植物细胞周期基因及其应用方法

专利名称：：植物细胞周期基因及其应用方法
技术领域：
：本发明涉及编码细胞周期蛋白的分离的植物多核苷酸，以及它们在基因操作植物生长和形态方面的应用方法。相关申请的相互参考本申请要求2003年7月28日提交的美国临时专利申请60/490,846和2003年9月12日提交的美国临时专利申请60/502,573的优先权。
背景技术：
：细胞周期在调节真核细胞的生长和发育方面具有重要作用。虽然动物、植物和酵母内的细胞周期核心分子机制具有相似性，但植物在细胞周期调节的若干个方面是独特的。植物细胞具有刚性细胞壁，因而比动物细胞和酵母相对稳定。对植物而言，诸如光、温度、营养和渗透压、重力和创伤的环境因素在起动和控制植物生长方面具有重要作用，其细胞分裂周期易受这些因素的影响。细胞分裂、细胞扩增和细胞死亡均对植物生长和构造起重要作用。植物的所有细胞均来源于分生组织，该组织在胚胎早期形成并继续增殖，在植物的寿命期间参与了器官形成。成熟的非增殖性分化型植物细胞仍具有全能性，并可在合适的培养条件下被诱导恢复增殖并再生出完整植株。细胞分裂周期和核内再复制周期这两个细胞周期均在植物内起作用，在植物的形态发育中均具有特定作用。植物分裂周期包括细胞生长、DNA复制和有丝分裂，并受环境调控因素(例如，植物激素、营养和光)以及局部和总体模式调控因素的影响，前者环境调控因素是在细胞响应环境变化时调控细胞分裂的速率和方向，后者局部和总体模式调控因素则参与了形态发生(MeijerandMurray，Curr.Opin.PlantBiol.444-49(2001))。核内再复制周期是一个被缩短的细胞周期，期间细胞在缺乏有丝分裂的情况下继续生长并合成DNA。许多植物物种均具有内倍性(即大于二倍体基因组DNA含量)(参见Kondorosietal.，Curr.Opin.PlantBiol.3488-492(2000)(综述))。在某些植物中，内倍性仅限于某些细胞或组织，而在另一些植物中，内倍性则表现在所有或大部分细胞类型中。植物细胞可退出有丝分裂周期，以受控方式进入核内周期(Cebollaetal.，EMBO.J.184476-4484(1999))。核内周期常见于分化型植物细胞内，与细胞分化和细胞大小调控方面紧密相连(Nagl，W.EndopolyploidyandPolytenyinDifferentiationandEvolutionTowardsanUnderstandingofQuantitativeandQualitativeVariationofNuclearDNAinOntogenyandPhylogeny(North-Holland，N.Y.，1978))。核内周期涉及调节了功能特异性细胞内的基因表达。细胞周期调节的基本特征是所有真核细胞共有的。细胞分裂周期被划分为四个截然不同的时期S期(DNA合成)、M期(有丝分裂)、G1(S期前的间期)和G2(S期后的间期)。每一个细胞分裂周期均以G1、S、G2和M的顺序重复这些事件。细胞周期受特定蛋白质复合体的形成的驱动，该蛋白质复合体含有可调节G1到S和G2到M过渡的细胞周期蛋白和依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)(Mironovetal.，PlantCell11509-521(1999)；ForsburgandNurse，Annu.Rev.CellBiol.7277-256(1991)；NorburyandNurse，Annu.Rev.Biochem.61441-470(1992)；Nasmyth，TrendsinGenetics12405-412(1996))。这两个过渡是调控细胞周期进展的重要关卡。细胞周期蛋白与CDK的结合对蛋白激酶活性和确定靶特异性而言必不可少(Nigg，BioEssays17471-480(1995)；Morgan，Nature374131-134(1995))。业已鉴定了若干类植物CDK(参见Mironovetal.，1999中的表1和表2)。它们的区别在于细胞周期内的转录模式、它们的细胞周期蛋白结合基序以及它们的生物学活性。不同的细胞周期蛋白-CDK复合体调控细胞周期进展的不同时期。D型细胞周期蛋白受生长调节物刺激后可诱导CDK活性，并将胞外信号转换用于刺激细胞分裂(Riou-Khamlichietal.，Science2831541-1544(1999)；Fuerstetal.，PlantPhysiol.1121023-1033(1996)；DeVeylderetal.，Planta208452-462(1999))。CDK活性受CDK活化激酶(CAK)的正调节，和CDK抑制剂(CKI)的负调节(Inzeetal.，PlantCell11991-994(1999)；Umedaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9713396-13400(2000)；Wangetal.，PlantJ.15501-510(1998)；Wangetal.，Nature386451-452(1997))。CDK可使包括成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白在内的广泛多种底物磷酸化，其中Rb是E2F族细胞周期转录因子的阻抑蛋白。Rb通过与参与DNA复制和细胞周期进展的基因的转录所必需的E2F转录因子结合并对其进行负调节而得以发挥作用(Inzeetal.，(1999)Ibid；Dynlacht，Nature389149-153(1997)；DeJagerandMurray，PlantMol.Biol.41295-299(1999))。Rb被CDK磷酸化后失活。业已证实植物D型细胞周期蛋白能够结合成视网膜细胞瘤-相关蛋白(Nakagamietal.，PlantJ.18243-252(1999)；Achetal.，Mol.Cell.Biol.175077-5086(1997))，还可与Cdc2一起使Rb-相关蛋白磷酸化(Nakagamietal.，Ibid.)。贯穿S期的进展被认为受细胞周期蛋白A激酶调控，而细胞从G2进入有丝分裂期则通过B型细胞周期蛋白的表达和B细胞周期蛋白-CDK复合体的活化而被调控。在M期内，有丝分裂周期蛋白被后期促进复合体(APC)降解，由此失活的激酶复合体则有助于细胞退出有丝分裂。在M期过渡点之前对有丝分裂周期蛋白的负调节和/或对有丝分裂CDK/细胞周期蛋白复合体的抑制可诱导核内再复制。业已证实参与起动S期DNA复制的复制前复合体的过量表达可诱导叶细胞内的核内再复制(参见Meijer和Murray在Curr.Opin.PlantBiology444-49(2001)中的综述；以及在ThePlantCell1411-16(2002)中的会议报告植物的细胞分裂周期与发育之间的“串话”)。除上述核心细胞周期基因外，还有一些基因也被认为可充当细胞分裂和细胞扩增的调节基因。这些基因包括肽基脯氨酸顺反异构酶(PPIases)(Vittoriosoetal.，Mol.Cell.Biol.183034-3043，1998)、G-蛋白(Ullahetal.，2001，Science2922066-2069)、MAP激酶(Jouannicetal.，2001，PlantJ.26637-649)和组蛋白乙酰基转移酶(Howeetal.，GenesDev.153144-3154(2001))。业已通过利用RNAi技术对线虫C.elegans的染色体III中基因的系统性分析，鉴定出线虫胚胎内正确细胞分裂所必需的133个基因(Gonczyetal.，2000，Nature408331-336)。通过分析6000个酵母基因缺失系，还鉴定出参与细胞分裂和细胞大小调控的500个基因(Jorgensenetal.，2002，Science297395-400)。肽基脯氨酸顺反异构酶(PPIases)可催化从肽键氨基末端到脯氨酸这一在能量方面不易进行和在固有特性方面缓慢的顺/反异构化过程(Hunter，1998，Cell92141-143)。在目前已确定的三个结构截然不同的PPIase家族中，有证据表明高度保守的Pin1-型蛋白(Luetal.，Nature380544-547(1996))对细胞存活而言必不可少。作为芽殖酵母和HeLa细胞必需的有丝分裂调节物，Pin1可与固定的磷蛋白亚群结合，而许多磷蛋白还可被有丝分裂-和磷酸-特异性单克隆抗体MPM-2识别(Yaffeetal.，1997，Science2781957-1960))。此外，Pin1可调节其结合蛋白的功能，包括抑制Cdc25C的有丝分裂促进活性(Shenetal.，1998，GenesDev.12706-720)。Pin1的缺失或突变可诱导酵母、HeLa细胞和Xenopus非洲爪蟾属卵提取物过早进入有丝分裂和终止有丝分裂(Luetal.，1996，Nature380544-547；Hanietal.，1999，J.Biol.Chem.274108-116；Winkleretal.，2000，Science2871644-1647；Crenshawetal.，1998，EMBOJ.171315-1327；Shenetal.，1998，ibid.)。Pin1也是非洲爪蟾属提取物内的复制关口所必需的蛋白(Winkleretal.，2000，ibid.)。最近，业已报道了Pin1-型PPIase的植物同源物。诸如拟南芥属植物的AtPin1(Landrieuetal.，2000，J.Biol.Chem.27510577-10581)和苹果MdPin1(Yaoetal.，2001，J.Biol.Chem.27613517-13523)的植物Pin1同源物缺乏NH2-末端WW结构域，但与Pin1的PPIase结构域具有显著的同源性。在标准蛋白酶-偶联PPIase试验中，MdPin1表现了与人Pin1相同的磷酸化特异性底物特异性。有趣的是，与Pin1一样，MdPin1和AtPin1均能够拯救酿酒酵母中Pin1同源物ESS1/PTF1基因的温敏突变的致死有丝分裂表型(Yaoetal.，2001，J.Biol.Chem.27613517-13523)。但尚未有报道描述AtPin1是否在植物细胞周期进展和植物发育方面具有作用，以及何种作用。对植物细胞周期基因的遗传操纵使人们很有希望改造具有农学重要性的若干性状，诸如木材生长和品质、果实大小和农作物产量。果实、木材和大部分植物器官的生长反映了细胞增殖(细胞分裂)和扩增(核内再复制)的变化。木材是树木的木质部组织，来源于形成层分生组织经过细胞分裂所生成的细胞。来源于形成层的细胞在分化为具有厚次生细胞壁的成熟木质部细胞之前便显著增大。核内再复制是使该细胞体积增大的原因。开花后的果实生长首先是刺激可形成果肉的组织内的细胞分裂。该细胞分裂活性通常仅限于果实发育的最初期，之后才是对最终果实大小起最大作用的细胞扩增。不同植物物种在果实发育期间的细胞分裂期长短不同，例如，番茄为7-10天，苹果则约为4周。在果实组织内的细胞扩增期间，重复进行着DNA合成循环，而不干扰可导致生成核内多倍体细胞的细胞分裂(核内再复制)。细胞分裂与植物发育之间的关系及其复杂，迄今仍不为人所充分了解(Hemerlyetal.，1999，BioEssays2129-37)。为了可靠地预测细胞周期调节物对植物的转基因修饰的影响，就需要更好地了解细胞周期调节是如何与形态发生以及植物对环境变化的适应作用结合为一体的。不过，据报道，已有试验结果表明通过转基因表达细胞周期基因调节植物生长是可能的，并且不会对植物发育和形态发生造成不利影响。例如，可表达具有特定显性失活突变的拟南芥属CDC2a基因的转基因烟草植物所含细胞较少，但仍表现正常的形态发生，其中所述特定突变可使细胞分裂数减少(Hemerlyetal.，1995，EMBOJ.143925-3936)。Cyc1At受Cdc2aAt启动子调控在转基因拟南芥属植物内提高表达可使该植物具有较长的根部，该根部所含细胞数也增加了(Doerneretal.，1996，Nature280520-523)。过量表达D型细胞周期基因(cycD2At)的转基因烟草植物表现为总体生长速率提高、叶萌发速率提高和从幼苗到成熟所有阶段的发育加快，但细胞大小仍正常。枝端分生组织内的细胞由于细胞周期G1期缩短从而获得了较快的分裂速率(Cockcroftetal.，Nature405575-579(2000))。发明概述本发明提供了分离自植物的编码参与调节细胞大小和细胞增殖的多肽的多核苷酸序列。该多核苷酸序列如序列表的SEQIDNO1-12、16-22、46-47和59所示。由SEQIDNO1-12、16-22、46-47和59编码的预测多肽序列分别如序列表的SEQIDNO27-45、48-49和60所示。这些多核苷酸序列可被用于调节植物表型和生成具有新型或改良性状的改良植物，诸如在下述方面的变化植物高度和生物量；叶片大小或数目；枝条长度和密度；根部长度、密度和分支；每株植物的种子产量；开花；包括木材形成组织在内的组织中的细胞数和大小；以及植物生殖器官的发育。此外，预期可将上述某些序列用于提高转化效率和促进转基因植物的再生。本发明还提供了包括本发明所述一个或多个多核苷酸序列的重组遗传构建体和包括这些构建体的转基因植物细胞。所述若干构建体为重组表达盒，所含本发明序列的表达受植物功能性启动子调控。包括表达构建体的转基因宿主细胞可被用于再生成可表达本发明所述多核苷酸序列的转基因植物。本发明的另一个方面提供了通过将被本文鉴定为编码细胞周期调节物的分离多核苷酸序列导入植物并在其中表达以改变植物表型的方法。