专利名称：一种通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法、重组质粒和永久转基因的生殖细胞的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法、重组质粒和永久转基因的生殖细胞。
背景技术：
转基因大动物应用前景广阔，可直接服务于农业、动物育种、和生物医药_生产人类医疗性蛋白，人员源化器官等。所以，近年来已经有多种转基因技术问世，例如，传统上主要用于小鼠转基因的原核注射技术，后来出现过的通过核移植转基因，通过理化方法转基因电穿孔转基因，脂质体转基因，利用转染率高的病毒性载体转基因。最近出现了利用 zinc-finger endonucleases 禾口 transposons 转基因。转基因技术有些在体外条件下对细胞或胚胎转基因效率较高，但是这些转基因技术在活体转基因时，或者是产生转基因后代时，由于体内环境难以随转基因的需要而转变，其效率就大大降低。例如通过核移植转基因的总体效率还不到1%，难以推广应用。而且这些技术用于大动物时操作复杂难度增加，花费较高，效率更低。在大动物上过低的转基因效率严重阻碍了转基因技术在这些动物上的应用。因此，要在生产中应用，要实现生产价值，就要实现大动物转基因，就需要建立新的转基因技术，以便较快地改进遗传性能，提高奶、肉、毛产量的质量 (品质)，提高抗病力，制作动物模型。
发明内容
为了解决上面提到的现有技术所存在的问题，本发明的一个目的是公开了一种通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法。本发明的第二个目的在于公开了通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法所采用的重组质粒。本发明的第三个目的在于公开了通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法获得的永久转基因的生殖细胞。本发明的技术方案如下一种通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法，其中，所述方法包括以下步骤 以超声波影像引导，用B型超声波抬头找到睾丸网，顺长轴方向进针，缓慢将外源包装质粒注入曲细精管和睾丸其他部位，得到动物永久转基因生殖细胞。上述技术方案中所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法，其中，在所述得到动物永久转基因生殖细胞之前还包括下述步骤(1)、扩增目的基因片段；(2)、将扩增的目的基因片段与Lenti-GFP-T2A载体连接，获得重组质粒；(3)、将步骤(2)的重组质粒在293T细胞中进行高效包装，使滴度达到108或转染效率达90%以上，获得外源包装质粒。
上述技术方案中所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法，其中，步骤(1)中所述的目的基因片段为OlGF-I片段；所述步骤(2)中扩增的目的基因片段与 Lenti-GFP-T2A载体连接是在 Oigf-I 片段 4· 5μ L、Lenti-GFP-T2A载体0. 5μ L和 solution I 5 μ L，共10 μ L的连接体系中，将上述溶液混勻，离心后，于14 16°C连接过夜，得到重组质粒 Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。上述技术方案中所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法中所采用的重组质粒，其中，所述重组质粒是通过将目的基因片段与Lenti-GFP-T2A载体连接后获得。上述技术方案中所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法中所采用的重组质粒，其中，所述重组质粒是通过将目的基因片段oIGF-1与Lenti-GFP-T2A载体连接后获得重组质粒Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。一种永久转基因的生殖细胞，其中，所述永久转基因的生殖细胞是通过上述技术方案中所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法中任一方法制得的。本发明具有以下有益效果1、本发明所采用将外源包装质粒注射入曲细精管和睾丸其他部位的方法具有超高转基因效率，整体转基因效率可达90%以上；2、精原干细胞可以自我复制，保存自己；同时可以分化成更高级的生殖细胞，向精子方向发展。从精原干细胞到精子形成的过程是一个很高效的生理机制，称为精子发生。在大动物大约需要45天。可以看出，一旦精原干细胞整合到外源基因，所转基因就会随之复制而复制，并随生殖细胞分化而保留，最后到达精子，源源不断。采用本发明所述的方法，由于将目的基因与载体重组后注射入曲细精管和睾丸其它部位，因此能够持续产生转基因精子；而且转基因精子应用方便；3、与通过普通细胞或胚胎生产转基因动物的一次性方法相比，由于本发明所述的方法是将外源基因整合到精原干细胞中，精原干细胞最终分化为精子，可以形成稳定的永久性的转基因。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。实施例1 目的基因oIGF-1的克隆一、RNA 的提取1、取组织(IOg左右)，立刻浸入ImL Trizol0样品体积一般不超过Trizol体积的10%。用组织勻浆器使组织勻浆化。2、加入0. 2ml氯仿，用手剧烈振荡15 30s混均，室温静置5 lOmin。3U2000rp/min离心15min，样品会分三层下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相中，把水相(不要吸取中间层的任何物质)移到一新的1.5mL微量印管中；4、加入等体积的异丙醇，室温静置lOmin。5、12，000rp/min离心lOmin，弃上清，加入Iml 75%乙醇振荡混均。6、12，000rp/min离心5min，小心弃去上清，室温或真空干燥5 lOmin，以便彻底去除残余的乙醇；最后用50 μ L无RNA酶去离子水洗提，10，000rp/min离心lmin。印管中的液体即为所要的总RNA。直接RT-PCR或放于-80°C冰箱备用。
