专利名称：：删除转基因植物中抗生素标记基因的系统及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及删除转基因植物中抗生素标记基因的系统及其应用。
背景技术：
：自转基因技术诞生以来，转基因产品中人们最担心的是安全性问题，转基因产品中带有的一些选择标记基因可能会对人类健康、自然界的物种和环境存在潜在的风险。因此，转基因植物的安全性问题日益受到重视，并已成为影响转基因植物产业健康发展的主要瓶颈(参考文献:HarePD,ChuaNH.Excisionofselectablemarkergenesfromtransgenicplants.NatureBiotechnology,2002,20:575_580·)。胃胃中;g中素抗性基因问题。转基因食品中的抗生素抗性基因可能会通过转染肠道细菌，而使人类对这些抗生素产生抗性，也就是耐药性。联合国粮农组织和世界卫生组织在2003年联合颁布的转基因植物食品风险评估准则明确指出“对在临床上应用的抗生素具有抗性的耐抗生素基因不应在食品中出现”。卡那霉素抗性基因对卡那霉素具有抗性，被世界卫生组织列为第二级别，为重要类抗生素，意味着该抗生素抗性基因不应在食品中出现。因此抗生素抗性基因的删除具有重要意义。Cre/loxP重组系统由于特异、高效、作用专一性强，因而不影响基因的正常表达与调控，在转基因研究中得到了广泛的应用(参考文献BallesterA，CerveraM，PenaL.Efficientproductionoftransgeniccitrusplantsusingisopentenyltransferasepositiveselectionandremovalofthemarkergenebysite-specificrecombination.PlantCellReports,2006,26:39-45.禾口CaoMX，HuangJQ,YaoQH,LiuSJ,WangCL,WeiZM.Site-specificDNAexcisionintransgenicricewithacell-permeableCrerecombinase.MolecularBiotechnology,2006,32:55-63.禾口ChakrabortiD,SarkarA,MondalHA,SchuermannD,HohnB,SarmahBK,DasS(2008)Cre/loxsystemtodevelopselectablemarkerfreetransgenictobaccoplantsconferringresistanceagainstsapsuckinghomopteraninsect.PlantCellRep27:1623-1633.禾口CuellarW,GaudinA,SolorzanoD,CasasA,NopoL,ChudalayandiP,MedranoG,KreuzeJ,GhislainM.Self-excisionoftheantibioticresistancegenenptllusingaheatinducibleCre-IoxPsystemfromtransgenicpotato.PlantMolecularBiology，2006，62:71-82.)。Cre(causesrecombination)重组酶是由来源于Pl噬菌体的ere基因所编码的一类酶，属于Int家族，识别特异靶位点(IoxP位点)并催化在该位点断裂和重组(参考文献Stembergn,SauerB,HoessR,etal.BacteriophagePIcregeneanditsregulatoryregionevidenceformultiplepromotersandforregulationbyDNAmethylation[J].JournalofMolecularBiology,1986,187197-121.)。IoxP位点是一段长度为34bp的DNA序列，是Cre重组酶的特异性识别位点，具有典型的回文结构，由两个13bp的反向重复序列和中间8bp的不对称间隔区组成，8bp的间隔区负责位点的定向(参考文献RonaldHH，MarciaΖ,NatS.Plsite2specificrecombinationnucleotidesequenceofrecombiningsites[J].ProcNatlAcadSci,USA,1982，79:3398-3402.)。当同一条DNA分子上有2个同向的IoxP位点时，Cre重组酶催化两个IoxP位点间基因的剔除，只留下1个IoxP位点，重组发生在8bp的分隔区内(参考文献:HoessRH,AbremskiK.InteractionofthebacteriophagePlrecombinaseCrewiththerecombiningsiteIoxP.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1984,81:1(^6-1029.)。Cre重组酶介导的DNA重组不受切除片段长度和位置的限制，只要靶基因被2个识别位点标记就可以准确地进行DNA重组。