这些方法包括用含有选自SEQIDNO.1-13、16-23、26、46-47和59所示序列的一个或多个多核苷酸序列的一个或多个遗传构建体转化植物，并使这些序列在组成型或可调型启动子(例如，组织或器官特异性启动子或诱导型启动子)调控下表达。在某些优选实施方案中，被转化的细胞类型或组织参与了木材形成、植物生殖和贮藏器官的形成或果实生成。在一种优选实施方案中，编码多蛋白复合体中的若干蛋白的细胞周期基因组合在发育中的植物内共同表达，促进了细胞增殖和植物生长，其效果优于单个基因表达所实现的效果。在另一种优选实施方案中，植物Pin1基因在AP3启动子或同源启动子，优选在雄性和/或雌性生殖组织发育早期有效的启动子的调控下表达，从而改良了植物的生殖发育。目前优选的序列选自序列表中SEQIDNO23、26、46和47所示的序列。在另一种优选实施方案中，细胞周期基因的表达被用于促进植物再生、提高转化效率和提供鉴定转化体所用的阳性筛选方法。本发明的另一个方面提供了可使特定生物合成途径的产物产量提高的方法，其中的特定生物合成途径在目标植物组织内起作用，该方法包括用本文所公开的一个或多个多核苷酸序列稳定转化该植物的基因组。一种实施方案是用表达可致使细胞数扩增的分离AMP1或与AMP1相关的D型细胞周期蛋白序列和编码上述途径所涉及转录调节物或生物合成酶的序列共转化所述植物。转基因表达优选地受特定启动子调控，该启动子选择性地在上述途径起作用的组织内有活性。在一种尤其优选的实施方案中，CycD多核苷酸序列与编码特定酶的序列一起被表达在植物的木质部内，所述特定酶参与了细胞壁物质，诸如木材中的木质素和高结晶度纤维素的生成。本发明还包括生成具有新型表型的植物的方法以及由这些方法获得的植物。本发明的另一个方面提供了桉树、松树、黑麦草和葫芦物种来源的细胞周期多肽的分离序列。这些多肽可被用于筛选细胞周期蛋白的生物学功能(例如蛋白质相互作用、酶活性)的拮抗剂和增效剂，和生成有助于表达分析、纯化细胞周期蛋白及其多蛋白复合体的特异性抗体，以及筛选表达文库。附图简述图1.氨基酸序列的比对结果(A)和植物Pin1基因的系统树(B)。这些基因的物种和GENBANK编号如表2所示。该图所示植物Pin1基因的SEQIDNOS.参见表2和3以及序列表。这些基因的全长氨基酸序列均通过CLUSTALW(v1.75)多重序列比对程序被排列在一起。系统树是利用Belvu程序基于序列比对结果建立的。图2.拟南芥属花表型。WT花显示了正常的花瓣、雄蕊和心皮发育(A)；pJY603转基因植物的花表现为无花瓣或雄蕊(B)；(pJY603×35S::AP3)杂交所获植物的花显示了正常的花瓣和正常的雄蕊(C)或非常小的花瓣和正常的雄蕊(D)；(E)为具有小花瓣的花的高倍放大图，(F)为具有小花瓣且心皮融合差的花的高倍放大图。图3.与经由空对照载体pART29转化的植物(右)相比，经由AtPin1的RNAi沉默构建体JY618转化的本塞姆氏烟草植物非常小(左)或大小中等(中)。图4.可过量表达AMP1的拟南芥属植物的表型变化。AMP1T1转基因植物的下胚轴(中和右)比经由空载体pART27转化的植物的下胚轴(左)长2-3倍。图5.可过量表达AMP1的拟南芥属植物的下胚轴表型变化。与对照下胚轴(左)相比，AMP1转基因下胚轴(右)含有许多小细胞。这些细胞较小，且AMP1下胚轴内的细胞层数增多。图6.可过量表达AMP1的拟南芥属植物的叶片表型变化。AMP1转基因植物叶片的表皮细胞(下)远小于对照植物叶片的表皮细胞(上)。图7.AMP1拟南芥属转基因植物的毛状体由多个细胞和核组成(左)，而对照植物的毛状体则仅含单个细胞和核(右)。图8.可过表达AMP1的巨桉(Eucalyptusgrandis)转基因植物的表型变化。与经由pART69构建体转化的对照植物(左)相比，由AMP1构建体转化的植物(右)在组织培养基中生成的根部较长(A)，在土壤中生长较快(B)且所含细胞较多和较小(c)。图9.如SEQIDNO27所示的氨基酸序列。保守的生长素载体结构域如下划线部分所示。图10.如SEQIDNO28所示的氨基酸序列。保守的生长素载体结构域如下划线部分所示。富含Gly的区域如黑体/斜体所示。图11.如SEQIDNO29所示的氨基酸序列。保守的三十四肽重复(TPR)如下划线部分所示。图12.如SEQIDNO30所示的氨基酸序列。保守的细胞周期蛋白依赖性激酶结构域如下划线部分所示，细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚单位特征1如框所示。图13.如SEQIDNO31所示的氨基酸序列。保守的细胞周期蛋白依赖性激酶结构域如下划线部分所示，细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚单位特征1如框所示。图14.如SEQIDNO32所示的氨基酸序列。保守的真核生物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域如下划线部分所示，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性部位特征如框所示。图15.如SEQIDNO33所示的氨基酸序列。保守的RasGTPase超家族如下划线部分所示。图16.如SEQIDNO34所示的氨基酸序列。保守的RasGTPase超家族如下划线部分所示。图17.如SEQIDNO35所示的氨基酸序列。保守的RasGTPase超家族如下划线部分所示。图18.如SEQIDNO36所示的氨基酸序列。保守的RasGTPase超家族如下划线部分所示。图19.如SEQIDNO37所示的氨基酸序列。保守的RasGTPase超家族如下划线部分所示。图20.如SEQIDNO38所示的氨基酸序列。保守的细胞周期蛋白结构域如下划线部分所示。图21.如SEQIDNO39所示的氨基酸序列。保守的N-和C-末端结构域如下划线部分所示。图22.如SEQIDNO40所示的氨基酸序列。保守的N-和C-末端结构域如下划线部分所示。图23.如SEQIDNO41所示的氨基酸序列。保守的N-和C-末端结构域如下划线部分所示。图24.如SEQIDNO42所示的氨基酸序列。保守的N-和C-末端结构域如下划线部分所示。图25.如SEQIDNO43所示的氨基酸序列。保守的N-和C-末端结构域如下划线部分所示。图26.如SEQIDNO44所示的氨基酸序列。保守的N-和C-末端结构域如下划线部分所示。图27.如SEQIDNO45所示的氨基酸序列。保守的N-和C-末端结构域如下划线部分所示。图28.该图所示为三种AMP1桉树植物(左侧)在暖房生长4个月后的高度变化，并与三种pART69对照植物(右侧)对比。发明详述本发明所述多核苷酸编码可调节细胞大小和细胞增殖的多肽。该多核苷酸可被用于调节植物生长和构造，以获得具有新型或改良性状的改良植物，例如，在高度和生物量；叶片大小或数目；枝条长度和密度；根部长度、密度和分支；每株植物的种子产量；开花；包括木材形成组织在内的各组织中的细胞数和大小；以及植物生殖器官的发育方面得到改良的植物。此外，某些这样的序列被认为可用于提高转化效率和促进转基因植物的再生。本发明由此提供了用于调节植物中的多核苷酸和/或多肽含量和组合物的方法，这种方法包括将含有本发明所述一种或多种多核苷酸的遗传构建体稳定整合进所述生物的基因组内。本发明的相关方面提供了用于获得具有变更基因型或表型的植物的方法，该方法包括用本发明所述遗传构建体转化植物细胞，以获得转基因细胞，并在有助于再生和成熟植物生长的条件下培养该转基因细胞。本发明设想和包括了通过调节本发明所述多核苷酸或多肽的水平或含量所获得的与野生型生物相比具有变更基因型或表型的植物，以及该植物的组成(种子等)及其后代。本发明所述分离的多核苷酸还有助于基因组作图、物理作图和基因的定位克隆。此外，被鉴定为如SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示的多核苷酸序列及其变体可被用于设计寡核苷酸探针和引物。寡核苷酸探针和引物具有与目标多核苷酸的某个部位基本互补的序列。通过本领域熟知的技术，诸如狭线印迹DNA杂交技术，可将利用本发明所述多核苷酸设计的寡核苷酸探针用于检测特定生物中的特定基因存在与否，并检验其表达模式，其中所述特定生物所含细胞具有与该寡核苷酸探针序列充分相似的DNA和RNA序列。利用本发明所述多核苷酸设计的寡核苷酸引物可被用于PCR扩增。利用本发明所述多核苷酸设计的寡核苷酸探针和引物还可与包括AffymetrixInc.(SantaClara，CA)的微阵列技术在内的多种微阵列技术结合应用。本发明的一个方面提供了包括特定序列的分离多核苷酸，所述特定序列选自(a)SEQIDNO1-12、16-22、46-47和59；(b)SEQIDNO1-12、16-22、46-47和59的互补序列；(c)SEQIDNO1-12、16-22、46-47和59的反向互补序列；(d)SEQIDNO1-12、16-22、46-47和59的反向序列；(e)编码选自SEQIDNO27-45、48-49和60的多肽序列的序列；(f)由于遗传密码简并性而与(a)-(d)所述序列不同的序列；以及与(a)-(d)所述序列具有至少75％、80％、90％、95％或98％同一性的变异序列，其同一性百分比的确定如下所述。本文所用术语“多核苷酸”指聚合形式的核苷酸，包括DNA和对应的RNA分子，以及单和双链分子，包括HnRNA和mRNA分子、DNA和RNA分子的有义和反义链，还包括cDNA、基因组DNA，以及全部或部分合成的多核苷酸。本发明所述多核苷酸可能为完整基因或其任意部分。本文所用术语“基因”指编码功能蛋白或RNA分子的DNA序列。可行的反义多核苷酸可能包括对应多核苷酸的片段，因此“多核苷酸”的定义包括所有可行的反义片段。反义多核苷酸和涉及反义多核苷酸的技术均是本领域熟知的，可参考例如Robinson-Benionetal.，MethodsinEnzymol.254(23)363-375，1995和Kawasakietal.，Artific.Organs20(8)836-848，1996所述内容。本发明还提供了包括上述多核苷酸序列的互补序列、反向互补序列或反向序列，及其序列变体在内的多核苷酸。下述实例可最好地说明本文所用术语“互补序列”、“反向互补序列”和“反向序列”的定义。序列5’AGGACC3’的互补序列、反向互补序列和反向序列如下所示互补序列3’TCCTGG5’反向互补序列3’GGTCCT5’反向序列5’CCAGGA3’.与上述特定多核苷酸序列互补的序列优选地与该特定多核苷酸序列的全长序列均互补。本文所用与特定“x”值有关的术语“x-聚体”指至少含有SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示任意多核苷酸中的特定数目(“x”)相邻残基的多核苷酸。x值的范围取决于所述特定序列，可能为大约20到大约600。本发明所述多核苷酸包括至少含有SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示任意多核苷酸或其变体中的特定数目相邻残基的多核苷酸(x-聚体)。同样，本发明所述多肽包括至少含有SEQIDNOS27-45、48-49和60所示任意多肽中的特定数目相邻残基的多肽(x-聚体)。优选实施方案的x值为至少20，更优选为至少40，还要更优选为至少60，最优选为至少80。因此，本发明所述多核苷酸包括含有SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示多核苷酸或与其对应的多核苷酸变体中的20-聚体、40-聚体、60-聚体、80-聚体、100-聚体、120-聚体、150-聚体、180-聚体、220-聚体、250-聚体；或300-聚体、400-聚体、500-聚体或600-聚体的多核苷酸。本发明所述多肽包括含有SEQIDNOS27-45、48-49和60所示多肽或其变体中的20-聚体、40-聚体、60-聚体、80-聚体、100-聚体、120-聚体、150-聚体、180-聚体、220-聚体、250-聚体；或300-聚体、400-聚体、500-聚体或600-聚体的多肽。利用如SEQIDNOSSEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示的cDNA序列，可通过常规方法确定和获得与本发明所述多核苷酸对应的RNA序列、反向序列、互补序列、反义序列等。本发明所述如SEQIDNO1-12、16-22、46-47和59所示的多核苷酸序列可通过对从下文实施例1所述大叶桉、辐射松、多年生黑麦草和葫芦中制备获得的cDNA文库进行高通量测序而得以分离。这些序列包括编码参与植物细胞增殖和生长的多肽的全长可读框，和mRNA的非翻译区。可选地，基于SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示序列的寡核苷酸探针和引物可通过下述具体方法合成，通过杂交或聚合酶链反应(PCR)技术可将其用于鉴定桉树、松树、黑麦草和葫芦组织细胞来源的cDNA或基因组DNA文库中的阳性克隆。适合与这种寡核苷酸探针结合应用的杂交和PCR技术是本领域熟知的(参见例如，Mullis等人所著的ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.，51263，1987；由StocktonPressNY，1989出版Erlich编辑的PCRtechnology和由CSHLPressColdSpringHarbor，NY，1989出版Sambrook等人编辑的第2版Molecularcloningalaboratorymanual)。除DNA-DNA杂交法外，还可能采用DNA-RNA或RNA-RNA杂交试验。