二、RT-PCR 以提取的RNA为模板，按一步法RT-PCR试剂盒说明书扩增目的基因。RT-PCR反应体系在DEPC浸泡过的无菌0. 2mL EP管中依次加入5Xone step PCR Buffer5μ LMgC12(25mM)10 μ LdNTP Mixture5 μ LRNase Inhibitor1 μ LAMV Reverse Transcriptase 1 μ LAMV optimized1 μ LRNA 模板2 μ LFP2 μ LRP2 μ L用RNA free ddH20 补充至总体积为 50 μ L。RT-PCR 反应条件50°C 40min ；94°C 3min ；94°C 50s，54°C 30s, 72°C lmin，扩增 36 个循环后，最后 72°C再延伸 lOmin。三、切胶回收经过1.0 %的琼脂糖凝胶电泳后，用紫外灯观察电泳条带与目的片段 oIGF-1 (GenBank M30653)大小基本一致，切胶回收电泳条带。按照上海生工生物工程有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，具体操作步骤如下1、在紫外灯下切下含有目的条带的琼脂糖凝胶块，大约100 150mg，使用长波长的紫外光，尽量缩短照射时间，减少诱导突变；2、加入凝胶熔化剂300 μ L，于50 60°C水浴5 lOmin，每2min混均一次，直至
凝胶完全融化；3、将融化的凝胶移至GenClean Column中，3，000rp/min室温离心300s ；4、取出GenClean Column，弃去废液，将GenClean Column管重新放回收集管中，加 Λ 500 μ L 洗脱液，8，000rpm/min,室温离心 30s ；5、重复上述步骤一次；6、弃去废液，10，OOOrp/min，室温离心2min，彻底去除洗脱液；7、将GenClean Column管放回干净的1. 5mL离心管中，于GenCleanColumn中央加入30 50 μ L Elution Buffer，37°C条件下放置2min (增加DNA的洗脱效率)。8、10000rp/min，室温离心lmin，离心管中的液体即为目的基因。试验例2 重组质粒Lenti-GFP-T2A-oIGF_l的制备把以上切胶回收的目的片段oIGF-l(羊IGF-1)与Lenti-GFP-T2A载体连接，连接方法按照本领域通用的方法在下列反应体系内进行，连接反应体系目的片段(oIGF-1)4. 5 μ LLenti-GFP-T2A 载体0. 5 μ Lsolution I5 μ L
共10 μ L体系，将上述溶液混勻，离心后，于14 16°C连接过夜，获得重组质粒 Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。试验例3 重组质粒的高效包装高效包装是转基因成功的前提。步骤如下1、取 IOul 重组 DNA (0. 5ug/ul)，与 490ulddH20，50ul 包装 mix 禾口 500ul 转染试剂混合均勻。根据DNA浓度调节ddH20量。2、室温#置5分钟。3、将达到 75%丰度的 293T 细胞换上 IOml 含 Tetracycline-free FBS 的 DMEM 培养液。4、一滴一滴地将2中的转染混合物均勻加入3中。5、轻轻swirl培养皿。6、静置培养 48_60hr。7、收集上清液。8、500gxl0min离心，收取上清液。9、4C 20，000区离心4111·。10、弃上清。11、用 IOOul 0. 1% BSA-PBS 溶解沉淀。12、1 10作梯度稀释，共8管13U0ul/well(24well-plate)转染50%丰度3T3细胞，4-5天后观察转染效率。试验例4 永久转基因的生殖细胞的获得使用时，将PBS加入使高效包装的重组质粒恢复原体积，视体积大小，将10 15ml (加0. 0lug/ml辅佐试剂)分别注入曲细精管和睾丸其它部位，操作方法是以超声波影像引导，用B型超声波探头找到睾丸网(retetestis)，顺长轴方向进针，缓慢注入曲细精管和睾丸其它部位。如此内外注射以利包装颗粒接触雄性生殖干细胞，即精原干细胞。该技术可使生殖细胞永久转基因，所转基因可遗传给下一代，总体转基因效率高达90%以上， 下游操作简便，可以推广使用。转基因检测通过分子生物学技术和生物学效应检测，例如RT-PCR，real-time PCR, Southern blot, Western blot 等等。试验例5 转基因检测-DNA的提取1、用移液器取0. 6ml血液放入一个新的1. 5ml离心管中，再加入等体积PBS缓冲液，充分混合均勻，12000r/min离心15分钟，弃去上清液。2、重复步骤(1)至上清液澄清透明。3、再加入0. 6ml的DNA抽提缓冲液在离心管中，用移液枪枪头反复吹打混勻，但是
应避免白细胞粘附于离心管壁上。4、加入蛋白酶K至终浓度于120mg/ml，用枪头反复吹打混勻，封口膜将离心管封口，放入水浴锅内55 °C消化过夜。5、将装有DNA溶液的离心管取出放于室温内使管内的溶液冷却到室温，再加入等体积的Tris饱和酚，缓慢的转动离心管10分钟(避免剧烈振动使DNA序列断裂)，使其充分混勻，再放入离心机内12000r/min离心20分钟，将其上清液转至一新的离心管内。
