专利名称：一种克隆植物减数分裂基因的方法和一种植物减数分裂基因的cDNA序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
本发明提供了利用简并性引物通过嵌合式PCR克隆植物减数分裂基因的方法，提供了水稻减数分裂基因OsDMC1的cDNA序列及其编码的蛋白质序列。
植物的生活史由有性世代和无性世代交替完成，减数分裂是完成这种交替的关键事件。减数分裂的重要特征是核DNA经过一次复制并伴随两次连续的细胞分裂，使最终形成的生殖细胞的染色体数减半。因此，雌雄性细胞受精形成的合子的染色体数能恢复到正常数量。在减数分裂过程中，染色体的正常分离依赖于合线期同源染色体精确配对形成二价体，而同源重组和联会复合体是影响同源染色体配对的主要因素(Kleckner N.，Proc Natl Acad Sci.USA，1996，938167-8174；Zikler D.和Kleckner N.，Annu Rev Genet，1998，32619-697)。
酵母减数分裂基因DMC1已被克隆(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456)。DMC1是酵母减数分裂特异的基因，仅在减数分裂前期I表达，是减数分裂DNA重组和联会复合体形成所必需的(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456；Bishop DK.，Cell，1994，791081-1092)。DMC1蛋白(Dmc1)是大肠杆菌(E.coli)RecA蛋白(recA)的同源蛋白，RecA蛋白能在DNA上聚合形成螺旋状的DNA-蛋白质纤维，是一种DNA重组和修复蛋白(Story RM.等，Nature，1992，355318-324；Nature，1992，355374-376)。酵母dmc1突变体丧失DNA重组功能，不能形成联会复合体，其减数分裂被阻断在前期I(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456)。已从人(Habu T.等，Nucleic Acid Res，1996，24470-477)、鼠(Habu T.等，Nucleic Acid Res，1996，24470-477；Pittman DL.等，Mol Cell，1998，1697-705；Yoshida K.等，Mol Cell，1998，1707-718)等动物体内克隆到DMC1同源基因。人HsDmc1有与酵母Dmc1相似的功能(Li I.等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，9411221-11226)，鼠MmDmc1是减数分裂同源染色体联会必需的(Yoshida K.等，Mol Cell，1998，1707-718)。
在植物中，已克隆了双子叶植物拟南芥的DMC1同源基因AtDMC1(KlimyukVI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4；Doutriaux MP.等，Mol Gen Genet，1998，257283-291)，报道了AtDMC1的DNA序列(登记号U43652)。T-DNA插入AtDMC1基因内，缺失AtDMC1的功能，完全破坏了减数分裂同源染色体配对能力，而对植株的营养生长无明显影响，突变体的同源染色体不能配对形成二价体，减数分裂期的花粉母细胞和大胞子母细胞仅包含10个单价体，但该突变体能产生约1.5％的正常后代。本发明人认为，这是由于拟南芥染色体数少(5对)，染色体随机分离组合形成了少数可育的雌雄配子。确切原因尚待研究(Couteau F.等，Plant Cell，1999，791081-1092)。该结果暗示，减数分裂基因DMC1的功能在植物中是保守的。
除AtDMC1外，在GenBank数据库中报道了单子叶植物大麦DMC1同源基因的DNA序列(登记号AF234170)和双子叶植物大豆DMC1同源基因的cDNA序列(登记号U66836)。但这仅仅是两个基因序列报告，没有分析基因的表达特性，不知它们是否是在生殖器官特异性表达以及基因结构特性，因此它们的可用性尚不确定。
从现有的数据已知，DMC1及其同源基因的DNA序列都含有内含子，例如，酵母DMC1有一个内含子，人HsDMC1有12个内含子，拟南芥AtDMC1有13个内含子。这些内含子在基因转录成成熟的mRNA时被剪切掉，mRNA仅包含了基因的外显子序列。拟南芥是目前已知的基因组最小的植物，植株较小，容易用T-DNA诱导，也易于筛选由T-DNA插入的目的基因的突变体，但这种方法不适于其它植物基因功能的分析。除T-DNA外，反义RNA(或称反义基因)技术是研究基因功能的另一重要与常用的技术。反义RNA技术是利用基因的cDNA序列，将其反向与植物表达载体上的启动子连接。该重组载体被转到植物体后产生与植物体内该基因正常(正义)mRNA互补的反义RNA，两者结合形成二聚体，使正义mRNA不能翻译成蛋白质，基因的功能随之丧失。因此，用反义RNA技术比较容易获得所需要的突变体，也不受植物物种的限制，应用广泛。获得的基因cDNA序列是进行反义RNA构建的首要条件。