在第一种情况中，可被检出的是来源于被表达基因的mRNA，而不是来源于样品mRNA的基因组DNA或cDNA。第二种情况可利用RNA探针。还可应用可与靶序列特异性杂交的人工DNA类似物。阳性克隆可通过利用限制酶消化、DNA测序等方法分析。还可利用或者可选地利用本领域熟知的技术合成本发明所述多核苷酸。可利用例如，自动寡核苷酸合成仪(例如BeckmanOligo1000MDNASynthesizer；BeckmanCoulterLtd.，Fullerton，CA)合成该多核苷酸，以获得含有多达50个或更多核酸的多核苷酸片段。接着可利用分子生物学领域熟知的标准DNA操纵技术将上述多个多核苷酸片段连接。一种常规和典型的多核苷酸合成技术包括合成具有例如，80个核酸的单链多核苷酸片段，并使该片段与含有85个核酸的合成互补片段杂交，以获得含有5个核苷酸的突出端。接着可以类似方式合成另一个片段，其对应链具有一个含5个核苷酸的突出端。当使上述两个部分杂交时，该“粘性”末端可确保正确连接。通过该方法可完全地体外合成本发明所述的完整多核苷酸。本发明还包括与SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示序列或其变体互补和/或对应的寡核苷酸探针和引物。这种寡核苷酸探针和引物与目标多核苷酸的某个部分基本互补。如果寡核苷酸探针或引物或其互补序列被包含在SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示任意序列或其变体当中，则该寡核苷酸探针或引物被描述为与本发明包括SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示任意序列或其变体在内的多核苷酸“对应”。当两条单链之一的核苷酸被最优化排列并与另一条链的核苷酸作比较时被发现其具有适当的核苷酸插入和/或缺失，可与另一条链中至少80％、优选至少90％-95％、更优选至少98％-100％的核苷酸配对，则这两条单链序列被认为基本互补。可选地，当第一条DNA链可在严格杂交条件下选择性地与第二条DNA链杂交时，便说明存在基本互补性。在特定实施方案中，所述寡核苷酸探针和/或引物含有至少大约6个相邻残基，更优选至少大约10个相邻残基，最优选至少大约20个相邻残基与本发明所述多核苷酸序列互补。本发明所述探针和引物的长度可能为大约8-100个碱基对长，优选大约10-50个碱基对长，更优选大约15-40个碱基对长。利用本领域熟知的方法并考虑DNA-DNA杂交严格性、退火和解链温度、环形成的可能性以及本领域熟知的其它因素，便可容易地筛选探针。由CSHLPressColdSpringHarbor，NY，1995出版Dieffenbach和Dyksler所著的PCRPrimeralaboratorymanual公开了设计PCR引物的优选技术。适用于设计探针，尤其是设计PCR引物的软件程序可获自PremierBiosoftInternational，3786CorinaWay，PaloAlto，CA94303-4504。本发明所述分离多核苷酸还可被应用在基因组作图、物理作图和基因的定位克隆中。如SEQIDNOS1-12、16-22、46-47和59所示的多核苷酸分离自cDNA克隆，并代表了在该cDNA制备所来源组织内表达的序列。对基因组DNA和异种DNA的鉴定可通过标准DNA/DNA杂交技术在适当的严格性条件下以多核苷酸序列的全部或部分作为探针筛选合适文库而得以实现。可选地，可采用利用了基于已知基因组DNA、cDNA和蛋白质序列设计的寡核苷酸引物所进行的PCR技术，以扩增和鉴定基因组和cDNA序列。本发明的另一个方面提供了由上述多核苷酸编码的分离多肽。本文所用术语“多肽”包括任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中的氨基酸残基通过共价肽键连接。本文所用术语“由多核苷酸编码的多肽”包括由具有本文所提供的一部分分离多核苷酸序列的多核苷酸所编码的多肽。在特定实施方案中，本发明所述多肽包括选自SEQIDNO27-45、48-49和60的氨基酸序列及其变体。因此，本发明的相关方面提供了包括特定序列的变异多肽，该特定序列与SEQIDNO27-45、48-49和60所示序列或其功能片段具有至少75％、80％、90％、95％或98％同一性。本发明所述多核苷酸和多肽与已知参与了生长调节途径的下列多肽的相似性已获得证实。本文所用术语“细胞周期调节物”和“细胞周期调节物”通常指可调节细胞大小和/或细胞增殖的多核苷酸序列，而不考虑它们是否在“细胞分裂周期”、“核内再复制周期”或相关生长调节途径内具有功能。表1通过与EMBL核苷酸序列数据库和SwissProt蛋白质序列数据库中的序列进行比对便可部分地确定多肽序列。图9-27所示保守结构域是于2001年11月6日利用InterProScan软件Releasev3.1鉴定的。目前的InterPro数据库合并了PROSITE、PRINTS、Pfam、ProDom、SMART和TIGRFAMs数据库。InterPro数据以XML格式分布，可免费获得，版权属于InterProConsortium。本发明所述多肽可通过重组法制备，即将编码该多肽的本发明多核苷酸序列插入表达载体中，并使其在合适的宿主内表达该多肽。可应用本领域技术人员已知的多种表达载体中的任意一种。表达可在经由特定表达载体转化或转染的任意合适宿主细胞内实现，所述特定表达载体含有编码重组多肽的多核苷酸分子。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高等真核细胞。优选应用的宿主细胞为植物、大肠杆菌、昆虫、酵母或哺乳动物细胞系，诸如COS或CHO。以该方式表达的多核苷酸序列可编码天然存在的多肽或其部分，或它们的其它变体。可通过本领域已知的多种试验方法测定被表达多肽的生物学活性。这种多肽还可被用于激发抗体，分离相应的相互作用蛋白或其它化合物和定量确定相互作用蛋白或其它化合物的水平。本发明的相关方面提供了至少包括特定多肽的功能部分的多肽，所述特定多肽具有选自SEQIDNO27-45、48-49和60及它们的变体的氨基酸序列。本文所用多肽的“功能部分”指介导该多肽的生物学功能所必不可少的部分，诸如例如，蛋白质相互作用所需的结合部位、酶(例如GTPase或激酶)的活性部位、保守的蛋白质识别结构域，诸如本申请的表1和图9-27所示的结构域等。多肽的功能部分可能是本领域已知的，或者可由本领域技术人员利用本领域已知的方法鉴定。这种方法包括对突变的遗传分析；体外诱变编码所述多肽的多核苷酸序列，并接着分析该突变序列在植物内的表达；利用本领域技术人员熟知的体外试验方法检验多肽片段或突变多肽是否保留生物学活性。本发明所述多肽的若干部分及其它变体可通过合成或重组方法生成。所含氨基酸少于大约100个，通常少于大约50个的合成多肽可通过本领域技术人员熟知的技术生成。例如，可利用任意一种商业可提供的固相技术，诸如Merrifield固相合成法合成上述多肽，其中氨基酸是被序贯地添加至逐渐变长的氨基酸链中。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。自动合成多肽所用的设备可通过商业渠道从诸如PerkinElmer/AppliedBiosystems，Inc.(FosterCity，California)的供应商获得，并可根据生产商的说明书操作。天然多肽的变体可通过标准诱变技术制备，诸如寡核苷酸指导的位点特异性诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492，1985)。DNA序列的若干区域还可通过标准技术除去，以助于制备钝端多肽。本文所用术语“变体”包括与特定序列不同之处在于缺失、置换或加入了一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸序列。变体可能是天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。变异序列(多核苷酸或多肽)优选地与本发明所述序列具有至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少90％，还要更优选为至少95％和最优选为至少98％的同一性。同一性百分比是通过下述方法确定的，即如下所述排列待比对的两个序列，确定被排列部分的一致残基数，并用本发明所述(提问)序列的总残基数除该数，结果乘以100。其它详细内容参见下文的方法概述。与序列如SEQIDNO1-12、16-22、46-47、59、27-45、48-49和60所示的多核苷酸或多肽具有特定百分比同一性的多核苷酸和多肽由此与前者具有了高度的序列相似性。变异多核苷酸和多肽优选地具有与本发明所述多核苷酸和多肽序列一样的其它结构和/或功能特征。例如，与本发明所述多核苷酸具有特定程度的同一性或能够与之杂交的多核苷酸优选地还具有下述至少一种特征(1)可读框或部分可读框编码具有与所述多肽或其功能部分基本相同的功能特性的多肽或其功能部分，其编码核苷酸如SEQIDNO.1-12、16-22、46-47和59所示；或者(2)它们编码具有共有的可鉴定保守结构域的多肽。根据一种实施方案，与本发明所述多核苷酸和多肽二者之一有关的“变异”多核苷酸和多肽优选地包括所含核苷酸或氨基酸数等同或少于本发明多核苷酸或多肽所含核苷酸或氨基酸数，且与本发明多核苷酸或多肽相比时，E值为0.01或小于该值的序列。即变异多核苷酸或多肽的序列与本发明多核苷酸或多肽序列至少有99％的相关可能性，利用被设定为默认参数的BLASTN或BLASTX算法所测E值为0.01或小于该值。根据一种优选实施方案，变异多核苷酸的序列所含核酸数等同或少于本发明多核苷酸所含核酸数，二者至少有99％的相关可能性，利用被设定为默认参数的BLASTN算法所测E值为0.01或小于该值。同样根据一种优选实施方案，变异多肽的序列所含氨基酸数等同或少于本发明多肽所含氨基酸数，二者至少有99％的相关可能性，利用被设定为默认参数的BLASTN算法所测E值为0.01或小于该值。本发明还包括因遗传密码差异而与本文公开序列不同，但却编码与本发明多核苷酸所编码多肽具有相似生物学活性的多肽的变异多核苷酸，此外，本发明还设想并包括了具有因缺失和/或插入长度小于总序列长度10％的片段而与SEQIDNO1-12、16-22、46-47和59所示多核苷酸序列不同的序列或其互补序列、反向互补序列或反向序列的多核苷酸。同样，本发明也设想并包括了具有因置换、插入和/或缺失长度小于总序列长度10％的氨基酸片段而与SEQIDNO27-45、48-49和60所示多肽序列不同的序列的多肽，从而提供了在开花途径中具有活性的变异多肽。本发明的另一个方面提供了在5’-3’方向上包括基因启动子序列、编码本发明多肽至少一个功能部分的可读框以及基因终止序列的重组遗传构建体。该可读框可以有义或反义方向定向。在应用上，当希望提高酶活性时，可以有义方向将该可读框插入所述构建体内，从而使该构建体转化的目标生物可增加所述基因的拷贝数并从而增加酶量。当希望负调节酶活性时，则以反义方向将该可读框插入所述构建体内，以使所述多核苷酸转录生成的RNA与内源mRNA序列互补。这将反过来导致所述基因的拷贝数减少，并由此减少酶量。可选地，可通过将合适的序列或子序列(例如DNA或RNA)插入核酶构建体中，以实现调节。本发明还提供了含有编码用于本发明多肽的基因的非编码区或与其互补核苷酸序列，以及基因启动子序列和基因终止序列的遗传构建体。本文所用术语“非编码区”包括未翻译的转录序列以及在已翻译序列或可读框的5’或3’大约2000个碱基对范围内的非转录序列。可被有效应用在本发明构建体中的非编码区实例包括内含子和5’-非编码前导序列。用这种遗传构建体转化目标植物可通过共抑制过程，以与例如Napolietal.，PlantCell2279-290，1990和deCarvalhoNiebeletal.，PlantCell7347-358，1995所述方法类似的方式减少该植物合成的酶量。本发明所述遗传构建体进一步包括与待转录多核苷酸可操作连接并控制所述基因表达的基因启动子序列和基因终止序列。该基因启动子序列通常位于待转录多核苷酸5’末端，被用于起动该多核苷酸的转录。基因启动子序列通常位于基因的5’非编码区，但也可能出现在内含子中(Luehrsen，Mol.Gen.Genet.22581-93，1991)。当该构建体包括有义方向的可读框时，基因启动子序列还起动该可读框的翻译。对含有反义方向的可读框或非编码区的遗传构建体而言，基因启动子序列则仅由具有RNA聚合酶结合部位的转录起始部位组成。可被有效应用在本发明遗传构建体中的多种基因启动子序列是本领域熟知的。该启动子基因序列以及基因终止序列可能是目标植物宿主内生的，倘若该启动子在该目标宿主内具有功能性，则可能是外生的。例如，该启动子和终止序列可能来源自其它植物物种、植物病毒、细菌质粒等。基因启动子和终止序列优选地来源于本发明所述序列本身。影响启动子的选择的因素包括所述构建体的预期组织特异性，以及转录和翻译的时间。例如，诸如35S花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子的组成型启动子可影响所述酶在所述植物各个部分的活性。利用组织特异性启动子可仅使目标组织内生成预期的有义或反义RNA。利用具有诱导型基因启动子序列的遗传构建体时，可通过诸如光、热、缺氧应力、改变营养条件等外部物理或化学刺激调节RNA聚合酶结合和起动的速率。时间调节型启动子可被用于影响对被转化细胞发育期间某一特定时间RNA聚合酶结合和起动速率的调节。位于待转录多核苷酸3’的基因终止序列可能与基因启动子序列来源于相同基因，或者可能来源于不同基因。