一种植物发光转基因方法及发光仙人球的制作方法
【专利摘要】本发明提出一种植物发光转基因方法，其包括步骤：荧光素酶基因群PCR扩增；荧光素酶基因群与pM-18T载体的构建；基因测序；融合基因转入大肠杆菌，测序；目的基因与表达载体的连接；特定启动子与表达载体的构建；融合基因转入农杆菌；将基因及荧光素的合成前提物一起转入植物；以及进行转代筛选稳定发光植物体。本发明还提出利用上述的转基因方法获得的发光仙人球。本发明的植物发光转基因方法可以实现发光植物的产业化，增强园林景观效果，开发旅游生态园，促进花卉产业的大发展；同时，利用发光植物造景还可减少花园景观持续的照明用电的需求，减少能源消耗。
【专利说明】一种植物发光转基因方法及发光仙人球
【技术领域】
[0001]本发明涉及生命科学【技术领域】，特别涉及一种植物发光的转基因技术，以及由此技术获得的一种转基因发光仙人球。
【背景技术】
[0002]在自然界，能发光的生物包括某些细菌、甲壳动物、软体动物、昆虫和鱼类，但能发光的植物却不多见。基因工程的发展使科学家了解到，生物冷光也是由DNA分子中的基因协调控制的，基因工程学家已能把发光基因导人植物细胞中，培育出夜晚能发磷光或萤光的植物。
[0003]首开记录的是美国纽约洲奥本大学的植物病理学家，他们为了更好地研究甘蓝的软腐病，特意把发光细菌的磷光基因转移到病原体黄单饱菌中，使它成为能发光的病囷，然后让它感染一片甘监叶，在暗室中用特制的夜视摄像机逐一拍下细囷在叶脉中移动的情况，由此看出病菌是怎样感染植物体的。
[0004]把发光基因导入树木细胞中，培育出夜晚能发光的树，是基因工程学家努力的又一个目标。在美国，很多生物学家正致力发光树的研究，他们把荧光基因先导入植物细菌有高度感染力的农杆菌体内，使农杆菌发光，然后用它感染树木细胞原生质体，把发光基因整合到叶的质粒中，再通过组织培养诱导成幼苗，培育夜晚能发光的树。但是都没有获得真正的成功。
[0005]能催化荧光素或脂肪醛氧化产生生物发光的一类酶为荧光素酶(Luciferase)。从20世纪50年代就已经有人开始了对发光素酶的研究。1954年，有人从哈氏弧菌中提取并纯化出细菌荧光素酶；1967.年，有人对从费氏弧菌中提取出的荧光素酶的结构和反应原理进行了分析。1956年，萤火虫发光素酶被提取出来，在1970年，这种萤火虫发光素酶的结构第一次被测定了。而从1986年，表达萤火虫发光素酶基因(Iuc基因)的转基因烟草第一次被成功地获得以来，发光素酶的应用和发展进入了一个崭新的时代。
[0006]目前对萤火虫发光素酶(Firefly Luciferase, FL)的研究最多，它的应用范围极广。它可从北美萤火虫(Photinus pyralis)、日本萤火虫(Luciclacr uciata)、北京萤火虫(Pyrococelia pekinensis)等多种萤火虫中提取出来。不像细菌突光素酶有两个多肽链白组成，萤火虫荧光素酶是由单一的多肽链组成，而且不同种类的萤火虫提取出的萤火虫发光素酶的相对分子质量和结构都各有差异。由北美萤火虫提取出的虫发光素酶的相对分子质量约为62ku，是由551个氨基酸残基构成的含有大量的疏水氨基酸残基的单一多肽链。而从日本萤火虫提取出的虫发光素酶的相对分子质量约为61ku,含有548个氨基酸残基。
[0007]目前，荧光素合成的基因也已经发现几个，但未能发现合成荧光素的全部基因。
[0008]目前转基因发光植物实验还未能真正成功，原因在于荧光素的合成基因还没有全面找到。
[0009]荧光素(如图1所示的荧光素的分子结构图)是发光的关键底物，转入荧光素酶的转基因植物因缺乏荧光素而不能发光，转基因植物怎样获得荧光素是关键。目前有两个方法:一个是把荧光素的合成基因一起转入植物中，让其自身合成，但因合成荧光素的个别基因没有找到，该方法目前走不通；另一个是由植物吸收荧光素，但因荧光素水溶性差，无法吸收，有的喷洒或侵泡，但都不能真正有效的解决这个问题。
【发明内容】
[0010]针对现有技术的问题，本发明提出一种植物发光转基因方法，把已发现的荧光素合成基因与荧光素酶基因一起转入仙人球中，把合成荧光素的水溶性的半成品的氨基酸加入水中，让植物吸收，就能最终合成荧光素，从而获得真正意义上的发光植物。
