专利名称：一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法
技术领域：
本发明涉及种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法，属转基因植物的分 子检测领域。
背景技术：
随着植物基因工程技术的发展，将外源基因转入植物中以提高植物的产量、 品质、抗逆性或用于某些次生代谢产物的生物反应器等成为可能。转基丙植物 在现代农业技术中扮演越来越重要的角色。转基因的效果有赖于外源基因在转 基因植物中稳定表达。然而，多拷贝重复转基因序列的转基因植物常常使外源 基因不能在转基因植物中稳定表达，甚至完全不表达。这是在转基因植物很容 易发生的现象。特别是花粉管转基因法是外源基因插入有很大的随机性而更易 于产生这种现象。因此，在转基因植物早期筛选中，通过分子检测筛选出已插 入外源基因的转基因植物，同时筛选出单拷贝数转基因植物具有重要的理论价 值和实践意义。 一则可大大减少转基因后期筛选的工作量，二则可提高外源基 因的表达水平和获得稳定表达的转基因植株。
检测转基因植物拷贝数最常ffi且准确的方法是Southerii分子杂交法和实时 定量PCR法。Southern分子杂交法需要放射性同位素操作的实验室条件，虽然 也可用非同位素地高辛做标记，但检测的灵敏度降低，也不能改变长而复杂实 验过程。植物种内特异单拷贝数基因常常被用作参照基因来鉴定转基因植物的 拷贝数，如棉花的特异单拷贝数基因SADI(Xu et a1.，2006)，番茄特异单拷贝 数基因液泡转化酶(杜春芳等，2004),水稻单拷贝基因67^适于做为转基因 水稻PCR检测(Ding et a]. ， 2004 )。然而，这种方法是基于实时定量PCR 的方法实现的，其实验设备、试剂、耗材都较昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用普通或梯度PCR循环仪和植物种内特异单拷
4贝数基因实现转基因植物拷贝数鉴定的简单新方法。PCR产物的多少在琼脂糖电 泳图像中所形成产物带的光密度的高低不同，并在一定范围内有线性相关关系，
PCR的产物多少与样品模板基因的拷贝数和PCR的循环数有直接相关关系。本方 法利用了这一原理，首先将所有待检测样品的DNA浓度调整一致。保证了样品 之间的可比性。然后做目标基因和内标基因在事先确定的相同循环数下的平行 PCR反应及琼脂糖电泳，最后根据目标基因与内标基因PCR产物在电泳图像中的 光密度值的比值来确定目标基因的拷贝数。
本方法与转基因植物的检测紧密结合，并利用其结果。在转基因植物PCR检 测的基础上，选取目标基因在电泳图像中最亮带的样品为确定PCR最佳循环数 的样品。 一般说来不同样品同一基因的PCR，在相同的DNA模版浓度和相同的循 环数的条件下，基因的拷贝数多，PCR产物就多。选择目标基因在电泳图像中最 亮带的样品有可能在所检测的样品中选择了基因拷贝数多的样品。用这个样品 做DNA模板，做系列循环数(20， 22， 24，……38)条件下的PCR反应及产物 电泳，在数字化电泳图像中，随着PCR循环数增加，目标带的光密度值增加， 选择目标基因带光密度值出现拐点，内标基因的带也清晰可见的循环数确定为 最佳循环数。在PCR循环数拐点以下，会出现一个PCR产物与光密度值之间相 关的线性区间，为相对定量计算提供了可能。单拷贝基因样品在这个循环条件 下的PCR产物相对较少，其产物在电泳图像中的光密度值会落在这个线性区间 内，有利于鉴别。如果PCR循环数高于拐点，PCR产物与光密度值之间就会失去
线性关系，难以分辨差异。
当最佳循环数确定之后，做同一样品的目标基因和内标基因在同样循环数 下的平行PCR反应。即做同一样品模板的PCR反应混合液，均分成等份后再加 入不同的引物，在相同循环数下再做相同循环条件的PCR反应及产物电泳，保 证除引物不同之外，PCR反应液、循环数、循环条件(使用梯度PCR循环仪时， 两对引物的退火温度可不同)、产物电泳条件抝相同。使目标基因和内标基因产物间的系统误差减至最小，使单拷贝的内标基因与待测目标基因的拷贝数达到 好的可比性。在电泳图像中，待测目标基因的PCR产物带亮度与内标基因PCR 产物带相似，可S测鉴定为单拷贝外源基因插入样品，亮度显著高于内标基因