本领域已知的许多基因终止序列均可被有效应用在本发明中，诸如根癌农杆菌胭脂碱合酶基因的3’末端。不过，优选基因终止序列来源于最初的基因或待转化的目标物种。本发明所述构建体还可包括诸如转录和翻译增强子的其它调节序列。本发明所述遗传构建体还可能含有在植物细胞内有效的选择标记，以助于检测含有本发明构建体的转化细胞。这种标记是本领域熟知的，典型地赋予了一种或多种毒素抗性。这种标记的一个实例是NPTII基因，其表达可导致产生卡那霉素或潮霉素抗性，而中等浓度的这两种抗生素通常对植物细胞具有毒性(Rogersetal.，inWeissbachAandH，eds.，MethodsforPlantMolecularBiology，AcademicPressInc.SanDiego，CA，1988)。可选地，可通过本领域熟知的其它技术，诸如DNA和蛋白质印迹法确定转化细胞内是否存在预期构建体。使本发明所述遗传构建体各组分可操作连接的技术是本领域熟知的，包括利用含有一个或多个限制性内切核酸酶部位的合成接头，方法如例如由CSHLPressColdSpringHarbor，NY，1989出版Sambrook等人所著的Molecularcloningalaboratorymanual所述方法。本发明所述遗传构建体可与具有至少一个复制系统，例如大肠杆菌的载体连接，从而可以克隆每次操纵所获的构建体并对其测序，以及确定该操纵的正确性。下文的方法概述部分提供了其它方法的具体内容和参考文献。靶细胞内的多核苷酸序列表达可能取决于启动子序列的选择，或者取决于对该多核苷酸将被整合进靶生物基因组内的功能拷贝数或整合部位的选择。目标植物可由本发明所述的一种以上构建体转化，以通过影响一种以上多肽的活性、一个以上组织内的多肽活性或一个以上表达时间的多肽活性，调节该植物的生长、构造、生物量和化学组成。同样，可在构建体内装配一个以上编码用于本发明多核苷酸所编码多肽的可读框或编码用于这种多肽的基因的一个以上非编码区。本发明所述多核苷酸还可与其它已知编码参与多种代谢和生物合成途径的多肽的序列结合应用。通过该方式便可调节一个以上的途径，从而获得具有变更表型的植物。可将DNA构建体稳定整合进目标植物基因组内的技术是本领域熟知的，包括根癌农杆菌介导的导入、电穿孔、原生质体融合、生殖器官内注射、未成熟胚胎内注射、高速发射物导入等。技术的选择取决于待转化的目标植物。例如，双子叶植物和某些单子叶植物和裸子植物可通过农杆菌Ti质粒技术转化，方法如例如Bevan，NucleicAcidRes.128711-8721，1984所述。适合导入本发明所述DNA构建体的目标包括诸如叶组织、原形成层、形成层和木质部的组织，散细胞、原生质体、种子、胚胎、分生组织区；子叶、下胚轴等。在某些优选实施方案中，转化细胞类型或组织参与了木材形成、植株生殖、开花、贮藏器官的形成或果实生成。可有效应用于本发明方法的转化技术包括Ellisetal.，PlantCellReports，816-20，1989，Wilsonetal.，PlantCellReports7704-707，1989；Tautorusetal.，Theor.Appl.Genet.78531-536，1989和Ishidaetal.，Nat.Biotechnol.14745-750，1996所公开的那些方法。可利用本发明构建体转化的植物包括单子叶被子植物(例如，草、玉米、谷物、燕麦、小麦和大麦)和双子叶被子植物(例如，拟南芥属、烟草、豆科植物、苜蓿、栎、桉树、槭树)，以及裸子植物(例如，欧洲赤松；参见Aronen，FinnishForestRes.Papers，Vol.595，1996)、白云杉(Ellisetal.，Biotechnology1184-89，1993)、落叶松属(Huangetal.，InVitroCell27201-207，1991)和桉树(U.S.ProvisionalPatentApplicationNo.60/508,944，被完整引入本文作为参考)。还可参考下文方法概述部分公开的参考文献。在一种优选实施方案中，本发明所述遗传构建体被用于转化乔木、灌木和木本植物。本文所述木本植物的定义为茎可存活数年并每年通过增加木质组织而直径增大的乔木或灌木。该木本植物优选地选自桉树和松树种，最优选地选自大叶桉和辐射松。其它优选种包括杨树、甘蔗、饲料草和柳树。可用本发明所述遗传构建体有效转化的其它种包括但不限于诸如北美短叶松、土耳其松、加勒比松、沙松、扭叶松、大果松、萌芽松、Pinuseldarica、Pinusellioti、黑材松、糖松、加州山松、欧洲黑松、Pinuspalustrus、海岸松、美国黄松、北美赤松、刚松、晚松、北美白松、欧洲赤松、火炬松、矮松的松树；诸如温哥华冷杉、香脂冷杉、科罗拉多冷杉、北美冷杉、毛果冷杉、加州红冷杉、壮丽冷杉、Chamaecyparislawsoniona、阿拉斯加花柏、国尖叶扁柏、铅笔柏、欧洲落叶松、美洲落叶松、日本落叶松、西部落叶松、西伯利亚落叶松、翠柏、挪威云杉、恩氏云杉、白云杉、黑云杉、蓝叶云杉、红云杉、西加云杉、花旗松、美洲杉、北美红杉、落羽杉、加拿大铁杉、西部铁杉、黑铁杉、北美香柏、北美乔柏的其它裸子植物；以及诸如白桉、Eucalyptusbancroftii、Eucalyptusbotyroides、苹果桉、Eucalyptuscalophylla、赤桉、柠檬桉、Eucalyptuscladocalyx、Eucalyptuscoccifera、Eucalyptuscurtisii、Eucalyptusdalrympleana、剥皮桉、Eucalyptusdelagatensis、红桉、邓恩桉、红花桉、蓝桉、Eucalyptusgomphocephala、古尼桉、Eucalyptushenryi、银顶纤皮桉、Eucalyptusmacarthurii、Eucalyptusmacrorhyncha、斑皮桉、红柳桉、Eucalyptusmegacarpa、蜜味桉、Eucalyptusnicholii、亮果桉、Eucalyptusnova-anglica、斜叶桉、Eucalyptusobtusiflora、Eucalyptusoreades、Eucalyptuspauciflora、多苞叶桉、王桉、树脂桉、大叶桉、野桉、柳叶桉、Eucalyptussideroxylon、Eucalyptusstuartiana、细叶桉、毛叶桉、Eucalyptusurnigera、尾叶桉、多枝桉、Eucalyptusviridis、Eucalyptuswandoo和Eucalyptusyoumanni的桉树；以及上述任意树种的杂种。细胞转化结束后，便可借助于诸如上述卡那霉素抗性标记的标记筛选基因组内整合有本发明遗传构建体的细胞。接着可利用本领域熟知的技术在合适的培养基中培养转基因细胞，使其再生成完整植株。在原生质体情况中，细胞壁可以在合适的渗透条件下形成。在种子或胚胎情况中，则应用了合适的萌发或愈痂引发培养基对外植体而言，采用的是合适的再生培养基。许多物种的植物的再生方法已建立。利用本领域熟知的方法可使由上所获的转化植物通过有性或无性方式生殖，可获得连续世代的转基因植物。通过可转录后操作阻断被靶定基因的产物合成的方法，诸如RNA干扰(RNAi)和静息作用，本发明所述多核苷酸还可被用于特异性的抑制基因表达。有关基因抑制技术的综述可参考Science，2881370-1372，2000。WO99/49029和WO99/53050也提供了代表性的基因沉默方法。转录后基因沉默是通过可使序列相关基因的转录物快速降解的序列特异性RNA降解过程实现的。有研究证据表明双链RNA可充当序列特异性基因沉默的介质(参见例如Montgomery和Fire在TrendsinGenetics，14255-258，1998中的综述)。可生成具有自身互补区的转录物的基因构建体在基因沉默方面尤为有效。该转录后基因沉默途径的独特特征在于沉默并不局限于其开始所在的细胞内。该基因沉默影响可被扩散至生物的其它部分，甚至通过种系被传递若干世代。本发明所述多核苷酸可被用于生成可通过本领域已知的常规方法被送递至植物各组织的基因沉默构建体和/或基因特异性自身互补性RNA序列。在遗传构建体内，可将具有供体和受体剪接部位的有义和反义序列以正确的剪接方向置入位于内含子序列两侧的特定区域内，使内含子序列可以在转录加工期间被除去，并使有义和反义序列以及剪接结合序列可结合在一起形成双链RNA。可选地，可应用不同长度的间隔序列分隔该构建体内序列的自身互补区。该基因构建体转录加工期间剪接剔除了内含子序列，使有义和反义序列以及剪接结合序列可结合形成双链RNA。特定的核糖核酸酶与该双链RNA结合并将其裂解，从而启动了一连串事件，导致了特定mRNA基因序列的降解和特定基因的沉默。一种优选实施方案中的基因沉默RNA序列构建体包括串联的反向或同向重复序列。含有本发明多核苷酸或其部分的基因沉默构建体有助于构建具有目标表型的基因修饰植物和表征基因(例如在高通量筛选序列时)，以及研究它们在完整生物内的功能。本发明的另一个方面提供了通过将本文鉴定的分离多核苷酸序列作为细胞周期调节物编码序列导入所述植物并使其在该植物内表达，进而改造植物表型的方法。这些方法包括用一个或多个含有选自SEQIDNO.1-13、16-23、26、46、47和59所示序列中的一个或多个多核苷酸序列的遗传构建体转化上述植物，并使该序列在组成型或可调型启动子(例如组织或器官特异性启动子或诱导型启动子)调控下表达。在某些优选实施方案中，被转化细胞类型或组织参与了木材形成、植物生殖、贮藏器官形成或果实生成。本发明的相关方面提供了用于调节植物内的细胞分裂周期的方法，该方法包括将含有本发明所述一种或多种多核苷酸序列或本发明所述多核苷酸与已知多核苷酸的组合的遗传构建体稳定整合进目标植物的基因组内。一种优选实施方案的构建体含有细胞周期调节物，与未改良的植物(即未经该细胞周期调节物转基因转化的植物)相比，该细胞周期调节物被表达在植物中时，可改变整株植物，或者尤其是其各组织或器官的细胞分裂速率和/或程度。在另一种优选实施方案中，多个细胞周期基因被同时表达，从而使细胞增殖效果优于表达单个基因所实现的效果。具体而言，我们的设想是，与编码相同多蛋白复合体中一种蛋白的基因的表达相比，编码该复合体中若干蛋白(例如细胞周期蛋白和CDK、E2F和DP、Cdc18/Cdc16和Cdt1等)的两个或多个基因的过量表达应该能够使细胞分裂的增强水平更高，从而更深度地促进植物生长。不希望受限于理论的话，我们猜测如果该基因编码的蛋白质构成了多蛋白复合体的一部分，则该基因单独地过量表达可能不会促进细胞分裂，除非该表达蛋白的内源水平是形成功能复合体的限制因素。因此，在某些情况下，相互作用蛋白的水平限制了上述复合体的形成量以及细胞分裂的增强程度。多蛋白复合体是细胞周期调节的组成部分。细胞周期蛋白之间的相互作用数目和类型可能很多(参见例如，Kohn，MolecularBiologyoftheCell102703-2734(1999)，且单个细胞周期蛋白的分子相互作用可能是相互竞争、协同或独立的。多蛋白复合体的形成、稳定性和活性受制于多个水平的调节(例如，基因转录、共价蛋白修饰、受控蛋白质降解、空间和时间定位及其它过程(参见例如Pines，NatureCellBiology1E73-79(1999))。复合体可能以可选状态存在，即具有不同功能并可通过共价修饰相互转换。对侯选基因组合的功能测试可通过分析其在植物细胞和组织内的稳定或瞬时表达而得以进行。可利用细胞和原生质体悬液，或愈痂培养物或由野生型植物和可表达一个或若干目标基因的转化植物的组织制备获得的切片评估该基因组合对细胞周期进展的影响。分析细胞分裂的方法包括测定有丝分裂指数、DNA合成和分析生长比率。这些方法已被公开并为本领域技术人员熟知(参见例如，由IRLPressatOxfordUniversityPress，2995出版G.P.Studzinski(编辑)的CellGrowthandApoptosis，APracticalApproach；R.Wieder在由OxfordUniversityPress，1999出版G.P.Studzinski(编辑)的CellGrowth，DifferentiationandSenescence中的第1章；以及Jacqmardetal.，Ann.Botany91571-576(2003)和其中所引用的参考文献)。细胞周期基因可能有助于提高植物转化效率和使转化植物在无激素培养基中再生。不同物种细胞周期蛋白基因的表达对枝条在无激素培养基中的再生效率的影响是在经由下列细胞周期基因之一，即拟南芥属细胞周期蛋白D4；1(下文参见AMP1)、AtCycD3；1或AtCycD2；1转化的本塞姆氏烟草叶片外植体中测试的。该外植体被共培养后，被置于含有卡那霉素(50mg/l)而不含激素的培养基中。对照外植体则未被共培养，被置于不含卡那霉素和激素的培养基中。下文概述的预实验表明共培养后40天，约30％的外植体在无激素培养基中再生出枝条，而在无激素培养基中再生出枝条的对照外植体仅有一个。这些结果支持了下述见解，即这些基因及它们的直向同源基因可被用作转化细胞的阳性选择标记，并可避免或减少植物在培养中再生期间对激素的需要。我们的方法与在玉米转化系统中利用玉米CycD的方法不同。据报道，在该系统中，玉米CycD基因的过量表达提高了转化效率，并可在缺乏其它选择标记的条件下被用于鉴定转基因愈伤组织(参见USPatentNo.6,518,487)。在玉米情况中，是以体细胞胚胎发生愈伤组织细胞作为转化所用的初始材料。在筛选阶段，转化细胞只需分裂(增殖)以形成可与旧的非转化愈伤组织细胞区分开来的新愈伤组织。接着将该新愈伤组织转移至适合胚胎发生和形成植株的新培养基。许多植物物种尚无可靠的体细胞胚胎发生系统。大部分植物转化系统应用的是器官发生再生系统。