6、在取出的上清液中再加入等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇(25 24 1) 混合液，缓慢的转动离心管20分钟(避免剧烈振动使DNA序列断裂)，再在离心机内 12000r/min离心10分钟，将其上清液转至一新的离心管内。7、在取出的上清液中再加入等体积酚氯仿(24 1)，缓慢的转动离心管10分钟 (避免剧烈振动使DNA序列断裂)，再放入离心机内12000r/min离心10分钟，将其上清液
转至一新的离心管内。8、在取出的上清液中再加入等体积氯仿，缓慢的转动离心管10分钟(避免剧烈振动使DNA序列断裂)，再放入离心机内12000r/min离心10分钟，将其上清液转至一新的离心管内。9、在取出的上清液中再加入加0. 1倍体积的NaAc缓冲液和2倍体积的无水冰乙醇用于沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色DNA絮状沉淀。10、将絮状DNA用枪头挑出放到另一新的1.5ml离心管中，然后加-20°C预冷的 70%乙醇洗两次，12000r/min离心10分钟，打开离心管放置于室温条件下以便去除残留的乙醇，将DNA放置通风处干燥，最后加入适量TE溶解，4°C保存。实施例6 转基因检泖丨_目的基因的扩增一、DNA的扩增以提取的DNA为模板，试剂盒说明书扩增目的基因。PCR反应体系在灭菌处理过的EP管中依次加入10XPCR buffer5μ LdNTP Mixture1 μ LMgC12(25mM)3μ L质粒模板2 μ LFP1 μ LRP1 μ LTaqDNA 聚合酶0· 5 μ L加灭菌去离子水补充至总体积50 μ L。反应条件如下95°C 4min -MV 35s，56°C 50s, 72°C Imin循环35次；72°C再延伸lOmin。反应结束后产物经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
权利要求
1.一种通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤以超声波影像引导，用B型超声波抬头找到睾丸网，顺长轴方向进针，缓慢将外源包装质粒注入曲细精管和睾丸其他部位，得到动物永久转基因生殖细胞。
2.根据权利要求1所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法，其特征在于， 在所述得到动物永久转基因生殖细胞之前还包括下述步骤(1)、扩增目的基因片段；(2)、将扩增的目的基因片段与Lenti-GFP-T2A载体连接，获得重组质粒；(3)、将步骤(2)的重组质粒在293T细胞中进行高效包装，使滴度达到108或转染效率达90%以上，获得外源包装质粒。
3.根据权利要求2所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法，其特征在于， 步骤⑴中所述的目的基因片段为oIGF-1片段；所述步骤⑵中扩增的目的基因片段与 Lenti-GFP-T2A载体连接是在 Oigf-I 片段 4· 5μ L、Lenti-GFP-T2A载体 0. 5μ L和 solution I 5 μ L，共10 μ L的连接体系中，将上述溶液混勻，离心后，于14 16°C连接过夜，得到重组质粒 Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。
4.根据权利要求2所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法中所采用的重组质粒，其特征在于所述重组质粒是通过将目的基因片段与Lenti-GFP-T2A载体连接后获得。
5.根据权利要求4所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法中所采用的重组质粒，其特征在于所述重组质粒是通过将目的基因片段oIGF-1与Lenti-GFP-T2A载体连接后获得重组质粒Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。
6.一种永久转基因的生殖细胞，其特征在于所述永久转基因的生殖细胞是通过权利要求1 3中任一权利要求所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法制得的。
全文摘要
本发明一种通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法、重组质粒和永久转基因的生殖细胞，属于基因工程技术领域。本发明所述的通过精原干细胞获得动物永久转基因的方法包括下述步骤(1)扩增目的基因片段；(2)将扩增的目的基因片段与Lenti-GFP-T2A载体连接，获得重组质粒；(3)将步骤(2)的重组质粒在293T细胞中进行高效包装；(4)将步骤(3)的外源包装质粒分别注入曲细精管和睾丸其它部位，获得永久转基因的生殖细胞。本发明具有超高转基因效率，整体转基因效率可达90％以上；能够持续产生转基因精子；而且转基因精子应用方便；可以形成稳定的永久性的转基因的优点。
文档编号C12N15/63GK102212526SQ20111008291
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者曹文广 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所