PCR产物的，为多拷贝外源基因插入样品。然而，目测失之准确，我们引入了 MATLAB软件的自编程序来完成数字化电泳图像中PCR产物带的光密度值计算。 其PCR产物带的光密度值包括了基因扩增带所形成区域的大小和灰度值高低两 个因子。将目标基因带与内标基因带的光密度值进行比较，比值接近l:l的为 单拷贝外源基因插入，大于等于2:1的为多拷贝外源基因插入。
这种检测方法具有6个显著的优点(1)操作简单，任何一个做转基因植 物PCR分子检测的实验室均可实现批量检测而不增加试验难度；(2)耗时短， 一批转基因植物样品在几天内即可完成检测；(3)费用低廉，所需仪器、试剂 均为普通PCR实验所需；(4)结合了转基因植物的PCR分子检测，在确定一批 样品的最佳PCR循环数的条件下，在此基础上再做一步PCR反应即可确定待测 样品的拷贝数；(5)安全，不涉及放射性试剂；(6)准确，检测结果与Southern 分子杂交检测相似。
具体实施例方式
1. 仪器与试剂
Bio-Rad梯度PCR仪(美国)，E卯endorf生物分光光度计(德国)，Bio-Rad 凝胶成像仪(美国)，Bio-Rad电泳仪(美国)，水平电泳槽(北京六一厂)， Eppe油rf移液器一套。
常规DNA提取试剂；常规PCR试剂(lOXTaq PCR缓冲液，2. 5mM dNTP， Taq酶，超纯水)。
目标基因的引物和内标基因特异区引物由华大基因公司(北京)合成。
2. 相关软件 Photoshop, MATLAB。
3. DNA样品的准备在转基因植物生育期内采集约0. lg幼嫩叶片，用常规提取植物总DNA的方
法提取转基因植物的总DNA样品，琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量，用2pl DNA样品稀释在生物分光光度计上检测浓度，使所有待测样品的总DNA的浓度 调整到100ng/|il。
4. 引物的设计
利用基因引物设计软件(例如Primer5等)，根据转基因植物检测的原则 设计目标基因的引物，根据内标基因的特异区设计内标基因引物。两对引物的 退火温度保持一致较好，也可不同。
5. 转基因植物常规PCR分子检测
根据待测样品数准备PCR反应混合液，分装在PCR反应管中，在每管中分 别加入等量的待测样品的DNA模板，做30个循环的PCR反应。PCR产物做琼脂 糖凝胶电泳，选择阳性反应中最亮条带的待测样品来确定循环数。
6. 最佳循环数的确定
为了使凝胶电泳目标基因带的光密度值计算更加客观，需确定PCR最佳循 环次数。在转基因植物PCR分子检测的基础上，选阳性反应中最亮条带的样品 做DNA模板，准备22个PCR反应混合液，分装成2管，l管加目标基因引物，1 管加内标基因引物，分别分装到10个PCR反应管中，在梯度PCR循环仪中进行 扩增。最初在PCR仪中各放入1管PCR反应液，每隔2个循环各放入1管PCR 反应液。PCR反应设定为38个循环，最后72。C延伸10min，形成2组20， 22， 24， 26…，38系列循环数的PCR产物，在琼脂糖凝胶上电泳。在数字化的电泳图 像中，选择目标基因PCR产物带的光密度值出现拐点，并且内标基因的PCR产 物带也清晰可见的循环数确定为最佳循环数。
7. 拷贝数的确定
将待测样品的PCR反应混合液，均分成2等份， 一份加入目标基因引物， 一份加入内标基因引物，在梯度PCR循环仪中进行最佳循环数下的PCR扩增。 在琼脂糖凝胶上电泳，将目标基因与内标基因带的光密度值进行比较，比值接 沂l:l的为单拷贝外源某闵插入，大于等于2:1的为多拷:& 某因插入。根
7据实践经验，目测也可做出相对正确的判断。 8.光密度值计算
在Photoshop软件下读取电泳图，将要计算光密度的基因产物带连同背景
做固定大小选择、拷贝、粘贴、存储为tif格式文件(见图l)，在MATLAB软
件下读取，并计算光密度值。光密度值计算的基本简单程序
1. Aim二imread ('wenjia函ing. tif');
2. ii:find(Aim〉150);
3. j j二Aim(i:O ;
4. kk=double(jj);
5. mm=kk_150;
