专利名称：一种利用木质纤维素制备l-乳酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及通过微生物发酵生产有机酸的技术领域，具体涉及利用一株改造的厌氧梭菌菌株降解木质纤维素发酵生产L-乳酸的方法。
背景技术：
L-乳酸(L-lactic acid)是在生物发酵过程中通过L-乳酸脱氢酶的催化作用下将丙酮酸转换而成的左旋乳酸。与D-乳酸相比，由于L-乳酸可直接参与人体代谢、无任何副作用等良好的生物相融性，其被广泛应用于食品、医药、化工等领域。
木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，但只有极少数被有效利用，绝大部分被作为废物弃置在环境中，比如城市垃圾，反而造成环境污染。我国是农业大国，每年的农林废弃物总量约15亿吨，所以利用木质纤维素作为原材料生产各类生物燃料以及化工产品具有广阔的应用前景。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成，分别占35-50%，20-35%，以及10-15%。由于其结构极其复杂，导致其降解十分困难。
整合生物加工技术(Consolidated BioProcessing, CBP)针对当前木质纤维素利用技术中采用单元操作与集成优化模式面临的诸多挑战，通过将纤维素酶的生产、纤维素的酶水解、戊糖发酵与己糖发酵等原本分立的反应步骤进行整合，大大简化了生产工艺并有效地降低了成本，从而提高纤维素生物转化利用的综合技术经济指标。基于这些显著的特色，CBP被认为是最有前景的低成本纤维素生物转化利用技术路线之一。
热纤梭菌(Clostridium thermocellum)是目前被认为最有希望满足CBP要求的微生物类群之一。热纤梭菌能够在高温厌氧条件下发酵，其产生的纤维小体是目前最高效的结晶纤维素水解体系。热纤梭菌不仅可以直接将纤维素转化为单糖，并将水解产生的纤维寡糖及葡萄糖发酵为乳酸等在工业、食品业等领域有广泛应用的高附加值产品。因此，在工业化应用的前景上，热纤梭菌比目前正在使用的酵母、大肠杆菌和运动发酵单孢菌等非纤维素降解菌具有更加显著的优势。然而，野生型热纤梭菌的乳酸生产能力较低，远不能达到工业化生产要求。
本方法是建立在一株通过遗传改造获得的热纤梭菌菌株CT-ak/dh的基础之上的。在保持野生菌株能够快速降解纤维素的特点前提下，该改造菌株在强化了乳酸合成途径的同时切断了其乙酸合成的途径，从而将源于糖酵解的大部分代谢流导向乳酸发酵的方向，使得利用木质纤维素发酵生产乳酸成为可能。本方法利用该改造菌株建立并优化了木质纤维素发酵制备L-乳酸的方法，从而大大降低乳酸生产成本，具有良好的工业应用前旦-5^ O发明内容
本发明包括建立一株遗传改造的厌氧梭菌菌株CT-ak/dh，以及以该菌株发酵降解预处理秸杆(木质纤维素)来生产L-乳酸两部分内容。所要解决的技术问题可以通过以下方案来实现
1.热纤梭菌的遗传改造
本发明使用的起始菌株为Clostridium thermocellum。
为敲除目的基因，构建的质粒包括PHKOl (敲除质粒骨架，含有下列原件a大肠杆菌的复制起点ColEl和热纤梭菌的复制起点pno ；b热纤梭菌识别的复制其实起始蛋白 repB ;c氣霉素(chloramphenicol)抗性基因cat ;d大环内酷类抗生素(macrolide-linco samide-streptograminB)抗性基因mis),以及在pHKOl基础上构建的敲除质粒pHK02,用于敲除热纤梭菌基因组上的基因Cthe_1028(乙酸激酶)。为表达外源基因，首先在pMPl 或pHKOl的基础上加入厌氧荧光蛋白的编码基因PpFbFP，构建的质粒定义为质粒pEMOl或 PEK01，后在二者基础上加入待表达基因序列，构建表达质粒pEM02或pEK02。
如
图1所示，将上述质粒通过电转化导入到相应的宿主菌株中从而获得相应的目的菌株。本发明中的基因敲除方法是基于同源重组的原理进行的，即根据热纤梭菌基因组上目的基因两侧的核酸序列，分别设计约Ikb长得同源臂序列，并构建在相应的敲除载体上，通过同源臂的交换重组，使得基因组上的目的基因置换到质粒上来，再经过相应的筛选步骤从而达到基因敲除的目的。外源基因的表达是通过PEM02或PEK02上增加启动子和转录终止子原件来控制的，所选用的启动子见表I。
表1.本发明所采用的启动子种类
权利要求
