专利名称：一种用于蛋白酶k常温保存的缓冲液及其应用的制作方法
—种用于蛋白酶K常温保存的缓冲液及其应用技术领域
本发明属于分子生物学及生物工程技术领域，涉及基因工程操作中的一种工具酶的活性维持和保存的缓冲液及其应用。具体地，本发明涉及一种可以用于蛋白酶K溶液常温长期保存而不失去活性的缓冲液及其应用。
背景技术：
蛋白酶，又称蛋白水解酶，是一类催化蛋白质中肽键水解的酶，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。蛋白酶的种类很多，按照其水解多肽的方式，可以分为内肽酶和外肽酶两类，前者将蛋白质分子从内部切断，后者则从蛋白质分子的游离氨基端或羧基端开始逐个将肽键水解，游离出单个氨基酸。按照其活性中心和反应条件，蛋白酶又可以分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶和金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
蛋白酶广泛存在于生物体内而且被越来越多地应用到基因工程的研究中。重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等，其中，蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，被广泛应用于生物样品中蛋白质的一般降解。
蛋白酶K(Proteinase K)是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，在真菌林伯氏白色念球菌(tritirachium album limber)中发现,现也可以通过基因工程的手段重组表达获得。野生型蛋白酶K由408个氨基酸组成，研究结果显示，该酶的三级结构中有两个Ca2+ 结合位点，该位点以及反应体系中Ca2+的存在对于维持蛋白酶K的结构及其活性有着重要的影响。
蛋白酶K的应用非常广泛，工业上，蛋白酶K已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、 食品、酿造等方面，工业上大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。在分子生物学和基因工程中，蛋白酶K主要用于核酸的抽提，以及在原位杂交等应用中用于杂交前的处理，蛋白酶K具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。
蛋白酶K作为一种蛋白酶可以起到消化和降解其他蛋白的作用，但同时其本身也是一种蛋白质。和大部分的蛋白质一样，其活性和稳定性也受到温度、PH值、保存时间等因素的影响，因此，蛋白酶K通常需要用干粉状态于O 4°C保存，有效期为一年，或溶液状态下于-20°C保存，有效期为半年。这给蛋白酶K的运输和应用都带来了不便，如何加强蛋白酶K的稳定性、延长其保存期非常有必要。发明内容
本发明的目的在于提供一种可以用于蛋白酶K溶液常温长期保存而不失去活性的缓冲液及其应用，在该缓冲液中，蛋白酶K可以在常温运输和存放超过一年而活性不受显著影响。
本发明通过调整 和对比，对缓冲液的成分、pH值，稳定离子浓度、各成分的浓度等精心设计，最终获得了一种对蛋白酶K在室温保存过程中活性损失最小的缓冲液配方。
本发明首先公开了一种用于蛋白酶K常温保存的缓冲液，所述缓冲液中，除水外， 还包括下列组分
Tris 10mmol/L-500mmol/L,优选 25mmol/L ;
Ca2+ 2mmol/L-50mmol/L,优选 10mmol/L ;
HCl 调节 pH 值至 7.5-8. 4，优选 pH 值为 8.0 ;
甘油(即为体积百分比)，优选50v%。
所述Ca2+来源于可溶性的含Ca2+的化合物，如CaCl2, CaSO4等。
最优选的，本发明的缓冲液中，除水外，余下的组分为
Tris 25mmol/L,
CaCl2 21 Ommol /I,
HCl 调节 pH 值至 8. O
甘油50v%。
本发明进一步公开了所述缓冲液的制备方法，包括下列步骤
1.按照配比，将Tris、可溶性的含Ca2+的化合物和水混合均匀，并用HCl调节pH值至设定值；
2.按照配比，将甘油加入步骤I配制混合液中混匀即制得本发明的缓冲液。
本发明的缓冲液可用于常温保存蛋白酶K。
本发明进一步公开了一种保存蛋白酶K的方法，为将蛋白酶K溶于本发明的缓冲液中配制成溶液常温保存。
配制和溶解过程均为常规，一般蛋白酶K在缓冲液中的浓度为2mg/mL-20mg/mL。
通常情况下，蛋白酶K作为干粉状态保存比较稳定，但在本发明的缓冲液中，蛋白酶K可以在溶液的状态下，于常温下保存超过一年而活性不受明显影响。且采用本发明的方法保存的蛋白酶K可无需处理直接应用，如用于核酸抽提等。
图1是不同保存液保存的蛋白酶K活性比较
第I泳道水溶解蛋白酶K
第2泳道A缓冲液蛋白酶K
第3泳道B缓冲液蛋白酶K
第4泳道C缓冲液蛋白酶K
第5泳道D缓冲液蛋白酶K
第6泳道E缓冲液蛋白酶K
第7泳道F缓冲液蛋白酶K
第8泳道未经消化的BSA
图2是用本发明的缓冲液保存一年后的蛋白酶K溶液用于基因组抽提实验
第1-5泳道使用新配方保存液配制得蛋白酶K
第6-10泳道使用保存一年后的蛋白酶K具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
蛋白酶K保存液配制
在同样的实验条件下，分别用纯水，以及下述各种缓冲液配制浓度为10mg/ml蛋白酶K溶液，分别在配制后于室温存放一年后用于蛋白酶K活性实验。
缓冲液A:准确称取O. 363g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，然后加入90ml水， 充分混匀后用盐酸将其pH调至7. 5，用量筒定容置IOOml得到A试剂，其溶液成分为30mM Tris · Cl, pH 7. 5。