6. Qiuhe二sum(腿) 程序说明
语句1:用MATLAB软件读取数字化图像
语句2:根据读取的图像选取适合的灰度背景值(例如150)，背景值因
图像不同而不同，可根据图像中1-5行像素灰度值的平均值求出。找出所有大 于背景值像素点的坐标，即目标带所形成的区域(见图l)。
语句3:将所有大于背景值的像素点的灰度值赋给"jj"，形成新的单列矩阵。
语句4:将"jj"单列矩阵转变为可运算的数据格式赋给"kk"。
语句5:将所有大于背景值的像素点的灰度值减去背景值并赋给"mm"。 语句6:求mm数列之和。其和代表目标带所形成区域的大小和高于背景灰 度值高低两个因子，用光密度表示。
这是程序的基础语句，如果要处理的样品很多，可根据需要编辑循环语句程序。
实例l.转Bt基因抗虫棉后代拷贝数的确定
1常规PCR分子检测。提取转Bt基因抗虫棉样品的总DNA，将样品的DNA浓度调整到100 ng/ pl， 做PCR分子检测。图1为IO个转基因材料PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，在阳 性反应中，2号单株PCR产物条带最亮，2号单株的DNA用来确定循环数。
2检测转份-基因棉花的目标基因引物和内标单拷贝基因的引物 价基因的引物序列
crylA-F: 5， GAAGGA竹GAGCAATCTCTAC 3，
crylA-R: 5， CAATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3， 预期扩增片段大小为340 bp。 内标单拷贝基因SAD1引物序列
SAD-F: 5' GCAAGTAAGAGCGGTGAGC 3'
SAD-R: 5， TCAATTAACCTCCATGGGAC 3预期扩增片段大小为290 bp。
3最佳循环数的确定。
用所选转5t基因抗虫棉株系H3 (即2号单株)的DNA做模板，按照实施方 式第3步准备2组PCR反应混合液，l组加目标基因ciT"引物，l组加内标基 因aiV引物，形成2组20， 22， 24， 26 , 38系列循环数的PCR产物，在1%
的琼脂糖凝胶上电泳。图3为同一 DNA样品目标基因和内标基因系列PCR产物 的电泳图，没有明显产物带的部分在图像中略去。图4为系列PCR产物在电泳 图中的光密度值。其光密度值在32个循环处出现了拐点。在32个循环时，单 拷贝基因的PCR产物带也清晰可见，因此，32个循环数为最佳PCR循 环数。 '
4拷贝数的确定 (1)抗虫棉株系H3拷贝数的确定
将转万f基因抗虫棉株系H3的PCR反应混合液(20 [il PCR体系中依次加入 10XTaq Buffer 2. O]il， dNTP (2. 5raM) l,6fil， Taq酶0. 2^i]，加水14. 6， DNA
9模板1.0pl)，均分成2等份， 一份加入目标基因引物， 一份加入内标基因引物。
目标cir^基因循环条件为94。C预热2min， 94°C 30s， 55°C 30s' 72°C lmin， 32个循环72。C延伸10min。内标SAD1基因循环条件为94'C预热2min， 94°C 30s, 55°C 30s， 72°C lmin， 32个循环72。C延伸10min，在梯度PCR循环仪中 进行PCR扩增。在1%的琼脂糖凝胶上电泳，图5为目标基因和内标基因在同样 循环数下的平行PCR产物电泳图。此实验重复三次。利用MATLAB软件计算目标 基因与内标基因的光密度值的比值，其比值大于等于2，三个重复表现较一致， 鉴定为两拷贝外源基因插入。目测也可得出上述结果，即H3株系为多拷贝转基 因插入株系。 '
(2)抗虫棉株系H5拷贝数的确定
H5与H3同为价基因抗虫棉转基因后代，因此，目标基因和内标基因的循 环体系和循环条件等均同H3株系，依此类推。图6为目标基因和内标基因在同 样循环数下的平行PCR产物电泳图。此实验重复三次。利用MATLAB软件计算目 标基因与内标基因的光密度值的比值，其比值近似等于1，三个重复表现较一致， 鉴定H5为单拷贝外源基因插入。目测也可得出相同的结果。
6.分子杂交验证