通过计算机联网检索尚没有发现可用于研究植物减数分裂基因功能的cDNA序列和与之相关的专利。
本发明的目的是提供一种利用简并性引物MP1-MP4通过嵌合式PCR克隆植物减数分裂基因的方法，提供高等植物减数分裂基因的cDNA序列，以便通过转反义基因技术调控植物的有性生殖。本发明的技术方案如下1)RNA的分离实验材料为水稻。从水稻花粉母细胞减数分裂期的颖花中提取总RNA，随后用无RNA水解酶的DNA水解酶除去RNA中残留的DNA，得到无DNA污染的RNA。2)水稻DMC1同源基因cDNA片段的分离根据在酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1中保守的氨基酸序列合成的简并性引物MP1GGNATHAAYGCNGGNGAYGT；MP2GGNAARGTNGCNTAYATHGA；MP3ACNGCNACRTTRAAYTCYTCNGC和MP4GCRTGNGCNARNTGNCCNCC。以由RNA反转录的第一链cDNA作模板，通过嵌合式PCR(nested PCR)分离水稻DMC1同源基因的cDNA片段。引物对MP1和MP4用于第一轮PCR，而MP2和MP3用于第一轮PCR产物的再扩增。
第一轮PCR产物经第二轮再扩增后，得到一个cDNA片段。该片段经琼脂糖电泳纯化后，克隆到有关载体上并测序。此cDNA片段有一个连续的阅读框(ORF)，编码109个氨基酸，该氨基酸序列与酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1相应序列的一致性分别为58％和91％，说明此cDNA片段是水稻DMC1同源基因cDNA序列的一部分。此水稻DMC1同源基因称为OsDMC1。3)cDNA 3′和5′端的分离根据用嵌合式PCR分离得到的水稻OsDMC1 320bp的cDNA序列合成引物MP5CCGGCCTGAACGAATTGT、MP6TGGGATGGATGCCAATGC、MP7TCTCTCAGCAATCGGCACAA和MP8AACAGCATTGGCATCCAT。通过cDNA末端的快速扩增(RACEs)(Forhman MA.等，Proc Natl AcadSci USA，1988，858998-9002)分离OsDMC1 cDNA的3′和5′端。用RNA和寡聚-dT衔接头(oligo-dT adapter)(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物合成第一链cDNA，随后用基因特异的引物MP5、MP6和衔接头引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATC)经两轮PCR扩增得到OsDMC1 cDNA的3′端，通过琼脂糖电泳纯化后，将其克隆到有关载体上并测序。
用基因特异的引物MP7与MP8和GIBCO-BRL 5′RACE试剂盒(GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，按试剂盒的说明书通过PCR扩增得到OsDMC1cDNA的5′端，通过琼脂糖电泳纯化后，将其克隆到有关载体上并测序。
最后将320 bp cDNA序列、3′和5′端序列拼结成OsDMC1全长cDNA序列，如SEQ NO 1所示。4)OsDMC1的表达用非放射性的地高辛(DIG)标记的OsDMC1 cDNA探针，通过Northern印渍杂交分析OsDMC1在水稻颖花、叶、幼芽和根中的表达，检测不到杂交信号。因此用RT-PCR Southern印渍杂交分析OsDMC1的表达。OsDMC1 cDNA特异的正义和反义引物分别是GTCCAAGCAGTACGACGAAGG和TTCCTCGACATGTGCAAAGT。以水稻微管蛋基因tubA作对照，所用的正义和反义引物分别是TCAGATGCCCAGTGACAGA和TTGGTGATCTCGGCAACAGA。
分别用来源于颖花、叶、幼芽和根的RNA合成第一链cDNA，以稀释的第一链cDNA作PCR模板。PCR产物经1％的琼脂糖电泳分离后，转移到尼龙膜上，用DIG标记的OsDMC1 cDNA探针杂交。杂交结果显示OsDMC1主要在颖花中表达，在根中有微量表达，而在叶和幼芽中不表达。该结果与拟南芥AtDMC1相似，RT-PCR分析结果表明AtDMC1在生殖器官中表达活性最高，在叶中有微量表达(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。而原位杂交和AtDMC1启动子-GUS融合基因分析显示AtDMC1仅在花药和雌蕊的减数分裂细胞中表达。本发明人认为，造成其与RT-PCR结果差异的原因可能是RT-PCR过于灵敏的原因(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4)。