专利名称：细胞周期调控蛋白Cyclin B1在制备抗人类食管癌侵袭转移药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞周期调控蛋白的新用途，特别是哺乳动物包括人细胞周期调控蛋白Cyclin B1在人类食管癌侵袭转移发生中的新用途。
背景技术：
现有技术中，细胞周期调控蛋白Cyclin B1(Cyclin B1；CCNB1)有称之为G2/mitotic specific cyclin B1 CCNB。本领域技术人员公知，在裂殖酵母有三种B型周期蛋白。其中之一是Cdc13，这是细胞进入有丝分裂所必需的。Booher，Beach初次报道本发明所述的基因序列[Booher，Beach(1988)EMBO J 72321；Hagan et al.(1988)J Cell Sci 91587]。其他两个名为Cig1[Bueno et al.(1991)Cell 65149]和Cig2[Bueno，Russell(1993)Mol Cell Biol 132286；Connolly，Beach(1994)Mol CellBiol 14768]，)它们并非有丝分裂周期所必需的。Gautier等证明，与Cdc2结合成复合物的周期蛋白B是非洲爪蟾MPF的主要成分[Gautier et al.(1990)Cell 60487]。
Pines和Hunter克隆到编码周期蛋白B的人类基因[Pines，Hunter(1989)Cell 58833]，他们与Giordano等一道[Giordano et al.(1989)Cell 58981]也证明人周期蛋白B和Cdc2之间所形成的复合物在有丝分裂期间作为激酶其活性最高。
本领域技术人员知道在细胞周期的调控中，有三类分子起着重要作用，分别为细胞周期素(Cyclins)、细胞周期素依赖性激酶(CDKs)和细胞周期素依赖性激酶抑制子(CKIs)。其中Cyclins和CDKs对细胞周期起正性调控作用，CKIs起负性调控作用。当受到生长信号的刺激时，Cyclins表达上调，激活相应CDKs，形成Cyclins/CDKs复合物，使多种底物蛋白磷酸化，从而推动细胞沿细胞周期不断分裂增殖。CKIs可以与Cyclins、CDKs或两者的复合物结合，抑制其活性，从而起到负性调控的作用。
目前已经确定的Cyclins共有11种，其中Cyclins D和Cyclins E主要调控G1/S转换，Cyclins A主要调控S期的进展，而Cyclins B主要与G2/M期转换有关。
细胞周期调控蛋白Cyclin B1是Cyclin B家族的成员之一[Brandeis M，Rosewell I，Carrington M，Crompton T，Jacobs MA，Kirk J，Gannon J，Hunt T.CyclinB2-null mice develop normally and are fertile whereas cyclin B 1-null mice die in utero.Proc.Nat.Acad.Sci.954344-4349，1998]。其基因由九个外显子和八个内含子组成。基因的表达从S期后期开始，G2期达到最高峰，进入M期后其蛋白产物降解失活。在Cyclin B1的诱导下，CDC2(又称CDK1、P34)的激活酶CAK(主要由CDK7和Cyclin H组成)将其磷酸化，紧接着在有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Weel/Mik1作用下，它又被再次磷酸化而失活。在G2/M期过渡时，磷酸化酶CDC25C解除这一使CDK1失活的磷酸化，使之具有蛋白激酶活性，因此，Cyclin B1/CDC2被认为是有活性的成熟促进因子(MPF，也称M期促进因子)。反过来，激活的CyclinB1/CDC2又能磷酸化CDC25C来促进Cyclin B1/CDK1的磷酸化，如此形成了一个正反馈环路[Poon RY，Chau MS，Yamashita K，Hunter T.The role of Cdc2feedback loop control in the DNA damage checkpoint in mammalian cells.Cancer Res.1997 Nov 15；57(22)5168-78.]。CDC25C的活化需要PLK激酶的参与，有证据表明，CDC2本身就能激活PLK的活性，这又构成了另一条正反馈途径。在这些正反馈途径的综合作用下，MPF在激酶活性上完成瞬间的爆发式增加[Roshak AK，Capper EA，Imburgia C，Fornwald J，Scott G Marshall LA.The human polo-like kinase，PLK.regulates cdc2/cyclin B through phosphorylation and activation of the cdc25Cphosphatase.Cell Signal.2000 Jun；12(6)405-11.；Yoshima-Morimoto F，Taniguchi E，Shinya N，Iwamatsu A，Nishida E.Polo-like kinase 1phosphorylates cyclin B1 andtargets it to the nucleus during prophase.Nature.2001 Mar 8；410(6825)215-20.Erratum inNature 2001 Apr 12；410(6830)847.；Yuan J，Eckerdt F，Bereiter-Hahn J，Kurunci-Csacsko E，Kaufmann M，Strebhardt K.Cooperative phosphorylationincluding the activity of polo-like kinase 1 regulates the subcellular localization ofcyclin B1.Oncogene.2002 Nov 28；21(54)8282-92.]。Cyclin B1/CDC2复合物从细胞质进入细胞核，使相应的底物磷酸化，推动G2/M期转换。