发明内容本发明的目的是提供删除转基因植物中抗生素标记基因的系统及其应用。本发明所提供的删除转基因植物中抗生素标记基因的系统，由用于插入外源目的DNA表达盒的含有抗生素标记基因的植物表达载体和用于删除所述抗生素标记基因的含Cre酶基因的植物表达载体组成。所述的含有抗生素标记基因的植物表达载体为环状载体，含有两个同向IoxP位点，抗生素标记基因的表达盒，可视化标记基因的表达盒，筛选转基因植物所需标记基因的表达盒，及插入外源目的DNA的多克隆位点；所述两个同向的IoxP位点将所述含有抗生素标记基因的植物表达载体划分为两段，其中一段含有编码所述抗生素标记基因及所述可视化标记基因的表达盒，另一段含有所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒，和所述插入外源目的DNA的多克隆位点。所述的含Cre酶基因的植物表达载体为环状载体，该环状载体含有两个同向的IoxP位点，可控启动子，被所述可控启动子启动的Cre酶基因，抗生素标记基因的表达盒，可视化标记基因的表达盒，和筛选转基因植物所需标记基因的表达盒；所述两个同向的IoxP位点将所述含Cre酶基因的植物表达载体划分为两段，其中一段含有编码所述抗生素的基因，可控启动子及被所述可控启动子启动的Cre酶基因，另一段含有所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒，以及所述可视化标记基因的表达盒。所述表达盒均指含有目的基因及表达该目的基因所需元件的DNA分子。所述抗生素标记基因的表达盒是一个含有抗生素标记基因及该抗生素标记基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、SD序列、由所述启动子启动转录的所述抗生素标记基因的编码序列和终止子(转录终止序列)。在本发明的实施例中，所述抗生素基因表达盒具体为卡那霉素(Kan)基因表达盒；所述Kan基因表达盒是一个含有Kan基因及Kan基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段含有启动Kan基因的原核启动子(序列7的第沈30位到第M92位)、SD序列、被该启动子启动的Kan基因和终止子(转录终止序列)。所述可视化标记基因的表达盒是一个含有可视化标记基因及可视化标记基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、由所述启动子启动转录的所述可视化标记基因的编码序列以及终止子(转录终止序列)。在本发明的实施例中，所述可视化标记基因表达盒具体由花青素基因合成途径中的转录因子bi基因表达盒和花青素基因合成途径中cl基因表达盒组成。其中，bi基因的表达盒是一个含有bi基因及bi基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、被该启动子启动的bi基因和nos终止子(转录终止序列)；cl基因的表达盒是一个含有cl基因及cl基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、被该启动子启动的cl基因和nos终止子(转录终止序列)。其表达产物花青素可作为植物转基因成功与否及鉴定转基因植物是否成功删除抗生素标记基因的可视化标记。cl基因的表达盒和bi基因表达盒的启动子均可为任何可以启动基因在植物中转录的启动子，如常用的3启动子。所述bi基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述Cl基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述bi基因的编码序列如序列表中序列10的第3137位到第4796位所示；所述cl基因的编码序列如序列表中序列10的第1013位到第1834位所示。