5)OsDMC基因的特征OsDMC1 cDNA全长为1348 bp(SEQ NO 1))，由1035bp长的阅读框(ORF)、45bp的5′端非翻译区和268bp的3′端非翻译区组成。阅读框从核苷酸46开始到核苷酸1080结束，终止密码是TGA。Poly(A)信号ACTAAA位于核苷酸1168-1173。Poly(A)位点在核苷酸1337。该cDNA编码由344个氨基酸组成的蛋白质(OsDmc1)(SEQ NO 2)。OsDmc1的分子质量是37.6kD，等电点是5.53，其与酵母Dmc1、鼠MmDmc1、人HsDmc1和拟南芥AtDmc1氨基酸序列的同源性分别为51.8％、59.5％、60％和81.7％。OsDmc1含有在上述提及的Dmc1及其同源蛋白和其它NTP-结合蛋白中存在的ATP/GTP结合位点GXXXXGKT(OsDmc1氨基酸残基133-140)。本发明人首次从OsDmc1中鉴定出基元(motif)LXXXGIXXXDXXK(氨基酸34-46)和LXXXKGXSXXKV(氨基酸66-77)，分析发现该基元在上述提及的Dmc1及其同源蛋白中是保守的，可能与OsDmc1在减数分裂中作用的特异性有关。本发明人首次发现OsDmc1有一个cAMP/cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点KRKS(氨基酸101-104)、一个酪蛋白激酶II磷酸化位点TGSD(氨基酸94-97)、一个酪氨酸激酶磷酸化位点KKLQDAGIY(氨基酸45-53)、五个蛋白激酶C磷酸化位点[TKK(氨基酸62-64)、SGK(氨基酸137-139)、TFR(氨基酸171-173)、SGR(氨基酸239-141)与TIR(氨基酸302-304)]和七个十四烷酰化位点[GINSGD(氨基酸38-43)、GIYTCN(氨基酸51-56)、GLSEAK(氨基酸71-76)、GGIETL(氨基酸121-126)、GMDANA(氨基酸185-190)、GMFITD(氨基酸282-287)与GIMDAK(氨基酸338-343)]。本发明的有益效果GenBank数据库报道了拟南芥DMC1同源基因AtDMC1的DNA序列(登记号U43652)。研究表明，AtDMC1在生殖器官雄蕊和雌蕊中特异表达(KlimyukVI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4)。T-DNA插入突变AtDMC1，使之功能缺失，对植株营养生长无明显影响，但导致减数分裂同源染色体不能配对，使雌雄性不育(Couteau F.等，Plant Cell，1999，791081-1092)。除AtDMC1外，GenBank数据库还报道了单子叶植物大麦DMC1同源基因的DNA序列(登记号AF234170)和双子叶植物大豆DMC1同源基因的cDNA序列(登记号U66836)，但这仅仅是两个基因序列报告，没有基因的表达分析，不知它们是否是在生殖器官特异性表达以及基因结构特性，因此其可用性尚不确定。
依据本发明人所掌握的资料，在克隆基因的方法上，本发明是第一个用两对简并性引物(MP1与MP4及MP2与MP3)、通过嵌合式PCR得到植物DMC1同源基因cDNA克隆。这说明所用的简并性引物MP1-MP4正位于植物DMC1同源基因的外显子区。由于是简并性引物，该引物包含了编码所对应氨基酸保守区的各种密码组合，它们能用于分离所有植物DMC1同源基因的cDNA克隆。本发明所设计的引物、由其组成的引物组合和用该引物进行的嵌合式PCR适用于各种高等植物DMC1同源基因cDNA克隆的分离。
本发明报道的水稻减数分裂基因OsDMC1，是首例单子叶植物DMC1同源基因cDNA序列的报道。表达分析证明，该基因在生殖器官中特异(优势)表达；用该cDNA序列进行的反义RNA分析证明OsDMC1控制水稻减数分裂同源染色体的配对，基因功能缺失导致雌雄性不育。因此它也是首例知道基因功能和表达特性的植物DMC1同源基因cDNA序列。OsDMC1编码的蛋白质(OsDmc1)与已知功能的酵母Dmc1、鼠MmDmc1、人HsDmc1和拟南芥AtDmc1氨基酸序列的同源性分别是51.8％、59.3％、60％和81.7％，表明OsDMC1是水稻的减数分裂基因。鉴于此，本发明所报道的OsDMC1 cDNA可用于通过反义RNA等技术产生雄性不育、雌性不育或雌雄不育植株；也可用于生产杂交种子，以提高作物的产量；也可根据需要控制植物的育性，例如，使杨树不育，以减少杨树种子(白色的毛)对环境尤其是城市环境的污染。
