面，提供了制备用于接种外植体的土壤杆菌细 胞悬浮液的方法。该方法包含，向诱导培养基中直接培养冷冻的土壤杆 菌甘油原种。
在本发明的另一个方面，提供了包含可转化的和胚发生的细胞的玉 米细力包i条养物。
在本发明的另 一 个方面，提供了生产玉米可转化的和胚发生的细胞 培养物的方法。该方法包含，从玉米胚得到愈伤组织，和在液体培养基 中培养愈伤组织约5天至30天，以生成细胞培养物。在一个实施方案 中，所述愈伤组织是II型愈伤组织。
附图简述


图1 pMON30113的示例性质粒图谱。
详述
下面的定义将有助于理解本发明的描述。 "愈伤组织"是指细胞或组织的去分化的繁殖块。 "外植体"是指能被转化且随后再生成转基因植物的植物部分。 一般 的外植体包括未成熟的胚、愈伤组织、子叶、分生组织、叶或茎。"组织培养基，，是指用于在非土壤环境中支持植物生长和发育的液 体、半固体或固体培养基。合适的植物组织培养基是本领域技术人员已 知的，如后面所详细讨论的。培养基组分可以从本文提及的那些以外的
养基组分进行最优化:'、 '》、、'、'"
"编码序列"、"编码区，，或"可读框，，是指编码蛋白、多肽或肽序列的 连续的按序的核酸三联体区域。
"内源的"是指从生物或细胞内起源的材料。
"外源的，，是指从生物或细胞外起源的材料。它是指用于生产转化的 或转基因的宿主细胞和植物的核酸分子。如在本文中使用的，外源的意 指导入受体细胞中的任意核酸，无论类似的核酸是否已经存在于这种细 胞中。
"基因组"是指生物的染色体DNA 。将基因组定义为二倍体物种的单 套染色体。为了该应用的目的，基因组也包括细胞器基因组。
"单子叶植物，，或"单子叶的"是指具有单个子叶的植物。实例包括谷 物植物例如玉米、稻、小麦、燕麦和大麦。
"核酸"是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
"表型"是指，由于基因型和环境的相互作用引起的生物表现出的性状。
"多腺苷酸化信号"或"polyA信号"是指位于编码区的3'的核酸序列， 其促进腺苷酸核苷酸添加到从编码区转录的mRNA的3'端。
"启动子"或"启动子区"是指通常在编码序列的5'发现的控制编码序 列表达的核酸序列，其通过提供在正确位点开始转录所必需的RNA聚 合酶或其它因子的识别位点，控制信使RNA (mRNA)的生成。
"重组核酸载体"或"载体"是指源自任意来源的能进行基因组整合或 自主复制的任意介质，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体 或线状或环状单链或双链D N A或RN A核香酸区段，其包含在其中已经 以功能上可操作的方式连接一个或多个核酸序列的核酸分子。这样的重 组核酸载体或构建体能以使DNA序列转录成功能mRNA (它随后翻译 成多肽或蛋白)的方式，将5'调节序列或启动子区和选定的基因产物的 DNA序列导入细胞。
"再生"是指从植物细胞生长植物的过程。"再生培养基"是指含有选择剂的需要的植物组织培养基。
"可再生的愈伤组织，，是指这样的愈伤组织，从它可以生成完整的植 物，但是其中再生模式(胚发生或器官发生)尚不确定或与讨论无关。
"选择标记"或"筛选标记"是指这样的核酸序列，它的表达赋予促进 含有所述核酸序列的细胞的鉴别的表型。
"选择，，是指使接种的外植体接触选择培养基，以获得转化的细胞、 组织或纟直物。
"选择培养基"是指含有选择剂的植物组织培养基。
"转录"是指从DNA模板生成RNA拷贝的过程。 "转化"是指将外源核酸序列(载体或构建体)引入细胞或原生质体中
的过程，其中该外源核酸整合入核DNA、质体DNA,或能自主复制。 "转基因的"是指其中已经整合入外源核酸序列的生物。 "可转化的外植体"是指能接受转化的任意植物部分。 本发明提供了 一种系统，其中稳定的转化可以在单个容器中实现。
转化过程从用土壤杆菌接种可转化的外植体开始，并导致产生稳定转化
的具有适合移至土壤中的根的小植抹。
许多容器可以用于该目的。可以使用生物反应器，包括暂时浸没系