所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒是一个含有筛选转基因植物所需标记基因及其表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、由所述启动子启动转录的所述筛选转基因植物所需的标记基因的编码序列以及终止子(转录终止序列)。在本发明的实施例中，所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒具体为EPSP基因表达盒；所述EPSP基因表达盒是一个含有EPSP基因及EPSP基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、由该启动子启动转录的所述EPSP基因的编码序列以及终止子(转录终止序列)；所述EPSP基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述EPSP基因的编码序列如序列表中序列8的第10位到第2549位所示。所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒中的启动子可为任何可以启动基因在植物中转录的启动子，如常用的3启动子。在本发明的实施例中，所述插入外源目的DNA的多克隆位点从上游到下游具体依次为KpnI，HindIII，EcoRI，SmaI,XbaI,NotI。所述的可控启动子具体为水稻热激蛋白hsp70基因启动子hsp70；所述的水稻热激蛋白hsp70基因启动子hsp70的核苷酸序列如序列表中序列9的第1位到第687位所示。所述的Cre酶基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述的Cre酶基因的编码序列如序列表中序列9的第694位到第17位所示。所述的含有抗生素标记基因的植物表达载体和所述的含Cre酶基因的植物表达载体分别单独包装。所述的含有抗生素标记基因的植物表达载体为pBAC9008，pBAC9008按照如下方法构建1)在PGreen载体的第1648位和第沈35位处分别插入如序列表中序列5所示的IoxP位点得到重组载体pBAC814，pBAC814中的两个IoxP位点方向相同；2)在pBAC814的多克隆位点前的NdeI酶切位点处插入所述EPSP基因的表达盒得到重组载体PBAC823；3)将上述PBAC823载体的用DraIII酶切，加入Agel/PacIlinker，之后将所述花青素合成途径中转录因子bi基因和转录因子cl基因的表达框插入AgeI和I^cI位点之间，得到的载体命名为pBAC9008。所述pGreen载体的序列如序列表中序列7所示；所述EPSP基因的表达盒的序列如序列表中序列8所示，其中第1位到第434位为所述35S启动子的核苷酸序列，第461位到第994位为所述玉米Adhl基因的Intronl的核苷酸序列，第10位到第2549位为所述EPSP基因的编码序列；所述Agel/PacIlinker的核苷酸序列如序列表中序列6所示。所述的含Cre酶基因的植物表达载体为pBAC9009，pBAC9009按照如下方法构建a)构建被所述热激活蛋白基因启动子启动的所述Cre酶基因的表达盒，将该表达盒插入所述PBAC823载体的DraIII酶切位点处，得到重组载体pBAC830；b)将所述花青素基因合成途径中的转录因子bi基因和转录因子cl基因的表达盒插入pBAC830载体的EcoRI酶切位点，得到PBAC9009载体。被所述热激活蛋白基因启动子启动的所述Cre酶基因的表达盒的核苷酸序列如序列表中序列9所示，其中，第1位到第687位为所述hsp70启动子的核苷酸序列，第694位到第1725位为所述Cre酶基因的编码序列；所述花青素基因合成途径中的转录因子bi基因的表达盒和所述花青素基因合成途径中转录因子cl基因的表达盒的序列如序列表中序列10所示，其中，第1位到第2112位为所述cl表达框的基因序列，第2125位到第5074位为所述bi表达框的序列，第1013位到第1834位为cl基因的编码序列，第3137位到第4796位为bi的编码序列。所述删除转基因植物中抗生素标记基因的系统在删除转基因植物抗生素基因中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供利用上述删除转基因植物中抗生素标记基因的系统培育转基因植物的方法。