具体实施例方式一、水稻OsDMC1 cDNA的分离1)RNA的分离用Trizol试剂盒(GIBICO-BRL，Life Technologies，USA)从花粉母细胞减数分裂期的颖花中提取总RNA，随后用无RNA水解酶的DNA水解酶(TaRaKaBiotechnology(Dalian)Co.，Ltd)除去RNA中残留的DNA。除去DNA后的RNA用于反转录合成第一链cDNA。2)cDNA片段的分离根据在酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1中保守的氨基酸序列合成的简并性引物MP1、MP2、MP3和MP4。以由RNA反转录的第一链cDNA作模板，通过嵌合式PCR分离OsDMC1的cDNA片段。引物对MP1和MP4用于第一轮PCR，而MP2和MP3用于第一轮PCR产物的再扩增。
为了合成第一链cDNA，将4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加无菌水使混合物体积达到12微升，70℃保温10分钟，转至冰浴中，加入4微升5X第一链缓冲液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃预热2分钟后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆转录酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反应50分钟，合成第一链cDNA，最后在70℃加热15分钟，失活逆转录酶。
第一轮PCR反应混合物为20微升，含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1微升第一链cDNA，40pmol MP1，40pmolMP4，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技术服务有限公司)。反应条件是94℃预变性1分钟；随后在94℃变性1分钟，48-55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟3秒钟，共进行30个循环；最后在72℃保温10分钟。PCR产物经1％琼脂糖电泳后呈浅的弥散状。
第二轮PCR反应混合物为20微升，含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1微升第一轮PCR产物，40pmol MP2，40pmolMP3，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技术服务有限公司)。反应条件是94℃预变性1分钟；随后在94℃变性1分钟，48-55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟3秒钟，共进行30个循环；最后在72℃保温10分钟。第二轮PCR扩增后得到OsDMC1的320bp cDNA片段。该片段经琼脂糖电泳纯化后，克隆到pGEM-T载体(Promega Corporation，USA)上，测序。3)cDNA 3′和5′端的分离根据用嵌合式PCR分离的水稻OsDMC1的320bp cDNA序列合成引物MP5、MP6、MP7和MP8。通过cDNA末端的快速扩增方法分离OsDMC1 cDNA的3′和5′端。
对于3′的分离，将5微克RNA和10pmol寡聚-dT衔接头(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物混合，加无菌水使混合物体积达到12微升，70℃保温10分钟，转至冰浴中，加入4微升5X第一链缓冲液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃预热2分钟后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆转录酶(200U/微升，GIBCO-BRL，LifeTechnologies，USA)，42℃反应50分钟，合成第一链cDNA，最后在70℃加热15分钟，失活逆转录酶。该cDNA用作PCR模板。第一次PCR混合物的体积50微升，含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％ Nonidet P-40，1微升cDNA，10pmol MP5，10pmol衔接头引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATC)，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技术服务有限公司)。反应条件是94℃预变性1分钟；随后在94℃变性1分钟，52-60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟3秒钟，共进行30个循环；最后在72℃保温10分钟。第二次PCR使用1微升第一次PCR的产物作模板和MP6与衔接头引物对，其它条件与第一次PCR的相同。第二次PCR扩增后得到OsDMC1 cDNA的3′端cDNA片段，琼脂糖电泳纯化后，将其克隆到pGEM-T载体上，测序。