在本塞姆氏烟草和桉树的情况中，是以叶片组织作为转化所用的初始材料。在筛选阶段，转化细胞必需分裂并分化为适合再生的枝条原基。在器官发生再生系统中，应通过使AMP1在赤霉素(GA)存在条件下所培养的细胞内过量表达，以提高枝条的转化效率并促进其再生。AMP1转化的细胞具有高度的分裂能力，但扩增不是十分好。可采用GA促进细胞扩增。虽然GA本身未必促进未转化细胞的再生，但其结合AMP1在GA存在条件下的过量表达却可使AMP1转化细胞同时具有细胞分裂和分化能力并再生出枝条。本发明包括利用已知的植物Pin1基因及其新的树同源物，诸如图1所示的egfb021948，即巨桉Pin1基因(SEQIDNO46)，以及prhg006224，即辐射松来源的Pin1-相关基因(SEQIDNO47)改良花的发育、消除花粉形成并在保守了花发育模式的树及其它植物物种内产生具有重要商业价值的其它性状的方法。目前尚不清楚植物Pin1同源物的特定生物学作用，也尚无与它们在转基因修饰植物方面的可能用途有关的报道。Yao等人的研究显示苹果和拟南芥属来源的Pin1同源物(MdPin1和AtPin1)可拯救酿酒酵母中温度敏感(ts)Pin1同源物的致死有丝分裂表型，他们对MdPin1转录物的RNA印迹分析则显示在苹果果实生长期间以及在分裂中的苹果悬浮细胞培养物中，MdPin1基因转录与细胞分裂存在相关性，基于上述研究结果和RNA印迹分析结果，Yao等人认为动物的植物Pin1同源物和酵母Pin1基因可充当细胞周期调节物(Yaoetal.，J.Biol.Chem.27613571-13523(2001))。就我们所知，目前尚无与其它植物中的Pin1表达影响有关的报道。下文实施例3所述试验结果表明AtPin1可与AP3相互作用，也可能与其它基因产物相互作用，从而调控了花瓣和雄蕊发育(实施例3)。下表2和3分别显示了松树和桉树氨基酸和核苷酸序列与AtPin1及其它若干已知Pin1序列的％同一性。这些序列被认为可被用于改良花发育、消除花粉形成，并在保守了花发育模式的树及其它植物物种内产生具有重要商业价值的其它性状。业已鉴定了在拟南芥属的花瓣和雄蕊中表达的AP3树启动子同源物(参见例如MolecularBiologyofWoodyPlants(S.M.JainandS.C.Minocha(Eds.)，vol.1，135-153，KluwerAcademicPublishers，2000))。这些启动子可能有助于上述松树和桉树Pin1多核苷酸序列及它们的变体在森林植物物种中的转基因表达，从而获得不能产生花粉的树种。对种植树木的繁殖不育性的改造，例如在森林生物技术中具有重要的实际效用，例如，可避免将转基因导入天然树木群体，并且大体符合遗传修饰调节方针。表2植物Pin1同源物的％氨墓酸序列同一性表3植物Pin1同源物编码区的％核苷酸序列同一性预期可通过利用组织特异性启动子使AtPin1基因在特定植物器官和组织内过量表达，从而揭示该基因的其它功能。参见例如，方法概述。下文实施例4所述试验结果表明AtPin1蛋白对植物细胞存活而言必不可少。当采用RNAi构建体转化拟南芥属植物时，未获得转基因植物。因此，AtPin1表达的剔除似乎是致死原因。令人惊讶的是，在本塞姆氏烟草植物内进行类似试验时，却获得了转基因植物，且其所显示的表型与减少的细胞分裂相符。即与正常植物相比，该植物非常小或者具有中等大小，且叶片非常小(图3)。由于AtPin1基因与本塞姆氏烟草中的Pin1基因(NbPin1)并非100％同源，AtPin1RNAi构建体在转基因植物内的表达可能部分地负调节了能使植物细胞存活的NbPin1表达。尽管尚未克隆出NbPin1基因，但基于许多植物物种，包括与本塞姆氏烟草紧密相关的番茄在内的植物来源的诸多Pin1基因中的序列同源性，可估计NbPin1和AtPin1基因的同源性范围是70-80％(表3)。本发明的另一个方面提供了通过在植物中表达如本文SEQIDNO.13所示的细胞周期调节物序列的基因组片段，以获得具有新生长表型的植物的方法。正如之前所论述的，细胞分裂与植物发育之间的关系复杂且尚未被人了解。在试验之前通常无法预测已知细胞周期调节物的表达对细胞分裂、特定组织和器官的生长和形态学的影响，但这一认识对获得具有新型或改良特征的遗传修饰植物而言必不可少。下文所述试验是利用含有编码拟南芥属的D型细胞周期蛋白(AtCycD4；1)的完整ORF的基因组DNA片段进行的。DeVeylder等人分离了该细胞周期蛋白的cDNA，他们通过原位杂交实验发现该基因是在维管组织发育、胚胎发生和侧根原基形成期间表达的(DeVeylderetal.，Planta208453-462(1999)和InternationalPatentApplicationWO99/22002)。这几位研究者认为该表达与根部维管组织的关系可能与形成层的活性相关。Schnittger等人利用cDNA片段和毛状体特异性启动子在核内再复制中的拟南芥属毛状体内过量表达AtCycD3；1和AtCycD4；1，却意外发现AtCycD3；1表达生成了多细胞毛状体，而表达AtCycD4；1的毛状体则具有正常形态(Schnittgeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA996410-6415(2002))。此处所述的研究是通过用序列如序列表中SEQIDNO13所示的基因组DNA片段转化拟南芥植物而得以进行的。将该片段以有义方向克隆进pART7的35S启动子和OCS终止子之间，再将该表达构建体克隆进二元载体pART27中，用于转化根癌农杆菌。由农杆菌介导的对拟南芥的转化获得了可过量表达细胞周期蛋白D4；1分子的转基因植物。下文实施例6和7提供了其它方法的具体内容。由于该转基因植物在细胞分裂方面的表现显著加强，我们将该基因称为AMPLIO1(AMP1)，并将由SEQIDNO13所示序列转化的植物称为AMP1转基因植物。所有AMP1T1转基因植物所具有的下胚轴比经由不含目标基因的空载体pART27转化的对照植物的下胚轴至少长2-3倍(图4)。将下胚轴完整封固在显微镜载玻片上，经过甲苯胺蓝染色后利用光学显微镜检查。结果如图5所示。可发现与对照下胚轴相比，AMP1转基因下胚轴含有许多小细胞。从中央维管组织到表皮细胞层，对照下胚轴具有8个细胞层，而AMP1下胚轴具有14个细胞层。AMP1下胚轴细胞的长度约为对照细胞的10％。根据对照与AMP1细胞的大小和径向细胞层数的对比结果，我们估计AMP1下胚轴所含细胞比对照下胚轴至少多50倍。该研究还检查了AMP1转基因植物其它器官中的细胞数和细胞大小，并与对照植物器官进行对比。AMP1转基因叶片所含表皮细胞和气孔比对照叶片多。尽管与对照植物相比，AMP1转基因植物的气孔大小未变，但其表皮细胞远小于对照植物的表皮细胞(图6)。用0.1％甲苯胺蓝和1μg/lDAPI(4’，6-二脒-2-苯基吲哚)将AMP1转基因植物和对照植物来源的根部染色。发现与对照植物相比，AMP1转基因植物的根尖和维管组织所含的细胞更多更小。与Schnittgeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA996410-6415(2002)的报道结果相比，我们惊讶地发现AMP1转基因植物的毛状体由多个(多于10个)细胞和核组成。对照植物的毛状体则为单细胞，且每个毛状体仅含一个核(图7)。我们的研究结果与Schnittger等人的报道结果之间的差异可能是双方所用序列(基因组和cDNA)的差异造成的。利用Genesis研发的农杆菌介导型转化系统还可将上述AMP1过量表达构建体转移进巨桉植株内。再生出12株独立转化植物。这些植物表现出了若干与商业应用有关的非常引人关注的表型。首先，比经由空构建体pART69转化的对照植物相比，它们的根部生成时间早且根较长(图8A)。其次，在土壤中，AMP1植物比对照植物生长快且高(Fig8B)。最后，AMP1植物的叶表皮细胞层所含细胞远小于对照植物的叶表皮细胞层细胞(图8C)。实施例6所述试验和图28所示结果显示，与对照植物相比，AMP1桉树属植物的高度和茎直径增加了。用本塞姆氏烟草植物进行的其它实验显示当AMP1或AtCycD2；1被表达在成熟植物的形成层中时，新木质部细胞继续生成且径向细胞数增加。与形成层接近的木质部纤维细胞形成了次生细胞壁。该纤维细胞的壁厚度随着细胞数增加而保持不变，但木质部纤维的直径则随着细胞腔的缩小而减小。纤维细胞长度仅有少量减小，平均减量约为15％。茎和叶形态大体无变化。通过对比发现GUS对照植物的细胞数和长度无变化(数据未显示)。在组成型表达AMP1的植物中，细胞数的增加伴随着细胞长度的大幅减小，并可观测到植物形态的大体变化。这些结果表明AMP1及其相关的D型细胞周期蛋白，诸如本文所公开的来源于松树、桉树和葫芦的那些AMP1相关D型细胞周期蛋白被表达在木材形成组织中时，可能有助于乔木和灌木种提高生物量、木材密度和木材强度。AMP1及其相关D型细胞周期蛋白与经过适当筛选所获的组织特异性和/或诱导型启动子一起可能有助于选择性地增强其它植物组织和特定发育阶段的细胞分裂。在本发明的一种优选实施方案中，被本文鉴定为AMP1和其相关D型细胞周期蛋白的序列被选择性地表达在参与了特定植物发育过程，例如木材发育或花发育的细胞类型或组织中。这些序列还可被用于特异性地增加诸如乔木、灌木、甘蔗、草和谷类植物中维管和非维管组织的细胞数或细胞密度。通过提高那里的细胞密度或数目，可使易转化为纸浆和纸、乙醇或其它具有商业应用价值的生物聚合物的细胞壁产量增如。本发明的另一个方面还提供了使在目标植物组织内起作用的生物合成途径的产物产量提高的方法。该方法包括用本文公开的一个或多个多核苷酸序列稳定转化所述植物的基因组。这些序列的表达优选地受特定启动子调控，该启动子选择性地在上述途径起作用的组织内有效。一种优选实施方案是用表达可导致细胞数倍增的多核苷酸序列和编码参与所述生物合成途径的转录调节物或酶的序列共转化所述植物。该转录调节物或酶的表达水平的提高优选地将提高所述途径的流通量，从而提高该途径的产物产量。在一种特定优选实施方案中，CycD多核苷酸序列与编码参与木材发育的酶的序列一起被表达在植物的木质部中。例如，该实施方案可采用纤维素合酶基因，优选CesA基因，以使木本植物的高结晶度纤维素生成量增加(参见下文实施例7)。参与木材组分生成的酶的非限制性实例包括纤维素合酶、己糖焦磷酸化酶、蔗糖合酶(纤维素生产)；β葡糖苷酶、己糖焦磷酸化酶、蔗糖磷酸合酶、木葡聚糖转葡糖苷酶、阿拉伯聚糖合酶、木聚糖合酶(半纤维素生产)；4-香豆酸辅酶A连接酶、肉桂酰辅酶A还原酶、松柏苷β-葡糖苷酶、松柏醇脱氢酶、甘露糖醇脱氢酶、松柏醇葡糖基转移酶、漆酶、阿魏酸5-单加氧酶、对-香豆酸3-单加氧酶、反-肉桂酸4-单加氧酶、咖啡酸O-甲基转移酶、咖啡酰辅酶AO-甲基转移酶、过氧化物酶(木质素生产)；己糖焦磷酸化酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶(果胶生产)；α淀粉酶、己糖焦磷酸化酶、淀粉分支酶、淀粉合酶、苯丙氨酸氨裂解酶(淀粉生产)；萜类合酶、氧化鲨烯(萜类化合物生产)；dirigent蛋白、苹果曲霉素、阿拉伯半乳聚糖、伸展蛋白、yieldin(细胞壁蛋白质)。本发明还提供了通过利用本文所公开方法获得的具有新表型的植物，包括在生长速率、高度、茎直径、下胚轴长度、根部长度和分支方面显示了变化、生物量增加、次生木质部细胞数增加、纤维细胞直径和细胞腔尺寸减小、叶片、莲座、bolts、开花、花器官、长角果以及种子生成方面具有变化的植物。上述多核苷酸序列及其部分除了在植物修饰方面的应用外，还可作为探针和引物，被用于检测和定量上述基因及它们的功能相关变体的表达，以及鉴定和分离在其它植物物种中具有类似功能的基因。这些方法是植物生物
技术领域：