该方法包括如下步骤a、将目的基因插入所述含有抗生素标记基因的植物表达载体中的所述多克隆位点，得到重组目的基因表达载体。b、用所述重组目的基因表达载体和含Cre酶基因的植物表达载体分别通过DNA直接转移法转入植物细胞，获得所述重组目的基因表达载体的转基因植株和所述含Cre酶基因的植物表达载体的转基因植株。所述重组目的基因表达载体的转基因植株中，所述目的基因、所述筛选转基因植物所需标记基因和所述可视化标记基因这三个基因均表达，将所述三个基因记作含有目的基因的三基因；所述含Cre酶基因的植物表达载体的转基因植株中，所述Cre酶基因、所述筛选转基因植物所需标记基因和所述可视化标记基因这三个基因均表达，将所述三个基因记作含Cre酶基因的三基因。C、从所述重组目的基因表达载体的转基因植株自交后代中选择所述含有目的基因的三基因均稳定表达和纯合的植株作为父本，从所述含Cre酶基因的植物表达载体的转基因植株自交后代中选择所述含Cre酶基因的三基因均稳定表达和纯合的植株作为母本，将所述母本和所述父本进行杂交，对得到的杂交种子进行处理，使所述可控启动子被激活，再将该种子进行种植，得到的不含所述可视化标记基因表达产物的植株即为抗生素标记基因被删除的转基因植株。所述DNA的直接转移法包括电击法(电穿孔法)、基因枪法(微弹轰击法)、激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法、多聚物介导法，花粉管通导法等。在本发明的实施例中采用的具体方法为基因枪法。在本发明的实施例中，所述转基因植物具体可为单子叶植物，如玉米；所述对得到的杂交种子进行处理使所述可控启动子被激活的方法具体为40°C热诱导处理。本发明通过Cre-IoxP系统构建了抗生素标记基因的删除系统。含有IoxP位点的表达目的基因的转基因植株通过与表达Cre酶基因的转基因植株杂交，就可以从转基因植株的后代中删除抗生素标记基因，为食品安全提供保证，在转基因研究中具有重要的意义。另外，本发明的发明人在删除系统中又同时引进了可视化标记基因花青素合成途径的两个7转录因子，使得本发明仅仅从玉米种皮的颜色上就可以判断出转基因的效果与删除效果，因此该删除体系在转基因研究领域是一个突破，大大节省了分子检测的成本，对于后续的育种也有着重要的意义。图1为pBAC823质粒图谱。图2为pBAC9008质粒图谱。图3为pBAC830质粒图谱。图4为pBAC9009质粒图谱。图5为转基因玉米植株的分化及田间移栽。A诱导愈伤组织；B转化再生植株；C田间移栽；D转化植株结实种子。图6为pBAC9008转基因植株的PCR检测。1:2Kplusmarker；2阴性对照(水)；3非转基因植株；5质粒pBAC9008；618转化植株。图7为pBAC9009转基因植株的PCR检测。1:2Kplusmarker；217转化植株；18阴性对照(水)；19非转基因植株；20质粒pBAC9009。图8为转基因玉米中Kan基因删除示意图。其中，A代表转目的基因玉米(父本)；B代表转重组酶基因玉米(母本)；C代表转目的基因玉米(删除抗生素基因)；D代表转重组酶基因玉米；E和F均代表转目的基因玉米/转重组酶基因玉米的杂合体。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。玉米优良自交系501(杨东歌，杨凤萍，陈绪清，张立全，张晓东.外源脱水应答转录因子CBF4基因转化玉米的获得.作物学报，2009，35(10):1759-1763)T4DNA连接酶、Taq酶、卡纳霉素、IPTG、X-gal等试剂均购自大连宝生物工程有限公司；DNA回收试剂盒购自天根生化科技公司；限制性内切酶购自！Iomega、NewEnglandBiolabs；普通生化试剂购自Sigma公司、Promega公司或国产。基因枪型号PDS_1000/He(BioRad)。基础载体pGreen，购自英国JohnInnesCentre[联系人MarkSmedley，JohnInnesCentre,NorwichResearchPark,Colney,Norwich,NR47UH,UK.e-mail:mark.smedleyibbsrc.ac.uk,Fax(+44)1603450045]。