为了验证这种鉴定转基因植物拷贝数简单新方法的正确性，对上述两个转Bt 基因抗虫棉株系进行了 Southern分子杂交实验检测。其目标基因的探针制备和 Southern杂交实验方法参照分子克隆实验指南，稍做改良(李建平，2007)。从 图7可以看出H5为目标基因的单拷1M插入，H3为目标基因的两拷贝插入。 Southern结果验证了本发明的实验结果的TH确性。
实例2.转5"^7基因棉花后代拷贝数的确定
1. 依据实例1的实验过程，确定转5"i/^7基因棉的PCR最佳循环次数为32 个循环。
2. 目标基因引物
Susy-F: 5' CATCATTGCGATAAAGGAAAGG 3'Susy-R: 5' GGCTCAAAATCCAATTCCAAAA 3，
预期扩增片段大小为720bp的片段。 3.拷贝数的确定 '
将待测样品的PCR反应混合液(20plPCR体系，依次加入10 XTaq Buffer 2. 0 pi, dNTP (2. 5mM) 1. 6 fil， Taq酶0. 2 pl，加水14. 6 (il， DNA模板1. 0 ^d)，
均分成2等份， 一份加入目标基因5'z^y引物， 一份加入内标基因引物。 目标5ksy基因循环条件为94。C预热2min， 94°C 30s， 58°C 30s， 72°C lmin， 32 个循环72。C延伸10min。内标^历基因循环条件为94。C预热2min, 94°C 30s, 55°C 30s， 72°C lmin， 32个循环72。C延伸10min，在梯度PCR循环仪中进行 扩增。在1%的琼脂糖凝胶上电泳。图8为目标基因和内标基因在同样循环数下 的平行PCR产物电泳图。此实验重复三次。利用MATLAB软件计算目标基因与内 标基因的光密度值的比值，其比值近似等于l，三个重复表现较一致，鉴定为单 拷贝外源基因插入。目测也可得出相同的结果。 6.分子杂交验证
为了验证这种鉴定新方法的正确性，对转5k^基因棉花进行Southern杂交 实验检测。从图9可以看出转5"s/基因棉花株系为目标基因的单拷贝插入。 Southern结果验证了本发明的实验结果的正确性。
图1.图像处理及编程原理图解。
图2.转Bt基因抗虫棉的PCR检测结果
图3.转价基因抗虫棉株系H3的目的基因和内标基因的循环次数电泳图。 M泳道代表DNA标记，M左c/T^基因，为340bp， M右WZV基因，为290 bp;
数字代表循环数。
图4.系列PCR产物在数字化电泳图中的光密度值
图5.转价基因抗虫棉株系H3的目的基因和内标基因的PCR结果。M代表 DNA标记，T为目标基因，C,为aZ^基因，重复三次。图6.转价基因抗虫棉株系H5的目的基因和内标基因的PCR结果。M代表 DNA标记，T为目标基因，C为MZ^基因，重复三次。
图7.转Bt基因抗虫棉H5和H3的Southern杂交结果
图8.转5'^y基因棉花株系目标基因和内标基因的PCK结果。M代表DNA 标记，T为目标基因5^s乂为720bp， C为5^ /基因，重复三次。
图9转A/s/基因棉花株系的Southern杂交结果
参考文献
Ding J, Jia J， Yang L， Wen H， Zhang C， Liu W, Zhang D (2004) Validation of a rice-specific gene, sucrose -phosphate synthase, used as the endogenous reference gene for qualitative and real—time quantitative PCR detection of transgenes. J" Agric Food Chem 52:3372 - 3377
Xu W-T， Huang K-L， Wang Y， Zhang H-X， Luo Y-B (2006) A cotton-specific gene， stearoyi-ACP desaturase, used as a reference for qualitative and real-time quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified organisms. J" Sci Food Agric 86:1103 - 1109.