的技术人员熟知的，可在适当的试验条件下进行。下述实施例被用于说明本发明的实施，对权利要求的发明范畴不构成限制。实施例1巨桉、辐射松、多年生黑麦草和葫芦种来源cDNA克隆的分离和表征如下所述从完整幼苗的若干组织、不同发育阶段的叶片、无性芽、花、花芽、根、不同发育阶段的果实、种子、韧皮部、形成层、早期木材、后期木材、成熟木材、营养茎和未成熟木材中构建巨桉、辐射松、多年生黑麦草和葫芦的cDNA表达文库，并进行筛选。采用Chang等人的方法(PlantMolecularBiologyReporter11113-116，1993)并稍作修改，从植物组织中提取mRNA。具体而言，使样品溶于CPC-RNAXB(100mMTris-Cl，pH8.0；25mMEDTA；2.0MNaCl；2％CTAB；2％PVP和0.05％亚精胺*3HCl)，并用配比为24∶1的氯仿∶异戊醇体系提取。用乙醇使mRNA沉淀并利用聚腺苷酸快速mRNA分离试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)纯化总RNA制剂。通过下述方法从纯化mRNA中构建cDNA表达文库，即在逆转录酶合成后利用ZAP快速cDNA合成试剂盒(Stratagene)并根据生产商提供的方法将逆转录酶合成所获cDNA克隆插入λZAP中。利用GigapackII包装提取物(Stratagene)和从5μl连接混合物中取出的1μl样品DNA包装由上所获的cDNAs。利用XL1-BlueMRF’细胞和XLOLR细胞(Stratagene)以及ExAssist辅助噬菌体(Stratagene)对上述文库进行团块切除(Massexcision)。用NZY液体培养基(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)稀释被切离的噬菌粒，倾倒在含有X-gal和异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素琼脂平板上。在被接种平板并被挑出用于DNA小量制备的集落中，99％的集落含有适合测序的插入片段。在含有卡那霉素的NZY液体培养基中培养阳性集落，并通过碱裂解和聚乙二醇(PEG)沉淀的方法纯化cDNA。利用1％琼脂糖凝胶甄别测序模板中的染色体污染。利用TurboCatalyst800仪器(PerkinElmer/AppliedBiosystems，FosterCity，CA)并根据生产商提供的方法制备染料引物序列。利用PerkinElmer/AppliedBiosystemsPrism377测序仪获得阳性集落的DNA序列。对cDNA集落的测序首先从5’末端开始，在某些情况中也可从3’末端开始。某些集落的内部序列是利用亚克隆片段获得的。亚克隆是通过限制酶作图和亚克隆进入pBluescriptIISK+载体的标准方法进行。利用版本为2.2.1[2001年4月13日]且被设定为上述优选参数的BLASTN算法，对上述方法测定的cDNA序列和2004年4月13日的EMBL数据库中的已知序列进行比对。对冗余序列的多重比对结果被用于构建可靠的共有序列。根据本发明所述分离多核苷酸与其它植物物种来源的已知序列之间的相似性，确定其编码特定酶，如上表1所示。利用上述方法，从巨桉文库中分离出如SEQIDNOS1-3、7-10、12和46所示的序列；从辐射松文库中分离出如SEQIDNOS4-6、11和47所示的序列；从笋瓜文库中分离出如SEQIDNOS16、17、19、20和21所示的序列；从黄瓜文库中分离出如SEQIDNO18的序列，从棘瓜文库中分离出如SEQIDNO22所示的序列和从多年生黑麦草文库中分离出如SEQIDNO59所示的序列。图9-20显示了如SEQIDNOS27-38所示氨基酸序列内的结构域位置。这些结构域是于2001年11月6日利用发行版本为v3.1的InterProScan软件确定的。其它结构域是基于之前的出版物鉴定的，可参考附图简述。InterPro数据库合并了PROSITE、PRINTS、Pfam、ProDom、SMART和TIGRFAMs数据库，并还将加入其它数据库。InterPro数据以XML格式分布，可免费获得，版权属于InterProConsortium。欧洲生物信息研究所(EBI)是非赢利学术组织，隶属于欧洲分子生物学实验室(EMBL)WellcomeTrustGenomeCampus，Hinxton，Cambridge，CB101SDUK。实施例2若干基因在拟南芥属植物内过量表达所造成的表型变化将含有完整可读框的cDNA序列克隆进遗传构建体中，使其在拟南芥属植物内组成型表达并对该植物进行表型分析。该ORF序列以有义方向被克隆在组成型启动子(35S或松树超泛素启动子)和OCS终止子之间，以实现该基因的过量表达和异位表达。接着将该启动子-ORF-OCS盒克隆进二元载体pART27中。利用植物内花浸涂转化法(CloughSJandBentA.，花浸涂适用于农杆菌介导的拟南芥转化的简化方法。PlantJ.16735-743(1998))将由上所获的基因构建体转移进拟南芥“Columbia”生态型植株内。将所述GUS报道基因克隆进pART27质粒内，充当阴性对照。该对照质粒被称为pART69。花浸涂后收集T1种子，并将其散布在含有卡那霉素的培养平板上。至少获得12株T1转基因植物，并对它们的各个基因进行分析。典型的是获得24株T1植物并对它们进行分析。利用基本表型系统记录总体形态变化。对经由测试基因转化的转基因植物和经由对照构建体转化的植物(pART27orpART69)的所有发育阶段进行比较。在组织培养平板中培养植物，发芽后一周观测到最早期的变化，包括下胚轴长度、根长度、根分支模式、根毛形态和子叶大小的变化。接着将植物转移至rockwool并在植物生长室中水栽培至成熟。每周监测各阶段的生长速率、植株大小和花性状，并记录观测到的所有变化。如下表所示，观测到的表型可分为两类。第一类，如SEQIDNOs1、4、5、6、9和10所示序列的过量表达获得了根分支增加且下胚轴长的大植株。这些表型可能是细胞分裂和/或细胞扩增增加造成的。诸如这些序列的序列被认为有助于提高植物生长速率和生物量。第二类，如SEQIDNOs.2、3、7、8和11所示序列的过量表达获得了根短小的小植株。与这些变化相关的序列可能编码细胞分裂和细胞扩增的阻抑物。如果是这样，剔除或降低这些基因的表达(例如通过反义或RNAi技术)将可能促进植物生长并提高生物量。表.在过量表达构建体所转化植物内观测到的表型变化汇总实施例3AtPin1在花瓣和雄蕊发育中的作用该实施例所述试验表明植物Pin1同源物可能有助于调控植物的花繁殖。为进行这些试验，制备了含有受AP3启动子调控的拟南芥属AtPin1基因(At2g18040；SEQIDNO23)的有义和反义构建体。采用标准扩增方法和序列如SEQIDNOS24和25所示的引物扩增基因组DNA。将扩增片段克隆进含有用于卡那霉素抗性的nptII基因和GUS报道基因的二元载体pART69中，所述两种基因分别受组成型NOS和MAS启动子调控。该有义构建体被称为pJY602，反义构建体被称为pJY603。通过Clough和Bent的花浸涂转化法将这两种二元载体转移进拟南芥Columbia生态型植物中。32％(42/131)的pJY602转基因系和39％(39/99)的pJY603转基因系在表型上与ap3突变体相似，即花瓣小且象萼片，雄蕊心皮化(图2，B)。用WT植物来源的花粉对这些类ap3植物授粉时，可结出种子，但无人工授粉时则结不出种子。上述类ap3表型似乎是AtPin1基因表达改变造成的，而不是内源AP3启动子的沉默造成的。如果该表型的产生原因为启动子沉默，则35S::AP3应能拯救雄蕊和花瓣发育。进行下述试验，即用含有35S::AP3转基因的纯合植物的花粉对若干转基因系来源的多株T2植物异花授粉。将所获拟南芥属杂交植物植入土壤。杂交所获表型如图2所示。这些杂交植物表现为雄蕊发育接近正常。即花粉囊可生成花粉粒；每朵花的雄蕊数为5-8；萼片发育正常。心皮未充分融合。有时可发现每朵花具有3或4个心皮。这些表型与35S::AP3转基因植物的表型类似。但在这些植物中，大部分植株的花瓣发育仍不正常。其中许多植株的花瓣非常小，多为绿色而不是白色。如果存在白色，则仅出现在小花瓣的尖端。这些花瓣与萼片组合在一起。少部分植株表现了正常花瓣。可能是这些植株由于杂交母体植株并非纯合所造成的分离而缺乏了AP3::AtPin1转基因。可通过PCR分析验证该推断。有关35S::AP3仅可拯救AP3::AtPin1转基因背景中的雄蕊发育，而不拯救花瓣发育的发现说明上述类ap3表型不是启动子沉默造成的，最可能的原因是AtPin1基因表达的变化。拯救雄蕊发育而不拯救花瓣发育可能与AP3启动子在花瓣原基内的强度比在雄蕊原基内的强度高有关(Hi1letal.，1998，Development1251711-1721)。当在转基因芸苔属植物内应用AP3启动子驱动细胞分裂抑制基因(ICK1)时，则仅抑制了花瓣发育，而未抑制雄蕊发育(Zhouetal.，2002，Planta215248-257)。此处公开的结果表明AtPin1可能与AP3相互作用，也可能与其它基因产物相互作用，从而调控了花瓣和雄蕊发育。业已知道人Pin1蛋白可通过与保守Ser(Thr)-Pro部位上的磷酸化丝氨酸或苏氨酸结合从而与特定亚群的有丝分裂特异性蛋白相互作用(Luetal.，1999，Science2831325-1328)。还已知的是在从27个不同物种来源的所有AP3蛋白序列中均存在保守的Ser(Thr)-Pro部位(Krameretal.，1998，Genetics149765-783)。这一信息支持了我们的结果，即AtPin1与AP3的相互作用调控了花瓣和雄蕊发育。AP3的树启动子同源物似乎可跨植物物种发挥功能，应该可与树Pin1基因组合从而有助于调节森林树木的花发育。实施例4通过RNAi沉默对AtPin1功能的分析我们最初的研究是通过用RNAi构建体转化拟南芥属植物，以负调节该植物内的AtPin1。该构建体的设计方法与Waterhouse等人报道的方法相似(Waterhouseetal.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513959-13964)。将AtPin1的cDNA序列(如SEQIDNO26所示)克隆为反向重复片段，并受组成型35S启动子和OCS终止子的调控。接着将该35S-cDNA-重复片段-OCS盒克隆进pART27植物转化载体中，获得被命名为pJY618的最终构建体。利用内花浸涂转化法将该构建体pJY618转化进拟南芥“Columbia”生态型植物内(CloughSJandBentA.，花浸涂适用于农杆菌介导的拟南芥转化的简化方法.PlantJ.16735-743(1998))。但在三次重复转化试验后未获得任何转基因植物，说明AtPin1基因对植物细胞存活而言必不可少，且内源AtPin1基因表达的剔除将导致细胞死亡。我们接着通过农杆菌-介导的叶片组织转化将RNAi沉默构建体pJY618导入本塞姆氏烟草植物内(Burowetal.，1990，PlantMolBiolRep8124-139)。由于AtPin1与本塞姆氏烟草内的Pin1基因并非100％同源，我们推测该序列的转录会部分地负调节转基因本塞姆氏烟草植物内的NbPin1，因此归纳出植物致死率的问题。这些试验获得了转基因本塞姆氏烟草植物。如图3所示，这些植物所表现的表型与降低的细胞分裂活性相符。与经由空对照载体pART29转化的植物相比(图3，右)，经由上述沉默载体转化的植物不是非常小(Fig.3，左)就是大小中等，且叶片小(Fig.9，中)。这些结果表明与内源植物基因至少具有70％同源性的植物Pin1基因可被用于基因抑制，以减少植物枝条和叶片的细胞生长。实施例5植物Pin1基因的核苷酸序列在除草剂方面的用途上文实施例3和4所述结果无疑证实AtPin1基因对植物细胞存活而言必不可少。我们计划利用植物Pin1基因的序列并结合新型基因沉默技术用于除草众所周知，具有21-23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)可引发含有相同核苷酸序列的基因在植物和动物内的沉默(Waterhouseetal.，Nature411834-842，2001)。该沉默信号可系统性地遍布整株植物。可利用一系列技术，诸如基因枪(Klahreetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9911981-11986，2002)、农杆菌属渗入法(Llaveetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9713401-13406，2000)和病毒感染法(Gosseleetal.，PsantJ.32859-866，2002)将siRNA送递进植物细胞内。我们计划利用杂草物种Pin1基因的核苷酸序列生成siRNA。为降低与农作物种Pin1基因序列的同源性，优选地将该siRNA序列导向非保守区，诸如所述基因的5’和3’非翻译区。该类型的siRNA应仅使杂草Pin1基因沉默，并使杂草死亡，而不影响农作物植物。该类型的siRNA可具有高度物种特异性，并具有若干优于目前市售除草剂的优势。本领域已公开了在mRNA靶内筛选合适区域的方法(参见例如，Vickersetal.，J.Biol.Chem.2787108-7118，2003；ElbashiretalNature，411，494-498，2001；Elbashiretal，GenesDev.，15，188-200，2001)。所选靶序列优选地对低浓度siRNA的负调节灵敏。设计siNA的指导方针包括Ambion’sTechnicalBulletin#506提出的那些原则(可获自AmbionInc.，Austin，TX)。利用体外转录技术可生成siRNA剂和将其喷洒在植物上。可将该siRNA序列克隆进病毒内，用于感染杂草并送递该siRNA。也可利用其它可生成和送递siRNA的方法。实施例6对转基因AMP1植物的制备和分析通过标准扩增方法并利用序列如SEQIDNOS14和15所示的引物扩增含有特定完整ORF的基因组DNA片段，该完整ORF编码用于AtCycD4；1的蛋白(SEQIDNO13)。将该扩增片段以有义方向克隆进pART7的35S启动子和OCS终止子之间，以实现所述细胞周期蛋白的过量表达和异位表达。接着将该35S-ORF-OCS盒克隆进二元载体pART27内。利用内花浸涂转化法(CloughSJandBentA.，花浸涂适用于农杆菌介导的拟南芥转化的简化方法。PlantJ.16735-743(1998))将由上所获的基因构建体(JY17)转移进拟南芥“Columbia”生态型植物内。为另外获得阴性对照，将GUS报道基因克隆进pART27质粒内。该对照质粒被称为pART69。花浸涂后收集T1种子，散布在含有卡那霉素的培养基平板上。在首先散布的1mlT1种子中鉴定出30株以上具有卡那霉素抗性的T1转基因植物。再采用Burow等人所述的方法(PlantMol.Biol.Rep.8124-139，1990)将所述构建体转移进本塞姆氏烟草中，利用我们研发的农杆菌介导型植物转化系统则将相同构建体转移进巨桉植物内，该农杆菌介导型植物转化系统被公开在2003年10月6日提交的美国临时专利申请60/508,944中。从独立转化的细胞中分别再生出20株本塞姆氏烟草和12株大叶桉转基因植物，将它们植入土壤，用于分析生长速率和木质。所有AMP1T1转基因拟南芥属植物均具有较长的下胚轴，例如比经由不含目标基因的空载体pART27所转化对照植物的下胚轴长2-3倍(图4)。