统。许多不同的容器已经用于植物液体组织培养，包括，但不限于，各 种大小的Petri板、多孔板、烧瓶、罐、瓶、壶和PlantCons。这些容器 通常配备有提供新鲜培养基和去除废弃(expensed)培养基的装置，例 如入口和出口。可以连接多个容器，以得到高通量系统。
这些容器可以包含一些外植体支持物。所述支持物可以是，但不限 于，滤纸、毡圏、我、玻璃珠、氧化锆/二氧化硅珠、泡沫或固体培养基。 液体培养基通常置于容器中，且然后根据需要更换。该更换可以手工地 或机械地进行。
容器可以同时含有许多外植体，或可以足够小到含有单个外植体。 在多孔板的情况下，使用各自含有一个外植体的小孔阵列来培养大量外 植体。多孔板的优点包括任意污染的外植体的分离。可以手工地或机械 地制备外植体。
本发明的目的是，提供从开始到结束可以容易地自动化的系统；但 是，这些液体培养系统和容器的任一种都可以与本领域技术人员已知的 其它转化、选择和再生步骤组合使用。可以开发高通量转化系统，其中容器可以通过可自由配置的工作台上的自动操纵臂来操纵，其可以包括培养箱和摇床以及标准的实验室器具。配有一个或多个移液端的各种液体处理工具可以用于提供新鲜培养基和去除废弃的培养基。工作台、自动操纵臂和液体处理工具可以由计算机通过软件控制。或者，可以通过连接到培养基贮存容器的一个或多个管，将用于选择和再生转化的细胞的液体培养基提供给容器，并通过连接到废料容器的一个或多个管移出。可以手工地或机械地控制培养基的提供和移出。
为了开始根据本发明的转化过程，首先必须选择要插入植物细胞或组织中的遗传组分。遗传组分可包括使用根据本发明的方法引入植物细
胞或组织中的任意核酸。遗传组分可以包括非植物DNA、植物DNA或合成的DNA。
在优选的实施方案中，将遗传组分整合入DNA组合物，例如包含至少一种或多种下述类型的遗传组分的重组双链质粒或载体分子(a)在植物细胞中发挥功能以造成RNA序列的生成的启动子，(b)造成编码
物细胞中发挥功能以造成多腺苦酸化的核苷酸添加到RNA序列的3'端的3'非翻译DNA序列。
载体可以含有许多遗传组分，以促进植物细胞或组织的转化和调节所需基因的表达。在一个优选实施方案中，使遗传组分定向从而表达mRNA，后者在一个实施方案中可以翻译成蛋白。以双链形式存在的植物结构编码序列(基因、cDNA、合成的DNA或其它DNA)的表达，包含由RNA聚合酶从一条DNA链转录信使RNA (mRNA)和随后在细胞核内加工mRNA初级转录物。该过程包含将多腺苷酸化的核苷酸添加到mRNA的3'端的3'非翻i奪区。
载体通常由许多遗传组分组成，、包^但不限于调控元件:]如启4子、、前导序列、内含子和终止子序列。根据所述元件与它们控制的序列或基因的接近性，调控元件也称作顺式-或反式-调控元件。
DNA向mRNA的转录由通常称作"启动子"的DNA区域调控。启动子区含有给RNA聚合酶发出结合DNA和使用 一条DNA链作为模板开始转录mRNA以产生对应的RNA互补链的信号的碱基序列。在文献中已经描述了许多在植物细胞中有活性的启动子。这样的启
动子包括、但不限于在才艮癌土土泉杆菌(^gro6fl"en'wm ^/me/ac/e"s )的月中瘤诱导质粒上携带的胭脂氨酸合酶(NOS)和章鱼氨酸合酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和3SS启动子和玄参花叶病毒(FMV) 35S启动子、增强的CaMV35S启动子(e35S)、来自核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基(ssRUBISCO, —种非常丰富的植物多肽)的光诱导型启动子。所有这些启动子都已经用于生成各种类型的DNA构建体，它们已经在植物中表达。
还可以构建启动子杂种来增强转录活性(美国专利5,106,739)或组合所需的转录活性、诱导性和组织特异性或发育特异性。在植物中起功能的启动子包括、但不限于所述的诱导型的、病毒的、合成的、组成型的且时间上调节的、空间上调节的和时空上调节的启动子。组织增强的、组织特异性的或发育调节的其它启动子也是本领域已知的，且预见到其可以用于实践本发明。