杜春芳，李朋波，李润植(2004)—种快速鉴定转基因植物纯合体的新方法。生 物技术通讯15: 585-587
李建平，张燕红，王冬梅等(2007〉 一种改良的Sonthern印迹杂交方法。新疆 农业科学，44 (S3): 116-118
1权利要求
1. 本发明涉及了一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法。实验过程首先采集待检测样品的幼嫩叶片，提取总DNA。将所有样品的DNA浓度调整一致。设计待测目标基因和内标基因的特异引物，在PCR分子检测的基础上进一步确定最佳PCR循环数。然后做目标基因和内标基因在相同循环数下的平行PCR及琼脂糖电泳，最后根据二者在电泳图像中的光密度值的比值来确定目标基因的拷贝数。数字化电泳图像的光密度值计算借助于MATLAB软件完成。
2. 根据权利要求l所述的一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法。其特征在于将所有待检测样品的DNA浓度调整一致，使所有样品之间在同一循环数 下具有可比性。
3. 根据权利要求1所述的一种鉴定转基因植物拷贝数的简宇.新方法。其特 征在于在转基因植物PCR检测的基础上，选取PCR产物在电泳图像中最亮带的 样品为确定PCR最佳循环数的样品。
4. 根据权利要求1所述的一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法。其 特征在于将目标基因和内标基因做系列循环数的PCR产物电泳，在数字化电泳 图像中，随着PCR循环数增加，目标带的光密度值增加，选择目标基因带光密 度值出现拐点，内标基因的带也清晰可见的循环数确定为最佳循环数。
5. 根据权利要求1所述的-一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法。其 特征在于做M标基因和内标基I天1在同样循环数下的平行PCR，即做同样品校板 的PCR反应混合液，均分成等份后再加入不同的引物，在相同循环数下做相同循 环条件的PCR反应及产物电泳，保证除引物不同之外，PCR反应液的含量和体积、 循环数、循环条件(两对引物的退火温度不同时，可使用梯度PCR循环仪)、产 物电泳条件均相同。
6. 根据权利要求1所述的一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法。其 特征在于将目标基因与内标基因PCR产物带的光密度值进行比较，比值接近l: 1 的为单拷贝外源基因插入，大于等于2:1的为多拷贝外源基因插入。根据实践 经验，目测也可做出相对正确的判断。
7. 根据权利要求l所述的 -种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法。其特征在于借助MATLAB软件的自编程序完成数字化电泳图像的光密度值计算。
全文摘要
本发明提供了一种利用普通PCR循环仪和植物种内特异单拷贝基因为内标实现转基因植物拷贝数鉴定的简单新方法。其特征在于首先提取待测样品幼嫩叶片的总DNA，将所有样品的DNA浓度调整一致。设计目标基因和内标基因的特异引物，在PCR分子检测的基础上进一步确定最佳PCR循环数。然后做目标基因和内标基因在相同循环数下的平行PCR及琼脂糖电泳，最后根据二者在电泳图像中的光密度值的比值来确定目标基因的拷贝数。本发明的积极效果在于①有益于转基因植物育种中筛选稳定表达的转基因植株；②操作简单、耗时短、费用低廉、安全、准确；③结合了转基因植物的PCR分子检测，任何一个做转基因植物PCR分子检测的实验室均可实现批量检测而不增加实验设备和难度。
文档编号C12Q1/68GK101445826SQ20081007290
公开日2009年6月3日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者李建平, 王冬梅, 胡文冉, 玲 范, 陈勋基 申请人:新疆农业科学院核技术生物技术研究所