专利名称：植物小核糖核酸基因的鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种植物小核糖核酸基因，尤其涉及一种植物小核糖核酸(microRNA)基因的鉴定方法。
技术背景植物小核糖核酸(microRNA)是真核生物中大量存在的^^一类大小约 为21碱基的小型分子，负调控对应靶基因的表达，从而调控真核生物的生 长发育，包括重要发育时期转换、细胞分裂与分化、程序性细胞死亡、 器官分化、极性建成、分生组织决定性建立等等。在植物的发育转换进程 中，小核糖核酸(microRNA)对于从分化的子细胞系中清除一些关键调节 因子发挥重要功能。目前小核糖核酸(microRNA)基因的鉴定方法包括直接克隆法和软件 预测法。两种方法各有优劣。而只有直接克隆法才能够实际得到小核糖核 酸(microRNA)基因。动物细胞的小核糖核酸(microRNA)直接克隆法能 够借助于病毒载体(如腺病毒载体)完成，而在植物中尚无类似载体可用。 这给植物中小核糖核酸(microRNA)基因的鉴定及其功能研究带来了困难， 所以目前小核糖核酸(microRNA)在植物中的研究进展落后于动物。烟草花叶病毒(TMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是迄今为止研 究者了解最为详尽的植物病毒之一。其基因组由一条单链带有帽子结构的 核糖核酸(RNA)正链组成，全长6395碱基对，5'端和3'端都有一段高度 结构化的非翻译区，病毒基因组RNA被病毒外壳蛋白(CP)包装成一类长300 nm，直径15nm的杆状病毒粒子。能够系统感染烟草等茄科植物和十字花科植物。为制备用于植物的小核糖核酸(microRNA)研究专用的重组烟草 花叶病毒(TMV)载体提供了可能。如何利用上述原理，制备一种植物小 核糖核酸(microRNA)研究专用的重组烟草花叶病毒(TMV)载体，方便 地用于茄科和十字花科植物中小核糖核酸(microRNA)的搜寻、克隆和功 能研究，是科技技术人员要解决的问题。 发明内容本发明需要解决的技术问题是提供了一种植物小核糖核酸基因的鉴定方法，旨在解决上述的问题。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下步骤实现的-在野生型烟草花叶病毒的外壳蛋白的末段插入筛选标记； 在3'非翻译区引入小核糖核酸专用的多克隆位点，以利于插入适当的小核糖核酸基因；构建植物小核糖核酸研究的重组烟草花叶病毒载体。 与现有技术相比，本发明的有益效果是能够方便地用于茄科和十字花科植物中小核糖核酸(microRNA)的搜寻、克隆和功能研究；能够在转染后对当代植物进行分析而无须对转染群体进行纯合化操作，无须等待转染的后代产物。
图1是本发明的设计原理图；具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述.-由图1可见在野生型烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白的末段插入 筛选标记(如绿色荧光蛋白基因GFP) +磷酸化蛋白(P62c-mgc)的编码 基因c-myc的表位，以利于转染后的直观检测(利用筛选标记如绿色荧光 蛋白GFP)和免疫检测(利用磷酸化蛋白抗体)；在3'非翻译区(3'-UTR区)引入小核糖核酸(microRNA)专用的多克隆位点，以利于插入适当的 小核糖核酸(microRNA)基因(参见图1);构建一种植物小核糖核酸 (microRNA)研究专用的重组烟草花叶病毒(TMV)载体。 应用本发明的载体试剂盒，其主要组成如下小核糖核酸(microRNA)研究专用的重组烟草花叶病毒(TMV)载体 一份；烟草花叶病毒(TMV)包装蛋白一份；其他辅助试剂。本发明的特点如下在3'非翻译区(3'-UTR区)引入小核糖核酸(microRNA)专用的多 克隆位点，不影响烟草花叶病毒(TMV)重组载体在宿主体内的转录；引入的小核糖核酸(microRNA)专用多克隆位点能够插入多种小核糖 核酸(microRNA)基因；能够在转染后对当代植物进行分析而无须对转染群体进行纯合化操 作，无须等待转染的后代产物。
权利要求
1. 一种植物小核糖核酸基因的鉴定方法，是通过以下步骤实现的在野生型烟草花叶病毒的外壳蛋白的末段插入筛选标记；在3’非翻译区引入小核糖核酸专用的多克隆位点，以利于插入适当的小核糖核酸基因；构建植物小核糖核酸研究的重组烟草花叶病毒载体。
全文摘要
本发明涉及一种植物小核糖核酸基因的鉴定方法，是通过以下步骤实现的在野生型烟草花叶病毒的外壳蛋白的末段插入筛选标记；在3′非翻译区引入小核糖核酸专用的多克隆位点，以利于插入适当的小核糖核酸基因；构建植物小核糖核酸研究的重组烟草花叶病毒载体；本发明的有益效果是能够方便地用于茄科和十字花科植物中小核糖核酸(microRNA)的搜寻、克隆和功能研究；能够在转染后对当代植物进行分析而无须对转染群体进行纯合化操作，无须等待转染的后代产物。
文档编号C12Q1/68GK101275162SQ20071003880
公开日2008年10月1日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者刘志学, 赫英俊, 邵永胜 申请人:上海捷瑞生物工程有限公司