下面结合具体实施例，详细阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1、含有抗生素标记基因的植物表达载体的构建一、pGreen载体的改造根据pGreen中Kan基因的两侧序列分别合成扩增IoxP位点的正向、反向共四条引物(见表1)，其中两个正向引物PF1648(序列如序列表中序列11所示)和ΡΜ635(序列如序列表中序列12所示)的前4个核苷酸残基均为IoxP序列的8bp间隔区的后4位，第5-17位核苷酸残基均为IoxP序列的13bp的反向重复序列；两个反向引物PR1648(序列如序列表中序列13所示)和(序列如序列表中序列14所示)的前4个核苷酸残基均为IoxP序列的8bp间隔区的前4位，第5-17位核苷酸残基均为IoxP序列的13bp的反向重复序列。利用两次PCR的方法，将IoxP位点加入pGreen中Kan基因表达框的两侧。具体操作方法如下所述首先以pGreen基础框架载体为模板，利用PF1648/冊1648引物对进行PCR扩增，产物自连，转化E.coliJM110。通过序列测定确定IoxP位点是否正确插入PGreen载体中。将鉴定正确的载体命名为pGreen-loxp(在pGreen的1648位点处插入如序列表中序列5所示的IoxP位点得到的重组载体)，以pGreen-loxp载体为模板，以PM635/PR2635引物对进行第二次PCR，步骤同上。测序正确的载体命名为pBAC814(在pGreen-loxp中对应pGreen的沈35位点处插入如序列表中序列5所示的IoxP位点得到的重组载体，PBAC814中的两个IoxP位点方向相同)。在pBAC814多克隆位点前的NdeI酶切位点处插入CaMV35S启动子和玉米Adhl基因的Intronl驱动的EPSP基因(EPSP基因表达盒)，所述EPSP基因作为筛选转基因植物的选择标记基因。经测序鉴定正确的载体命名为pBAC823(pBAC823的质粒图谱如图1所示)。pBAC823中CaMV35S启动子和玉米Adhl基因的htronl驱动的EPSP基因(EPSP基因表达盒)的序列如序列表中序列8所示，其中第1位到第434位为所述35S启动子的核苷酸序列，第461位到第994位为所述玉米Adhl基因的htronl的核苷酸序列，第10位到第2549位为所述EPSP基因的编码序列表1扩增IoxP位点的四条引物序列权利要求1.删除转基因植物中抗生素标记基因的系统，由用于插入外源目的DNA的含有抗生素标记基因的植物表达载体和用于删除所述抗生素标记基因的含Cre酶基因的植物表达载体组成；所述的含有抗生素标记基因的植物表达载体为环状载体，含有两个同向IoxP位点，抗生素标记基因的表达盒，可视化标记基因的表达盒，筛选转基因植物所需标记基因的表达盒，插入外源目的DNA的多克隆位点；所述两个同向的IoxP位点将所述含有抗生素标记基因的植物表达载体划分为两段，其中一段含有编码所述抗生素标记基因及所述可视化标记基因的表达盒，另一段含有所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒，和所述插入外源目的DNA的多克隆位点；所述的含Cre酶基因的植物表达载体为环状载体，该环状载体含有两个同向的IoxP位点，可控启动子，被所述可控启动子启动的Cre酶基因，抗生素标记基因的表达盒，可视化标记基因的表达盒，和筛选转基因植物所需标记基因的表达盒；所述两个同向的IoxP位点将所述含Cre酶基因的植物表达载体划分为两段，其中一段含有编码所述抗生素标记基因，可控启动子及被所述可控启动子启动的Cre酶基因，另一段含有所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒和所述可视化标记基因的表达盒；所述表达盒均指含有目的基因及该目的基因表达所需元件的DNA分子。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于所述可视化标记基因由花青素基因合成途径中的转录因子bi基因和花青素基因合成途径中转录因子cl基因组成；所述可视化标记基因的表达盒为由所述转录因子bi基因的表达盒和所述转录因子cl基因的表达盒组成；所述bi基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述cl基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于所述bi基因的编码序列如序列表中序列10的第3137位到第4796位所示；所述cl基因的编码序列如序列表中序列10的第1013位到第1834位所示。4.