[0011]具体的，本发明的所述的一种植物发光转基因方法包括如下步骤:荧光素酶基因群PCR扩增；荧光素酶基因群与PM-18T载体的构建；基因测序；融合基因转入大肠杆菌，测序；目的基因与表达载体的连接；特定启动子与表达载体的构建；融合基因转入农杆菌(电转化法)；将基因及荧光素的合成前提物一起转入植物；以及进行转代筛选稳定发光植物体。
[0012]根据本发明的另一目的，本发明还提出一种利用上述的转基因方法获得的发光仙人球。
[0013]本发明的植物发光转基因·方法可以实现发光植物的产业化，增强园林景观效果，开发旅游生态园，促进花卉产业的大发展；同时，利用发光植物造景还可减少花园景观持续的照明用电的需求，减少能源消耗。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中:
[0015]图1所示为荧光素的分子结构图；
[0016]图2所示为本发明的植物发光转基因方法的步骤流程图。
【具体实施方式】
[0017]参见图2所示的为本发明的植物发光转基因方法的步骤流程图，所述方法包括步骤:
[0018]萤火中荧光素酶基因群PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增；
[0019]荧光素酶基因群与pM-18T载体的构建；
[0020]基因测序；
[0021]融合基因转入大肠杆菌，测序；
[0022]目的基因与表达载体的连接；
[0023]特定启动子与表达载体的构建；
[0024]利用电转化法将融合基因转入农杆菌；
[0025]将基因及荧光素的合成前提物一起转入植物；以及
[0026]进行转代筛选稳定发光植物体。[0027]本实施例中的萤火中突光素酶为由北美萤火虫(Photinus pyralis)提取出的萤火虫荧光素酶，其是由551个氨基酸残基构成的单一多肽链。把该基因与荧光素合成的相关基因群一起转入仙人球中，把合成荧光素的水溶性的半成品(氨基酸类似物)加入水中，让植物吸收，就能最终合成荧光素，从而获得发光仙人球。
[0028]植物在黑暗中发出亮光的情节富有浪漫气息，颇具吸引力，令人回味无穷。人们对植物和鲜花照亮夜晚的可能性充满了期待，这是一个具有惊人市场潜力的市场。主要表现在:
[0029]1、发光植物必可撼动花卉业，相信它们将在此行业占据主导地位，消费者在户内或私人花园中或婚庆看到活的植物发出亮光，那必将赏心悦目；
[0030]2、发光植物技术可以增强园林景观效果，以此开发旅游生态园。此技术可以用于一年生和多年生景观和花坛植物，皆可形成独特而美丽的景观效果；发光产品也将使季节性展览受益，其前景广阔；
[0031]3、用发光植物造景或许还有助于节电，可减少花园景观持续的照明用电的需求。
[0032]利用本发明的方法获得的转入荧光素酶基因及荧光素合成的相关基因的仙人球，能在黑夜中发出明亮的荧光，而在白昼看不到；虽然发光总体上偏弱，但已经证明本发明的技术方案在实际应用中的可行性。应该说，本发明的技术方案已经为上述的发光植物市场打开了大门，并可带来此领域的可以预见的大力发展。
[0033]本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。.
【权利要求】
1.一种植物发光转基因方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:萤火中荧光素酶基因群PCR扩增；荧光素酶基因群与PM-18T载体的构建；基因测序；融合基因转入大肠杆菌，测序；目的基因与表达载体的连接；特定启动子与表达载体的构建；利用电转化法将融合基因转入农杆菌；将基因及荧光素的合成前提物一起转入植物；以及进行转代筛选稳定发光植物体。
2.一种利用权利要 求1所述的植物发光转基因方法获得的发光仙人球。
【文档编号】C12N15/82GK103436554SQ201310396243
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】顾洪雁 申请人:无锡添然农林科技有限公司