1.一种利用木质纤维素制备L-乳酸的方法，所述方法包括嗜热厌氧梭菌的遗传改造方法和发酵优化培养方法。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于所述嗜热厌氧梭菌是能够利用纤维素生产乳酸的梭菌(Clostridium),包括热纤梭菌(Clostridium thermocellum)衍生的菌株。
3.按照权利要求1-2的方法，其特征在于所述遗传改造方法包括电转化、基因敲除和基因异源表达的方法。
4.按照权利要求3的方法，其所述电转化的方法是基于专利201110048349.9描述的方法进行的。
5.按照权利要求3的方法，其所述基因敲除的方法是基于同源重组的原理进行的。
6.按照权利要求1-5的方法，其所述基因敲除的方法是通过构建pHK系列质粒，并转化到相应宿主细胞中进行的。
7.按照权利要求6的方法，其所述的pHK系列质粒包括pHKOl和pHK02，以及按照本发明所描述构建方法以PHKOl和pHK02为基础构建的其他质粒。
8.按照权利要求1-5的方法，其所述基因表达的方法是通过构建pEK系列质粒以及 PEM系列质粒，并转化到相应宿主中进行的。
9.按照权利要求8的方法，其所述的pEK系列质粒包括pEKOl和pEK02，以及按照本发明所描述构建方法以PEKOl和pEK02为基础构建的其他质粒。
10.一种能利用木质纤维素制备L-乳酸的菌株CT-ak/ldh，其特征是按照权利要求1-9 的任意一项方法构建的。
11.按照权利要求10的改造菌株进行遗传改造的应用，其特征在于所述方法包括a)选定Cthe_1028(ak)作为敲除对象b)选定Idh和PpFbFP作为异源表达的对象c)构建敲除载体和表达载体d)通过电转化向野生菌株导入敲除载体，获得突变株e)通过电转化向突变株导入表达载体，获得改造菌株CT-ak/ldh。
12.按照权利要求10-11的改造菌株进行发酵培养，其特征在于所述方法包括a)所用的高密度发酵培养基配方为“KH2P041.0-1.5g/L，K2HP044.0-10 . 0g/L，氮源 3. 0-7. 0g/L, MgCl2 · 6H201. 0-5. Og/L, CaCl2 · 2H20 50_250mg/L，FeSO4 · 6H20 0. 5-2. 5mg/ L, cysteine hydrochloride1. 0-5. Og/L, resazurin1. 0-10. Omg/L,碳源 10. 0-40. Og/ L, morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)5. 0-.20. Og/L, yeast extract 5. 0_20g/L, sodiumcitrate · 2H20 0. 2-1. 5g/L”。灭菌前调节 pH 为 7. 0-8. 5。b)所用的碳源为纤维素质生物质，包含但不限于秸杆，木菊。c)所用的氮源为有机或无机氮源，包含但不限于尿素，酵母提取物，蛋白胨，玉米浆，硝酸钠，谷氨酸钠。d)所用的发酵条件为“温度50-65°C，厌氧，罐压为0.05-0. 5MPa，搅拌转速为 30-100rpm, pH恒定为7. 0-7. 5左右，发酵时间为24_48h”。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征是所述发酵的方式分批发酵，补料-分批发酵，连续发酵或半连续发酵。
全文摘要
本发明提供了一种利用木质纤维素制备L-乳酸的方法。本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及通过微生物发酵生产有机酸的技术领域，具体涉及利用一株改造的厌氧梭菌菌株降解木质纤维素发酵生产L-乳酸的方法。本发明首次利用遗传改造的嗜热厌氧梭菌菌株用于整合生物加工(Consolidated Bioprocessing，CBP)技术，以木质纤维素为底物发酵生产L-乳酸，从而大大降低乳酸生产成本，具有良好的工业应用前景。
文档编号C12N15/74GK103031348SQ201110295619
公开日2013年4月10日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者崔球, 刘亚君, 洪伟, 崔古贞, 朱新术 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所