对于OsDMC1 cDNA的5′端片段克隆，将5微克RNA与2.5pmol MP7混合，加无菌水使混合物体积达到12微升，70℃保温10分钟，迅速转至冰浴中，加入4微升5X第一链缓冲液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃预热2分钟后，加入1微升 SuperScript II RNaseH-逆转录酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反应50分钟，合成第一链cDNA，最后在70℃加热15分钟，失活逆转录酶。用GlassMax Cartridge(GIBCO-BRL，LifeTechnologies，USA)纯化第一链cDNA，除去多余的引物。按GIBCO-BRL 5′RACE试剂盒(GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)的指导，在第一链cDNA的5′端加多聚G尾。加尾的cDNA用作PCR模板。第一次PCR混合物的体积50微升，含10mM Tris-HCl，pH8.3、50mM KCl、2mM MgCl2、0.05％ Nonidet P-40、1微升加尾的cDNA、10pmol MP7、10pmol UAP引物、200uM dNTPs和2.5UPfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技术服务有限公司)。反应条件是94℃预变性1分钟；随后在94℃变性1分钟，52-60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟3秒钟，共进行30个循环；最后在72℃保温10分钟。第二次PCR使用1微升第一次PCR的产物作模板和MP8与UAP引物对，其它条件与第一次PCR的相同。第二次PCR扩增后得到OsDMC1 cDNA的5′端cDNA片段，琼脂糖电泳纯化后，将其克隆到pGEM-T载体上，测序。
最后将320bp cDNA序列、3′和5′端序列拼结成全长的OsDMC1 cDNA序列(SEQ NO 1)。二、OsDMC1的表达分析用RT-PCR southern印渍杂交分析OsDMC1的表达。OsDMC1 cDNA特异的正义和反义引物分别是GTCCAAGCAGTACGACGAAGG和TTCCTCGACATGTGCAAAGT。以水稻微管蛋基因tubA作对照，所用的正义和反义引物分别是TCAGATGCCCAGTGACAGA和TTGGTGATCTCGGCAACAGA。
用来源于颖花、叶、幼芽和根的总RNA合成cDNA。将4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加无菌水使混合物体积达到12微升，70℃保温10分钟，转至冰浴中，加入4微升5X第一链缓冲液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃预热2分钟后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆转录酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反应50分钟，合成第一链cDNA，最后在70℃加热15分钟，失活逆转录酶。稀释100倍的cDNA用作PCR的模板。50微升的PCR反应混合物含1微升稀释的cDNA模板、10pmol正义引物、10pmol反义引物、400μM dNTPs、1X GC PCR缓冲液和2.5U的LATaq DNA聚合酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)。PCR反应条件是94℃预变性1分钟；94℃，1分钟，55-60℃，1分钟，72℃，1分钟30秒钟，25个循环；72℃，10分钟。PCR产物经1％的琼脂糖电泳分离后，通过毛细管作用转移至Hybond N+尼龙膜上(Amershanm Pharmacia Biotech Ltd，EnGLand)，用DIG标记的OsDMC1 cDNA探针杂交(Boehringer Mannheim，Germany)。杂交结果显示OsDMC1主要在颖花中表达，在根中有微量表达，而在叶和幼芽中不表达。该结果与拟南芥AtDMC1相似，RT-PCR分析结果表明AtDMC1在生殖器官中表达活性最高，在叶中有微量表达(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。而原位杂交和AtDMC1启动子-GUS融合基因分析显示AtDMC1仅在花药和雌蕊的减数分裂细胞中表达，Klimyuk和Jones认为造成其与RT-PCR的结果差异的原因可能是RT-PCR过于灵敏(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。三、OsDMC1的功能分析1)PCR扩增所需的cDNA片段依据SEQ NO 1的OsDMC1 cDNA全序列，合成正义引物GACTGAGCTCGATGCTGGTATCTACACTTGC和反义引物CTGATCTAGATTCCTCGACATGTGCAAAGT。正义引物的5′端有一个SacI位点，反义引物3′端有一个XbaI位点，以便能将cDNA反向与启动子连结。