缓冲液B:分别准确称取0. 363g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、l. 117g乙二胺四乙酸二钠盐二水和7. 642g盐酸胍(GuHCl)，然后加入90ml水，充分混匀后用盐酸将其pH调至8. O。再准确量取5ml Tween-20和0. 5ml Triton X-100，加入上述溶液中混匀。用量筒定容置 IOOml 得到 B试剂，其溶液成分为 30mM Tris .Cl，pH 8. 0,30mM EDTA,5% Tween-20, 0. 5% Triton X-100,800mM GuHCl
缓冲液C :分别准确称取0. 121g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、0.931g乙二胺四乙酸二钠盐二水，0. 584g氯化钠和0. 5g SDS，然后加入90ml水，充分混匀后用盐酸将其pH 调至8. O。用量筒定容置IOOml得到C试剂，其溶液成分为IOmM Tris · Cl，pH 8. 0,25mM EDTA, IOOmM NaCl，0.5% SDS。
缓冲液D :分别准确称取0. 363g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、0· 372g乙二胺四乙酸二钠盐二水和Ig SDS，然后加入90ml水，充分混匀后用盐酸将其pH调至8. O。用量筒定容置IOOml得到D试剂,其溶液成分为30mM Tris · Cl pH 8. O, IOmM EDTA, 1% SDS。
缓冲液E :分别准确称取O. 303g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)和O. 147g 二水氯化钙，然后加入40ml水，充分混匀后用盐酸将其pH调至8. 0，用量筒定容置50ml。再准确量取50ml甘油，加入上述溶液中，充分混匀。此溶液为E试剂，其成分为25mM Tris-Cl pH 8. O, IOmM CaCl2, 50v% glycerol，最终缓冲液的 pH 值为 8. 0o
缓冲液F :分别准确称取0. 242g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)和0. 0147g 二水氯化钙，然后加入40ml水，充分混匀后用盐酸将其pH调至7. 4，用量筒定容置50ml。再准确量取50ml甘油，加入上述溶液中，充分混匀。此溶液为F试剂，其成分为20mM Tris-HCl pH7. 4, ImM CaCl2, 50% glycerol。
实施例2
几种不同缓冲 液对蛋白酶K的保护效果比较
采用牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白酶K的消化对象，分别比较在不同缓冲液中保存的蛋白酶K的活性。
2.1 BSA样品的处理
新鲜配制BSA溶液，准确称取2mg BSA粉末，充分溶解于Iml水中，获得2mg/ml的BSA工作液，用于蛋白酶K活性测试。
2. 2蛋白酶K消化
Protease K用上述各溶液配制成10mg/ml溶液，于室温保存一年后进行后续实验。
每个离心管中取100 μ I 2mg/ml的BSA工作液，共8管。取出其中一管作为实验的对照管，并做好标记。向另外7管溶液中分别加入2 μ I的水溶解蛋白酶K，A缓冲液蛋白酶K，B缓冲液蛋白酶K，C缓冲液蛋白酶K，D缓冲液蛋白酶K，E缓冲液蛋白酶K，F缓冲液蛋白酶K，充分混匀，室温消化15分钟。
2. 3 SDS-PAGE检测蛋白酶K消化效果
按以下配方配制SDS-PAGE
权利要求
1.一种用于蛋白酶K保存的缓冲液，所述缓冲液中，除水外，还包括下列组分Tris 10 mmol/T-500 mmol/LCa2+2 mmol/L-50 mmol/LHCl调节pH值至7· 5-8. 4甘油 30ν%-60ν%。
2.如权利要求1所述缓冲液，其特征在于，所述Tris的浓度为25mmol/L。
3.如权利要求1所述缓冲液，其特征在于，所述Ca2+的浓度为lOmmol/L。
4.如权利要求1所述缓冲液，其特征在于，所述PH值为8. O。
5.如权利要求1所述缓冲液，其特征在于，所述甘油的浓度为50v%。
6.如权利要求1所述缓冲液，其特征在于，所述Ca2+来源于可溶性的含Ca2+的化合物。
7.如权利要求6所述缓冲液，其特征在于，所述含Ca2+的化合物选自CaCl2和CaS04。
8.如权利要求1所述缓冲液，其特征在于，所述缓冲液中，除水外，余下的组分为Tris 25 mmol /I,CaCl2 10 mmol/LHCl 调节pH值至8. O甘油 50v%。
9.如权利要求1-8任一权利要求所述缓冲液用于常温保存蛋白酶K的用途。
10.一种保存蛋白酶K的方法，为将蛋白酶K溶于权利要求1-8任一权利要求所述的缓冲液中配制成溶液常温保存。
11.如权利要求10所述方法，其特征在于，蛋白酶K在所述缓冲液中的浓度为2mg/ mL-20mg/mLo
全文摘要
本发明公开了一种用于蛋白酶K常温保存的缓冲液及其应用。本发明的缓冲液主要成分包括水、Tris、Ca2+及甘油。在本发明的缓冲液中，蛋白酶K可以在溶液的状态下，于常温下保存超过一年而活性不受明显影响。
文档编号C12N9/56GK103031291SQ201110295618
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者李威, 芦丽亚 申请人:生工生物工程(上海)股份有限公司