显微镜检查显示与对照下胚轴相比，AMP1转基因下胚轴含有许多小细胞。从中央维管组织到表皮细胞层，对照下胚轴具有8个细胞层，AMP1下胚轴则具有14个细胞层。AMP1下胚轴细胞的长度约为对照细胞的10％(图5)。AMP1下胚轴所含细胞数量至少比对照下胚轴多50倍。AMP1转基因下胚轴较长，且径向具有的细胞层更多，但所含细胞远比对照下胚轴所含细胞短小。还检查了其它器官内的细胞数和大小。AMP1转基因叶片所含表皮细胞和气孔多于对照叶片。尽管AMP1转基因植物的气孔大小未变化，但其表皮细胞远小于对照植物的表皮细胞(图6)。AMP1转基因植物的毛状体由多个(多于10个)细胞和核组成。对照植物的毛状体则仅含单个细胞和多个核(图7)。用0.1％甲苯胺蓝和1μg/lDAPI将AMP1转基因植物和对照植物的根染色。与对照植物相比，AMP1转基因植物的根尖和维管组织所含细胞更多更小。这些结果表明AMP1受组成型35S启动子调控并被表达在转基因植物中时，可增强下胚轴、叶片、毛状体和根部的细胞分裂。AMP1可与组织特异性和/或诱导型启动子一起被用于增强多种类型的植物组织以及不同发育阶段的细胞分裂。可过量表达AMP1的本塞姆氏烟草和大叶桉转基因植物还被发现所含细胞远多于和小于对照植物的细胞。在温室生长4个月后，与pART69对照植物相比，经由AMP1过量表达构建体转化的巨桉植株的高度增加了大约20％。对生长在相同温室内的分别属于三个AMP1独立转基因系和两个对照系的共计50棵植株进行了分析，每个系对应植株数为10棵。结果表明AMP1跨树种发挥了作用，可能可以被用于操纵广泛多种植物物种的细胞数和大小。上述结果表明可通过过量表达AMP1及其相关细胞周期蛋白改良乔木和灌木，以提高诸如纤维素的细胞壁物质的产量和生物量，从而使它们更适合作为生物燃料的用途。此外，预期还将提高这些改良树木的木质，从而更适合建筑用途(例如，提高了木材密度和强度)。实施例7目标植物组织内生物合成途径产物水平的提高为促进树种的木材发育，将AMP1克隆进二元载体，并受若干种可驱动形成层和发育中的木质部细胞内的基因表达的组织特异性启动子调控。利用农杆菌介导的转化系统将这些构建体导入树种内。比较转基因植物和对照植物二者形成层和发育中的木质部区的细胞数和大小。比较AMP1转基因植物和对照植物的树高度和树干直径。预期AMP1转基因树木将生成比对照植株更多的木材和细胞壁物质(例如纤维素)。为进一步提高纤维素产量，将纤维素合酶基因(CesA)克隆进二元载体内，受可驱动发育中的木质部细胞内的基因表达的组织特异性启动子调控。利用农杆菌介导型转化系统将该构建体连同上述AMP1基因构建体一起转移进树种内(包括桉树和柳树)。利用PCR和RT-PCR技术分析转基因植物内两种基因的存在和表达。AMP1在形成层细胞内的过量表达将增加用于木质部(木材)分化的细胞数，而CesA在发育中的木质部细胞内的过量表达则将提高次生细胞壁内的纤维素产量。预期可过量表达这两种基因的转基因植物将生成非常多的纤维素，因为AMP1使木质部细胞数增加，CesA基因则使各木质部细胞内的纤维素含量增加了。可通过类似方法将AMP1和生物合成途径的其它酶促和调节物结合用于提高植物生物化学的水平。方法概述遗传转化本发明所述基因构建体包括一个或多个适用于转化细菌和植物宿主生物的多核苷酸序列。载体的构建和应用方法是本领域熟知的，通常可参考Berger和Kimmel在由AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA.出版的Meth.Enzymology，vol.152中发表的GuidetoMolecularCloningTechniques；由ColdSpringHarborLaboratory，NY出版Sambrook等人(1989)所著的MolecularCloning-ALaboratoryManual(2nEd)，vol1-3；以及由GreenePublishingAssociationandJohnWiley&Sons，Inc.出版的(F.M.Ausubel等人编辑)CurrentProtocols中的CurrentProtocolsinMolecularBiology。用多核苷酸转化植物及其若干部分的方法如Draper，J.等人(1988)在由BlackwellSci.Pub.Oxford出版的ALaboratoryManual.第365页发表的PlantGeneticTransformationandGeneExpression；由Springer-Verlag，Berlin出版的Potrykus，I.和Spangenburg，G.(1995)所著的GeneTransfertoPlants以及由KluwerAcad.Pub.Dordrecht出版GelvinS.B.等人(1993)所著的PlantMolecularBiol.Manual.所述。由ImperialCollegePress，London出版GalunE.和Breiman，A.(1997)所著的TransgenicPlants.对转基因植物进行了极佳的综述，并包括转化技术。可使外源基因在转基因植物内表达的植物载体典型地包括可驱动一个或多个克隆ORFS表达的启动子、终止子和选择性基因。组成型植物启动子的实例包括CaMV35S启动子，胭脂碱合酶启动子和章鱼氨酸合酶启动子，松属超泛素启动子(参见被完整引入本文作为参考的U.S.PatentNo.6,380,459)和玉米来源的Ubi1启动子。在特定组织内有效并响应内部发育信号或外部非生物性或生物性应力的特异性植物启动子可参考学术文献所述。代表性的启动子和融合启动子如，例如被引入本文作为参考的WO02/00894所述。优选在原形成层组织内有效的基因的启动子，诸如，例如AtHB8(KangandDengler，Planta216212-219，2002)和AtHB15(Ohashi-ItoandFukuda，PlantCellPhysiol.441350-1358，2003)有助于特异性增强木材发育。终止子存在于被翻译序列下游基因的3’未翻译末端。终止子是决定mRNA稳定性的重要因素，在某些情况中还被发现具有空间调节功能。构建体内通用的终止子实例包括马铃薯的PI-II终止子区、章鱼氨酸合酶3’终止子和胭脂碱合酶3’终止子。转基因的过量表达可被用于获得功能表型，显性失活突变的表达可使功能表型丧失，而对基因表达和RNAi的有义和反义抑制则可被用于获得具有功能丧失或降低的表型的转基因系。RNAi通过将与被导入序列具有dsRNA同源性的基因的转录产物导向降解，从而降低或消除了特定基因功能(参考Sharp，P.，(1999)Genes&Development13139-41的论述)。通过将双链或单链RNA导入植物细胞或用RNAi表达构建体转化所述植物，便可获得RNAi。RNAi沉默法的代表性实例可参考下列专利申请WO98/36083、WO99/15682、WO/98/53083、WO99/49029、WO99/53050、WO01/77350、WO01/94603、WO02/00894、WO01/75164和WO01/68836。相关序列分析可通过基于计算机的方法利用公开的结构域序列比对算法和序列相似性检索工具检索序列数据库(公开的结构域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR等)鉴定与本申请所述序列同源的序列。参见例如，针对在线资源的NucleicAcidsResearch，29，1-10和11-16(2001)。相似性检索可检索并将序列排列用于与待分析靶序列(即询问序列)进行比对。比对序列的局部区域之间的最佳比对被称为局部序列比对。序列比对算法利用了评分矩阵对各比对结果大体赋值。利用公开的计算机算法可对多核苷酸和多肽序列进行排列，并确定它们与其它多核苷酸和多肽序列在特定区域内的一致残基百分比。两种被用于排列和鉴定多核苷酸序列相似性的代表性算法是BLASTN和FASTA算法。还可利用BLASTX算法分析多核苷酸，即将核苷酸询问序列(两条链)的六框概念翻译产物与蛋白质序列数据库做比较。利用BLASTP算法可检验多肽序列的相似性。被设定为特定默认参数的BLASTN算法Version2.0.11[2000年1月20引被优选用于确定本发明所述的多核苷酸变体，其中特定默认参数参见文献，并根据该算法分布。BLASTP算法被优选用于确定本发明所述的多肽变体。包括BLASTN、BLASTP和BLASTX在内的BLAST算法系列的应用如Altschul等人在NucleicAcidsRes.253389-3402，1997中发表的“GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms”所述。BLASTN软件可从NCBI匿名FTP服务器(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)下载获得，目录为/blast/executables/，也可获自NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)，NationalLibraryofMedicine，Building38A，Room8N805，Bethesda，MD20894USA。FASTA软件包可获自弗吉尼亚大学(UniversityofVirginia，POBox9025，Charlottesville，VA22906-9025)。1996年2月发布的版本为2.0u4的FASTA可被用于确定本发明所述的变体，其默认参数的设定如文献所述并根据该算法分布。FASTA算法的应用如Pearson和Lipman在Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448，1988中发表的“ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis以及Pearson在MethodsinEnzymol.18363-98，1990中发表的“RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA”所述。下列运行参数是利用可对多核苷酸序列赋以E值和同一性百分比的BLASTN确定序列比对结果和相似性时优选的Unix运行命令blastall-pblastn-dembldb-e10-G0-E0-F-r1-v30-b30-iqueryseq-oresults；参数为-p程序名[String]；-d数据库[String]；-e期望值(E)[Real]；-F过滤询问序列；-G空位打开代价(为0时调用默认模式)[Integer]；-E空位延伸代价(为0时调用默认模式)[Integer]；-r核苷酸匹配奖励(仅适用于BLASTN)[Integer]；-v单行描述数(V)[Integer]；-b序列比对显示数(B)[Integer]；-i提问文件[FileIn]；以及任选的-oBLAST报告输出文件[FileOut]。下列运行参数是利用可对多肽序列赋以E值和同一性百分比的BLASTP确定序列比对结果和相似性时优选的blastall-pblastp-dswissprotdb-e10-G0-E0-F-v30-b30-iqueryseq-oresults；参数为-p程序名[String]；-d数据库[String]；-e期望值(E)[Real]；-F过滤询问序列；-G空位打开代价(为0时调用默认模式)[Integer]；-E空位延伸代价(为0时调用默认模式)[Integer]；-v单行描述数(v)[Integer]；-b序列比对显示数(b)[Integer]；-I提问文件[FileIn]；任选的-oBLAST报告输出文件[FileOut]。通过BLASTN、FASTA、BLASTP或类似算法利用询问序列搜索一个或多个数据库序列所获得的“命中”结果对序列的相似部分进行了排列和鉴定。该命中结果是根据相似性程度和重叠序列长度依序排列的。对一个数据库序列的命中结果通常仅代表长度为询问序列长度的重叠部分。BLASTN、FASTA和BLASTP算法还可生成序列比对的“期望”值。该期望值(E)给出的是可以“期望”在搜索特定大小数据库时随机发现与特定数目的连续序列对应的命中数，该期望值可作为显著性阈值，被用于确定搜索数据库，诸如优选EMBL数据库时的命中结果是否指出了真实相似性。例如，多核苷酸命中结果的赋值E为0.1时，意指在EMBL数据库大小的数据库中，可期望仅通过随机在具有相近评分的序列的排列部分发现的匹配率为0.1。根据该标准，上述多核苷酸序列的排列和匹配部分便有90％的一致可能性。对E值为0.01或更低值的序列而言，利用BLASTN或FASTA算法在EMBL数据库内发现随机匹配的概率为1％或更低值。针对一组相关序列的多重序列比对可利用PILEUP进行，该算法采用的是渐进式两两序列比对(Fengetal.，J.Mol.Evol.25351，1987)。模式识别软件应用程序可被用于发现基序或特征序列。例如，MEME(MultipleEmforMotifElicitation)可发现一组序列中的基序和特征序列，而MAST(MotifAlignmentandSearchTool)则可利用这些基序鉴定询问序列中与之相似或相同的基序。MAST结果给出了一系列具有合适的统计数据的序列比对，并可形象观察在它们当中发现的基序。MEME和MAST由UniversityofCalifornia，SanDiego研发。PROSITE(BairochandBucher，NucleicAcidsRes.223583-3589，1994；Hofmannetal.