用来源于减数分裂期颖花的RNA合成第一链cDNA。将4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加无菌水使混合物体积达到12微升，70℃保温10分钟，转至冰浴中，加入4微升5X第一链缓冲液，1微升10mM dNTPs，2微升0.1mMDTT，42℃预热2分钟后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆转录酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反应50分钟，合成第一链cDNA，最后在70℃加热15分钟，失活逆转录酶。PCR反应混合物为50微升，含1X PCR缓冲液，1微升第一链cDNA，10pmol正义引物，10pmol反义引物，200uM dNTPs，2.5单位Taq DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技术服务有限公司)，混合物在94℃预变性1分钟，随后在94℃，1分钟，55-60℃，1分钟和72℃，1分钟30秒钟，30个循环，最后在72℃延伸10分钟。得到的cDNA长1015bp(核苷酸190至核苷酸1205)，覆盖了近全长的阅读框。将该cDNA片段连接到pGEM载体(Promega Corporation，USA)上，得到重组质粒pRCM30。2)用限制性内切酶XbaI和SacI在37℃分别双酶切质粒pRCM30和pBI121(Clontech Laboratories，Inc，USA)，琼脂糖电泳纯化后，得到双酶切的OsDMC1 cDNA片段和pBI121。用T4DNA连接酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)将cDNA片段连接到pBI121上，得到重组质粒pARM。在pARM中，OsDMC1 cDNA反向与CaMV35S启动子连接。3)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切pARM，琼脂糖电泳纯化后，得到CaMV 35S启动子-OsDMC1 cDNA-NOS终止子的构建体，将该构建体与植物表达载体连接，获得在植物中表达OsDMC1反义RNA的重组表达载体pAEM.。4)用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，经头孢霉素和潮霉素筛选获得抗性愈伤组织。将生长良好、结构致密的抗性愈伤组织转至含潮霉素的预分化培养基培养两周，随后转到含潮霉素的分化培养基进一步培养，得到潮霉素抗性的再生植株。5)用CTAB法(Murray和Thompson，Nucl Acid Res，1980，84321-4325)提取基因组DNA，通过PCR和Northern印渍杂交进一步检测得到转OsDMC1反义基因的植株。6)将转基因水稻T1代自交种子在含潮霉素的培养基上发芽，在温度28℃(白天)/25℃(夜间)和光照14小时/黑暗10小时条件下生长，10天后检测抗性，并对转基因植株后代分离比进行统计7)用I2-KI染色检查转基因植株花粉育性和最后观测结实率，证明转反义基因导致植株雌雄性不育。
附录SEQ NO 1CGCCGGCCGCCTCCGCCTACAGGTGCGGGGGGTCTGTGTGAGCAGATGGCGCCGTCCAAGCAGTACGACGAAGGCGGGCAGCTCCAGCTCATGGATGCAGAGAGGATCGAGGAGGAGGAGGAGTGCTTCGAGTCCATCGACAAGTTAATCTCGCAAGGGATAAACTCTGGAGATGTGAAGAAGCTGCAGGATGCTGGTATCTACACTTGCAATGGCCTCATGATGCATACAAAGAAGAGCCTGACAGGAATCAAGGGATTATCTGAAGCAAAGGTAGACAAGATCTGTGAAGCAGCTGAAAAGCTTCTGAGCCAGGGCTTCATGACAGGAAGTGATCTCCTTATCAAGCGGAAGTCTGTTGTTCGGATCACCACTGGGAGCCAGGCACTTGATGAGCTGCTTGGCGGAGGGATTGAAACACTCTGCATCACAGAGGCATTTGGAGAGTTCCGATCAGGGAAGACCCAGTTGGCTCACACTCTATGTGTCTCCACTCAGCTTCCAATTCACATGCATGGGGGGAATGGGAAGGTCGCTTATATCGATACTGAGGGAACATTCCGGCCTGAACGAATTGTGCCGATTGCTGAGAGATTTGGGATGGATGCCAATGCTGTTCTTGATAATATCATATATGCTCGTGCATACACCTATGAGCACCAGTACAACCTTCTCCTTGGCCTTGCCGCTAAGATGGCTGAAGAGCCTTTCAGGCCTCTGATTGTGGATTCTGTGATCGCACTATTCCGTGTCGATTTCAGTGGCAGGGGTGAACTTGCAGAGCGCCAGCAAAAATTGGCACAGATGCTCTCCCGCCTTACTAAAATAGCTGAGGAGTTCAATGTTGCAGTGTACATCACCAACCAAGTGATTGCCGACCCAGGTGGTGGAATGTTCATAACTGACCTGAAAAAACCAGCGGGAGGCCACGTGCTGGCGCATGCAGCTACCATCCGGTTGATGCTGAGGAAAGGCAAAGGAGAGCAGCGTGTCTGCAAGATCTTTGATGCCCCTAACCTGCCTGAGGGAGAAGCTGTTTTCCAGGTAACATCAGGTGGAATAATGGATGCGAAAGACTGAATGTTCATTGAGGGTGCTTCCTGTCTTCAAATTATTCAGGTTTCTCCTAGTAAATTCCTGCATAGGCCATATAGGTTTGGTACATTGACTAAACTACTACTGCTACTTTGCCACTGTCGAGGAAATATGCAACCTCATTTATCCAGACGATTATACCTTAAAATGGGTATTTTTCTATGCTTATGAGATCAACAGTTGTACTGAAACAAATACAGTATTGGCTTAAGTGAAAATATATAAGAGGGTTACATGATGGTAAAAAAAAAAASEQ NO 21MAPSKQYDEG GQLQLMDAER21IEEEEECFES IDKLISQGIN41SGDVKKLQDA GIYTCNGLMM61HTKKSLTGIK GLSEAKVDKI81CEAAEKLLSQ GFMTGSDLLI101KRKSVVRITT GSQALDELLG121GGIETLCITE AFGEFRSGKT141QLAHTLCVST QLPIHMHGGN161GKVAYIDTEG TFRPERIVPI181AERFGMDANA VLDNIIYARA201YTYEHQYNLL LGLAAKMAEE221PFRPLIVDSV IALFRVDFSG241RGELAERQQK LAQMLSRLTK261IAEEFNVAVY ITNQVIADPG281GGMFITDLKK PAGGHVLAHA301ATIRLMLRKG KGEQRVCKIF321DAPNLPEGEA VFQVTSGGIM341DAKD
权利要求
1.一种克隆基因的方法，其特征在于用两对简并性引物通过嵌合式PCR方法克隆基因；
2.权利要求1的方法，其中所说的基因为植物减数分裂基因；
3.权利要求1的方法，其中所说的简并性引物包括MP1、MP2、MP3和MP4。其各自的序列为MP1GGNATHAAYGCNGGNGAYGT；MP2GGNAARGTNGCNTAYATHGA；MP3ACNGCNACRTTRAAYTCYTCNGC和MP4GCRTGNGCNARNTGNCCNCC
4.权利要求3的方法，其特征在于简并性引物中的MP1与MP4进行第一轮PCR，简并性引物中的MP2与MP3和以上述第一轮PCR的产物作模板进行第二轮PCR；
5.用权利要求1的方法所获得的一种水稻减数分裂基因OsDMC1的cDNA序列，其特征在于该cDNA序列具有如SEQ NO 1所示的核苷酸1到1348的序列；
6.权利要求5的cDNA序列，其中所说的cDNA序列包括该序列的部分序列；
7.权利要求5的cDNA序列，其中所说的cDNA序列包括该序列的同源序列；
8.一种多肽序列，其特征在于该多肽序列是由权利要求5的cDNA序列所编码，且具有如SEQ NO 2所示的氨基酸1到344的序列；
9.权利要求8的多肽序列，其中所说的多肽序列包括该序列的部分序列；
10.权利要求8的多肽序列，其中所说的多肽序列包括该序列的同源序列；
11.一种反义RNA(基因)构建体，其特征在于该构建体根据权利要求5至7的任何一种核苷酸序列所构建。
12.权利要求11的反义RNA(基因)构建体，其中所说的反义RNA(基因)构建体可用于转化植物以控制植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
13.权利要求11的反义RNA(基因)构建体，其中所说的反义RNA(基因)构建体可用于生产杂交种子；
14.权利要求11的反义RNA(基因)构建体，其中所说的反义RNA(基因)构建体可用于使杨树不育，以减少杨树种子对环境的污染；
15.权利要求11的反义RNA(基因)构建体，其中所说的反义RNA(基因)构建体能够转化单子叶植物，以控制该植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
16.权利要求11的反义RNA(基因)构建体，其中所说的反义RNA(基因)构建体能够转化水稻，以控制该植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