根据权利要求1-3中任一所述的系统，其特征在于所述的可控启动子为热激活蛋白基因启动子；所述的Cre酶基因编码的蛋白质的序列如序列表中序列9所示。5.根据权利要求1-4中任一所述的系统，其特征在于所述的热激活蛋白基因启动子的核苷酸序列如序列表中序列9的第1位到第687位所示；所述的Cre酶基因的编码序列如序列表中序列9的第694位到第1725位所示。6.根据权利要求1-5中任一所述的系统，其特征在于所述的含有抗生素标记基因的植物表达载体和所述的含Cre酶基因的植物表达载体分别单独包装。7.根据权利要求1-6中任一所述的系统，其特征在于所述的含有抗生素标记基因的植物表达载体为pBAC9008，pBAC9008按照如下方法构建1)在如序列表中序列7所示的PGreen载体的第1649位和第沈35位分别插入如序列表中序列5所示的IoxP位点得到重组载体pBAC814，pBAC814中的两个IoxP位点方向相同；2)在pBAC814的NdeI酶切位点处插入如序列表中序列8所示的EPSP基因表达盒得到重组载体pBAC823；3)将上述pBAC823载体的用DraIII酶切，加入如序列表中序列6所示的Agel/PacIlinker，之后将如序列表中序列10所示的所述花青素合成途径中转录因子cl基因和转录因子bi基因的表达盒插入AgeI和I^cI位点之间，得到的载体命名为PBAC9008；所述的含Cre酶基因的植物表达载体为pBAC9009，pBAC9009按照如下方法构建a)构建被所述热激活蛋白基因启动子启动的如序列表中序列9所示的所述Cre酶基因的表达盒，将该表达盒插入所述PBAC823载体的DraIII酶切位点处，得到重组载体pBAC830；b)将如序列表中序列10所示的所述花青素基因合成途径中的转录因子bi基因和转录因子cl基因的表达盒插入PBAC830载体的EcoRI酶切位点，得到pBAC9009载体。8.权利要求1-6中任一所述的删除转基因植物中抗生素标记基因系统在删除转基因植物抗生素标记基因中的应用。9.利用权利要求1-6中任一所述系统培育转基因植物的方法，包括如下步骤a、将目的基因插入所述含有抗生素标记基因的植物表达载体中的所述多克隆位点，得到重组目的基因表达载体；b、用所述重组目的基因表达载体和含Cre酶基因的植物表达载体分别通过DNA的直接转移法转入植物细胞，获得所述重组目的基因表达载体的转基因植株和所述含Cre酶基因的植物表达载体的转基因植株；所述重组目的基因表达载体的转基因植株中，所述目的基因、所述筛选转基因植物所需标记基因和所述可视化标记基因这三个基因均表达，所述三个基因记作含有目的基因的三基因；所述含Cre酶基因的植物表达载体的转基因植株中，所述Cre酶基因、所述筛选转基因植物所需标记基因和所述可视化标记基因这三个基因均表达，所述三个基因记作含Cre酶基因的三基因；C、从所述重组目的基因表达载体的转基因植株自交后代中选择所述含有目的基因的三基因均稳定表达和纯合的植株作为父本，从所述含Cre酶基因的植物表达载体的转基因植株自交后代中选择所述含Cre酶基因的三基因均稳定表达和纯合的植株作为母本，将所述母本和所述父本进行杂交，对得到的杂交种子进行处理使所述可控启动子被激活，再将该种子进行种植，得到表达所述目的基因并且不含所述可视化标记基因表达产物的植株即为抗生素标记基因被删除的转基因植株。10.根据权利要求9所述方法，其特征在于所述植物为单子叶植物，如玉米；所述对得到的杂交种子进行处理使所述可控启动子被激活的方法为40°C热诱导处理。全文摘要本发明公开了删除转基因植物中抗生素标记基因的系统及其应用。本发明所提供的删除系统由分别含有抗生素标记基因和含Cre酶基因的两个植物表达载体各自单独包装组成。所述含有抗生素标记基因的植物表达载体含有两个同向的loxP位点，且两loxP位点之间含有抗生素标记基因及可视化标记基因表达盒。将所述两载体的转基因植株后代杂交，便可从杂交后代中删除抗生素标记基因，这为食品安全提供了保证，在转基因研究中具有重要的意义。另外，可视化标记基因使得仅仅从转基因植株及种皮果皮的颜色上就可以判断出转基因的效果与删除效果，因此该删除体系在转基因研究领域是一个突破，大大节省了分子检测的成本，对于后续的育种也有着重要的意义。文档编号C12N15/82GK102337292SQ20111029558公开日2012年2月1日申请日期2011年9月27日优先权日2011年9月27日发明者张晓东,张立全,李向龙,杨凤萍,薛静,陈绪清申请人:北京市农林科学院