，NucleicAcidsRes.27215-219，1999)是可鉴定由基因组或cDNA序列翻译所获未表征蛋白质的功能的方法。PROSITE数据库(www.expasy.org/prosite)包括生物学显著模式和分布图，其设计使其可与合适的计算工具一起应用，从而将新序列指定到已知的蛋白质家族中，或者可以确定特定序列中存在的哪些结构域是已知的(Falquetetal.，NucleicAcidsRes.30(1)235-238，2002)。Prosearch是可搜索具有特定序列模式或特征的SWISS-PROT和Tremble数据库的工具。根据所述蛋白质与其它蛋白质的序列相关性，可将它们归类为具有相同基因组(共生同源基因)或不同基因组(直向同源基因)。直向同源基因是通过物种形成从共同的祖基因进化而来的基因。这些基因在进化时通常保留了相同的功能。共生同源基因是基因组内重复的基因。这些基因可能获得新的特异性或改良功能，而这些特异性或功能可能与原始基因相关。系统发生分析法可参考Tatusovetal.，Science278631-637(1997)。本申请引用的全部参考文献、出版物和专利只要不与本公开内容相悖，便被完整引入本文作为参考，以适用于本文的各方面。应当理解本发明不仅限于上述实施方案和实例，还可在不改变其范畴的前提下对其进行多种修改。SEQIDNOS1-60如附件序列表所示。在所附序列表中应用的核苷酸序列编码，包括符号“n”在内，均与WIPOStandardST.25(1998)，附录2，表1相符。序列表<110>Yao，JiaLongAmpomah-Dwamena，Charles<120>植物细胞周期基因及应用方法<130>1075PCT<160>60<170>FastSEQ适用于WindowsVcrsion4.0<210>1<211>2571<212>DNA<213>巨桉<400>1ctctcatggttctctccttgcttcgtcttcttcaccaaaatccaaactttccccacagaa60actccacttcgcagcaagcgaaaactctgcactgcacatagtacgcagtacagttcaatc120cctcgtcgcttctccgcctgcttgacgaccgccgccgccgccgccatgatcaagtggcac180gatctctacgcggtgctggtcgcggtggtgccgctctacgtggcgatgatcctggcctac240ggctccgtgcggtggtggaggatcttctcccccgaccagtgctccggcatcaaccgcttc300gtcgccatcttcgccgtcccgctcctctcgttccacttcatctccaccaacgacccctac360cgcatgaacctccgcttcatcgccgccgacaccctccagaagctcctcctcctcctcctc420ctcgccctctgggccaacctccaccgccgcggctccctggactggtccatcaccgtcttc480tccctctccaccctccccaacaccctcgtcatgggcatccctctcctcggcgccatgtac540ggcaccgaagctagcaacctcatggtccaggtggtcgtgctgcagtgcatcatctggtac600accctcctcctcttcctcttcgagtaccggggcgcgaagatcctcatcatggagcagttc660cccgagaccgccgcgtccatcgtgtccttcaatgtcgacccggacgtcgtctccctcgac720ggccggaacttcctcgagaccgacgcggaggtcggccaagacgggaagctgcacgtcacg780gtgaggaagtcgaacgcgtcgcggcggtccttcggcctggggcctggcggtggcggctcg840ttctccgggatgacgccgcggccttcgaacctcagcggcgtggagatctacagcctgagc900tcgtcgcggaacctgactccgaggggttccaactcggacttctactccatcatgggcgtg960cctcggctctccaacttcggaccctccgacgcgtactccgtccagtcctcccggggcccg1020accccgaggccatcgaacttcgacgagaacctgcagccgtccccgaagttcgggttctac1080ccggcccaggtcgcgtccgccccgtacccggctccgatccccgatttcgcatcagcattc1140gcgaagagcggcaaacccaaccagcaacagcagcagccggcgccggcgccgccggagcag1200caatctaacggcgcggcaaaggcaaacagttacgacgccaaggagctccacatgttcgtg1260tggagctccagcgcctcgccggtttcggaagtcggcgggctccacgttttcggcagcggc1320gatttcggggctccggacaatcaatccaggcgggccgatcacagcgtcaaggagatccgg1380atgatggttgccgataataaccagcccaacggcgagaccaaaactgccccggaaacgacg1440ggatttactgggcaagatcagttcaacttcgtggctaaagcagacgaaagggacgagggg1500accggaggagagaaggaggcggccgggcccgaccggcccaacaagctctgcgcgagctcc1560tccgccggagagccgggggggtacggcggcggcgacgacgccgggaacgacaagcagatg1620ccgccggcgagcgtgatgacccgcctcatcttgatcatggtgtggaggaagctgatccgg1680aaccccaacacctactcgagcctcatcggcatcatctggtccttgatcgccttccggtgg1740gatgtgggaatgcccgagatcgtcgacaagtccatccacatactgtccgacgccgggctg1800ggaatggccatgttcagcttgggtctgttcatggctct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sGlyGlyTyrValGluArgLeuGlu65707580GlnGlyGlyPheGluSerSerTrpArgLysAspAlaMetAspTrpIle859095CysLysValHisSerTyrTyrAsnPheGlyProLeuSerLeuCysLeu100105110SerValAsnTyrLeuAspArgPheLeuSerThrPheAsnLeuProHis115120125AspLysSerTrpMetGlnGlnLeuMetSerValAlaCysLeuSerLeu130135140AlaValLysMetGluGluThrValAlaProLeuProValAspLeuGln145150155160ValCysGlyAlaLysAsnMetPheGluAlaLysAsnIleLysArgMet165170175GluLeuValValMetGluThrLeuAsnTrpArgLeuHisAlaValThr180185190ProPheSerPheIleCysTyrPheLeuAspLysPheThrGluGlyLys195200205ProProSerTyrMetLeuAlaSerArgCysAlaGluLeuIleValGly210215220ThrValLysAspTyrArgPheLeuSerPheArgProSerGluIleAla225230235240AlaAlaValValLeuLeuAlaLeuValGluAsnGlnValIleGlyPhe245250255SerSerAlaIleAlaAlaSerGluIleProValAsnLysGluMetIle260265270MetArgCysTyrGluLeuLeuValArgMetArgGlyAsnLeuSerAla275280285SerLeuSerAlaProGlnSerProIleGlyValLeuAspAlaAlaCys290295300PheSerPheArgSerAspAspThrThrProGlySerSerProSerAsn305310315320AsnAsnAsnSerGlyAsnAsnAspGlnAlaSerAlaProAlaSerLys325330335LysArgArgLeuSerThrSerProIle34034权利要求1.分离的多核苷酸，包括选自下列的序列(a)SEQIDNO1-12、16-22、46-47、59；(b)SEQIDNO1-12、16-22、46-47、59的互补序列；(c)SEQIDNO1-12、16-22、46-47、59的反向互补序列；(d)SEQIDNO1-12、16-22、46-47、59的反向序列；(e)编码选自SEQIDNO27-45、48-49、60的多肽序列的序列；(f)由于遗传密码简并性而与(a)-(d)所述序列不同的序列；(g)与(a)-(d)所述序列具有至少75％同一性的序列；(h)与(a)-(d)所述序列具有至少80％同一性的序列；(i)与(a)-(d)所述序列具有至少90％同一性的序列；和(j)与(a)-(d)所述序列具有至少95％同一性的序列。2.分离的多肽，包括选自下列的氨基酸序列(a)SEQIDNO27-45、48-49、60；(b)与SEQIDNO27-45、48-49、60所示序列具有至少75％同一性的序列；(c)与SEQIDNO27-45、48-49、60所示序列具有至少90％同一性的序列；和(d)与SEQIDNO27-45、48-49、60所示序列具有至少95％同一性的序列。3.包括权利要求1所述序列的重组遗传构建体。4.重组遗传构建体，从5’到3’方向包括(a)基因启动子序列；(b)多核苷酸序列，至少包括下述之一(1)至少编码包含SEQIDNO27-45，48-49，60所示序列的多肽的功能部分的多核苷酸；和(2)包括SEQIDNO1-12、16-22、46-47、59所示多核苷酸序列的非编码区的多核苷酸；和(c)基因终止序列。5.权利要求4的遗传构建体，其中所述多核苷酸为有义方向。6.权利要求4的遗传构建体，其中所述多核苷酸为反义方向。7.包括权利要求4所述遗传构建体的转基因植物细胞。8.包括权利要求4所述遗传构建体的植物或其部分或繁殖体。9.调节植物生长和生物量的方法，包括将权利要求4所述重组遗传构建体稳定整合进所述植物的基因组内。10.权利要求9所述的方法，其中所述植物为乔木或灌木。11.权利要求10所述的方法，其中所述重组遗传构建体含有选择性地在木材形成组织内有活性的启动子和选自SEQIDNO1-13、16-22和59的多核苷酸序列。12.生产具有改良的木材特性的植物的方法，包括(a)用含有在木材形成组织内有活性的启动子；选自编码AMP1和AMP1相关D型细胞周期蛋白的序列的多核苷酸序列；以及基因终止序列的重组遗传构建体转化植物细胞；并(b)在有助于再生和成熟植物生长的条件下培养该转基因细胞，其中该植物与未修饰的植物相比，表现了一种或多种下述变化茎干直径增加、木质部纤维细胞数增加、纤维直径和腔减小、细胞壁物质产量增加、细胞壁组成改变、木材密度增加和木材强度提高。13.权利要求12所述的方法，其中所述多核苷酸序列选自SEQIDNO1-13、16-22和59所示序列。14.改变植物生殖发育的方法，包括将含有受基因的启动子调控的植物Pin1多核苷酸序列的重组遗传构建体稳定整合进所述植物的基因组内，其中所述基因的启动子在发育中的植物生殖组织内有活性。15.权利要求14所述的方法，其中所述植物Pin1多核苷酸序列选自SEQIDNO23、26、46、47和55-58所示序列。16.权利要求14所述的方法，其中所述启动子选自AP3或PTD。17.制备选择性地对植物杂草物种具有毒性的除草剂的方法，包括鉴定杂草物种内的Pin1基因，并直接针对存在于该杂草Pin1基因内而不存在于其它植物物种Pin1基因内的序列制备siRNA分子。18.提高植物中生物合成途径的产物水平的方法，包括用下述至少一种多核苷酸序列稳定转化植物的基因组(i)编码参与所述生物合成途径的转录调节物或酶的多核苷酸序列；和(ii)选自编码AMP1和AMP1相关D型细胞周期蛋白的序列的多核苷酸序列，其中所述序列(i)和(ii)是在选择性地于目标组织内有活性的启动子调控下表达，其中所述途径在该目标组织内起作用；以及其中，当用上述序列之一转化植物时，该方法进一步包括使该植物与经由另一种上述序列转化的植物杂交，以获得表达这两个序列的双重转化体；并从而提高该植物内所生成产物的水平。19.权利要求18所述的方法，其中所述启动子选择性地在木材形成组织内有活性，且所述生物合成途径参与细胞壁合成。20.权利要求19所述的方法，其中所述植物基因组是由(i)和(ii)两种多核苷酸序列稳定转化的，其中多核苷酸序列(i)编码参与高结晶度纤维素的生成的酶，多核苷酸序列(ii)选自SEQIDNO1-13、16-22和59所示序列。全文摘要本申请公开了编码植物生长和繁殖的多肽调节物的植物多核苷酸序列，以及它们的应用方法。文档编号C12N15/29GK1856574SQ200480027939公开日2006年11月1日申请日期2004年7月28日优先权日2003年7月28日发明者姚家龙,C·安波马－德瓦梅娜申请人:农业基因生物科学有限公司