17.权利要求11的反义RNA(基因)构建体，其中所说的反义RNA(基因)构建体能够转化双子叶植物，以控制该植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性。附录SEQ NO 1CGCCGGCCGCCTCCGCCTACAGGTGCGGGGGGTCTGTGTGAGCAGATGGCGCCGTCCAAGCAGTACGACGAAGGCGGGCAGCTCCAGCTCATGGATGCAGAGAGGATCGAGGAGGAGGAGGAGTGCTTCGAGTCCATCGACAAGTTAATCTCGCAAGGGATAAACTCTGGAGATGTGAAGAAGCTGCAGGATGCTGGTATCTACACTTGCAATGGCCTCATGATGCATACAAAGAAGAGCCTGACAGGAATCAAGGGATTATCTGAAGCAAAGGTAGACAAGATCTGTGAAGCAGCTGAAAAGCTTCTGAGCCAGGGCTTCATGACAGGAAGTGATCTCCTTATCAAGCGGAAGTCTGTTGTTCGGATCACCACTGGGAGCCAGGCACTTGATGAGCTGCTTGGCGGAGGGATTGAAACACTCTGCATCACAGAGGCATTTGGAGAGTTCCGATCAGGGAAGACCCAGTTGGCTCACACTCTATGTGTCTCCACTCAGCTTCCAATTCACATGCATGGGGGGAATGGGAAGGTCGCTTATATCGATACTGAGGGAACATTCCGGCCTGAACGAATTGTGCCGATTGCTGAGAGATTTGGGATGGATGCCAATGCTGTTCTTGATAATATCATATATGCTCGTGCATACACCTATGAGCACCAGTACAACCTTCTCCTTGGCCTTGCCGCTAAGATGGCTGAAGAGCCTTTCAGGCCTCTGATTGTGGATTCTGTGATCGCACTATTCCGTGTCGATTTCAGTGGCAGGGGTGAACTTGCAGAGCGCCAGCAAAAATTGGCACAGATGCTCTCCCGCCTTACTAAAATAGCTGAGGAGTTCAATGTTGCAGTGTACATCACCAACCAAGTGATTGCCGACCCAGGTGGTGGAATGTTCATAACTGACCTGAAAAAACCAGCGGGAGGCCACGTGCTGGCGCATGCAGCTACCATCCGGTTGATGCTGAGGAAAGGCAAAGGAGAGCAGCGTGTCTGCAAGATCTTTGATGCCCCTAACCTGCCTGAGGGAGAAGCTGTTTTCCAGGTAACATCAGGTGGAATAATGGATGCGAAAGACTGAATGTTCATTGAGGGTGCTTCCTGTCTTCAAATTATTCAGGTTTCTCCTAGTAAATTCCTGCATAGGCCATATAGGTTTGGTACATTGACTAAACTACTACTGCTACTTTGCCACTGTCGAGGAAATATGCAACCTCATTTATCCAGACGATTATACCTTAAAATGGGTATTTTTCTATGCTTATGAGATCAACAGTTGTACTGAAACAAATACAGTATTGGCTTAAGTGAAAATATATAAGAGGGTTACATGATGGTAAAAAAAAAAASEQ NO 21MAPSKQYDEG GQLQLMDAER21IEEEEECFES IDKLISQGIN41SGDVKKLQDA GIYTCNGLMM61HTKKSLTGIK GLSEAKVDKI81CEAAEKLLSQ GFMTGSDLLI101KRKSVVRITT GSQALDELLG121GGIETLCITE AFGEFRSGKT141QLAHTLCVST QLPIHMHGGN161GKVAYIDTEG TFRPERIVPI181AERFGMDANA VLDNIIYARA201YTYEHQYNLL LGLAAKMAEE221PFRPLIVDSV IALFRVDFSG241RGELAERQQK LAQMLSRLTK261IAEEFNVAVY ITNQVIADPG281GGMFITDLKK PAGGHVLAHA301ATIRLMLRKG KGEQRVCKIF321DAPNLPEGEA VFQVTSGGIM341DAKD
全文摘要
本发明提供了利用简并性引物通过嵌合式PCR克隆植物减数分裂基因的方法,提供了水稻减数分裂基因OsDMCl的全长cDNA序列及其编码的氨基酸多肽序列。该cDNA序列全长1,348 bp,编码344个氨基酸的多肽。该cDNA可用于构建反义基因构建体。利用该构建体可控制植物的有性生殖。
文档编号C12N15/10GK1351168SQ0013008
公开日2002年5月29日 申请日期2000年10月27日 优先权日2000年10月27日
发明者王台, 丁兆军 申请人:中国科学院植物研究所