启动子可以从多种来源例如植物和植物DNA病毒得到，且包括、但不限于，CaMV35S和FMV35S启动子和从植物基因例如ssRUBISCO基因分离的启动子。如下所述，优选地选择的特定启动子应当能造成充分表达，以导致有效量的目标基因产物的生成。
如果需要，可以修饰在本发明的DNA构建体(例如，嵌合的/重组的植物基因)中使用的启动子，以影响它们的控制特征。借助于与操纵基因区的连接、随机的或受控的诱变等，可以衍生出启动子。此外，可以改变启动子，以含有多个"增强子序列"，以辅助提高基因表达。
由本发明的DNA构建体生成的mRNA也可以含有5'非翻译前导序列。该序列可以源自选择用于表达基因的启动子，且可以特异性地修饰，以便增加mRNA的翻译。5'非翻译区也可以从病毒RNA、合适的真核基因或合成的基因序列得到。这样的"增强子"序列可以是增加或改变得到的mRNA的翻译效率所需的。本发明不限于其中非翻译区源自伴随启动子序列的5'非翻译序列的构建体。相反，非翻译前导序列可以源自不相关的启动子或基因(参见，例如美国专利5,362,865)。用于增强表达或影响基因的转录或翻译的其它遗传组分也视作遗传组分。
嵌合构建体的3'非翻译区应当含有转录终止子或具有等价功能的元件，和在植物中起作用的多腺苷酸化信号，以造成多腺苷酸化的核苷酸添加到RNA的3'端。合适的3'区的实例是(1)含有土壤杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因(例如胭脂氨酸合酶(NOS)基因)的多腺苷酸化信号的3'转录的、非翻译区，和(2)植物基因例如大豆贮存蛋白基因和核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶的小亚基(ssRUBISCO)基因。优选的3'区的实例是来自豌豆的ssRUBISCO E9基因的那个(欧洲专利申请0385 962)。
一般地，位于多腺苷酸化位点下游几百石咸基对的DNA序列用于终止转录。这样的DNA序列在本文中称作转录终止区。转录的信使RNA(mRNA)的有效多腺苷酸化需要这些区域，且它们称作3'非翻译区。RNA聚合酶转录编码DNA序列穿过发生多腺苷酸化的位点。
在一个优选实施方案中，载体含有可选择的、可筛选的或可评分的标记基因。这些遗传组分在本文中也称作功能性遗传组分，因为它们生
择设备的DNA在;再生的植物组织中i作用，其生成的化合物会赋予植物组织对否则有毒的化合物的抗性。用作可选择的、可筛选的或可评分的标记的目标基因包括、但不限于GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、花色素苷生物合成有关的基因(Cl,Bperu)、萤光素酶(LUX)、抗生素如卡那霉素(Dekeyser爭乂， 1989)和除草剂如草甘膦(Della-Cioppa爭乂,1987)。其它选择设备也可以应用，包括^旦不限于对膦丝菌素、双丙氨酰膦、麦草畏和阳性选择机理的耐受性，且仍然落入本发明范围内。
本发明可以与含有选择或筛选标记和所述相关调控元件、以及以足以赋予特定性状的方式表达的一种或多种核酸的任意合适的植物转化质粒或载体一起使用。本发明预见到的合适的具有农学重要性的结构基因的实例包括、但不限于昆虫或害虫耐受性、除草剂耐受性的基因，品质改善(例如产量、营养增加、环境或应激耐受性或植物生理学、生长、发育、形态学或植物产物中的任何所需的变化)的基因。
或者，通过编码造成内源基因表达的靶向抑制的非翻译的RNA分子，例如通过反义-或共抑制-介导的机理(参见例如，Bird爭乂， 1991)，DNA编码序列可以影响这些表型。RNA也可以是进4亍工程改造以切割所需内源mRNA产物的催化性RNA分子(例如，核酶)(参见例如，Gibson和Shillitoe, 1997)。更具体地，关于植物细胞中基因表达的反义调节的描述，参见美国专利5,107,065,且关于dsRNA的转录对植物中基因的抑制的描述，参见美国专利6,506,559 、美国专利申请
发明者A·阿库拉, B·劳, D·D·宋斯塔德, D·R·邓肯, J·B·威尔克斯, J·R·劳特, M·T·曼, W·L·彼得森, W·张 申请人:孟山都技术有限公司