Hunter等人认为，在恶性细胞进入S期和G2期时，Cyclin B1过表达并积累，与CDC2形成过多的成熟促进因子，在活性和功能异常的Weel/Mik1、CAK的作用下形成不成熟激活的Cyclin B1/CDC2/CDC25C正反馈环，激活肿瘤细胞中过表达的成熟促进因子，其高水平表达触发并通过恶性细胞有缺陷的G2/M期监测点而引发核内重要蛋白结构的改变，推动细胞进入M期[Poon RY，Chau MS，Yamashita K.Hunter T.The role of Cdc2 feedback loop control in the DNA damagecheckpoint in mammalian cells.Cancer Res.1997 Nov 15；57(22)5168-78.；WatanabeN，Broome M，Hunter T.Regulation of the human WEE 1Hu CDK tyrosine 15-kinaseduring the cell cycle.EMBO J.1995 May 1；14(9)1878-91.]。
Cyclin B1蛋白也是一种公知的蛋白序列[参见Booher，Beach(1988)EMBO J72321；Hagan et al.(1988)J Cell Sci 91587]，在脑胶质瘤、喉鳞癌、舌鳞癌、血管瘤、小细胞肺癌、滋养细胞疾病、乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、非何杰金淋巴瘤、直肠癌以及肝癌等肿瘤中均有过表达。[Holtkamp N，Afanasieva A，Elstner A，Brain slice invasion model reveals genes differentially regulated in glioma invasion.Biochem Biophys Res Commun.2005 Nov 4；336(4)1227-33.；Bondi J，Husdal A，Bukholm G，Expression and gene amplification of primary(A，B1，D1，D3，and E)andsecondary(C and H)cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patientoutcome.J Clin Pathol.2005 May；58(5)509-14.；Mao Y，Wu J，Skog S，Expressionof cell proliferating genes in patients with non-small cell lung cancer byimmunohistochemistry and cDNA profiling.Oncol Rep.2005 May；13(5)837-46.；Bjorck E，Ek S，Landgren O，High expression of cyclin B1 predicts a favorable outcomein patients with follicular lymphoma.Blood.2005 Apr 1；105(7)2908-15.Epub 2004Dec 2.]。现有技术中未见报道哺乳动物包括人细胞周期调控蛋白Cyclin B1在促进人类食管癌侵袭转移中的作用。
发明内容
本发明的技术方案是细胞周期调控蛋白Cyclin B1在制备抗促进人类食管癌侵袭转移药物中的用途，换言之，本发明涉及细胞周期调控蛋白Cyclin B1在人类食管癌侵袭转移中的作用。
本发明的发明人研究发现，在人类食管癌中不仅存在Cyclin B1的过表达，并且CyclinB1的过表达与肿瘤分化程度有关，特别是高表达的Cyclin B1会导致肿瘤细胞的恶性度增加并且增强了肿瘤细胞的侵袭转移能力。尤其是高表达的CyclinB1导致特异性食管癌肺转移的几率增加。
图1是食管癌Cyclin B1蛋白表达的免疫组织化学检测结果，其中，采用免疫组织化学的方法，使用DAB染色检测食管癌组织(图A)与正常癌旁组织(图B)中Cyclin B1的表达情况，图中棕色为阳性(如果使用黑白件，棕色部分呈深色)。
图2是Western blot检测12株食管癌细胞Cyclin B1蛋白的表达图，其中现有技术的方法提取KYSE2，KYSE30，KYSE140，KYSE150，KYSE180，KYSE410，KYSE450，KYSE510，COLO-680，EC9706，T12，KYSE70等12株食管癌细胞的总蛋白，采用Western blot方法检测Cyclin B1蛋白的表达水平，图中条带深浅代表蛋白表达水平的高低。KYSE150作为Cyclin B1低表达的研究对象。
图3是单克隆的筛选与鉴定(Western Blot)图，其中提取不同单克隆细胞的总蛋白，采用Western blot方法检测Cyclin B1蛋白的表达水平，图中条带深浅代表蛋白表达水平的高低。挑选编号为65、72的单克隆细胞作为高表达Cyclin B1的细胞。
图4是免疫荧光、免疫细胞化学检测克隆Cyclin B1表达情况说明图，其中采用免疫荧光(图a，b，c)、免疫化学(图d，e，f)检测高表达Cyclin B1的细胞与转染空载体细胞之间Cyclin B1表达的差异。图a，b，c中兰色为DAPI染色，红色为TRITC染色，红色的多寡代表Cyclin B1表达的高低。图d，e，f中兰色为苏木素染色，棕色为DAB染色，棕色的多寡代表Cyclin B1表达的高低。
图5是高表达Cyclin B1的稳定细胞株细胞生长曲线图，其中消化细胞后，进行计数，然后接种在六孔板中，每孔30000个细胞。每隔24小时取出一板，消化细胞后，再分别计数。最后计算均值，绘制曲线。
图6是体外侵袭实验结果图。
图7是裸鼠肿瘤体积曲线，其中于BALB/C裸鼠右侧背部(近尾侧)接种人类食管癌细胞，200万细胞/只，每7天观察一次，测量肿瘤大小，依据公式v＝4/3πr12r2(r1为短径，r2为长径)，计算肿瘤大小，绘制曲线。
图8是取接种人类食管癌细胞的裸鼠，28天处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移情况。
图9是接种人类食管癌细胞的28天取裸鼠的肿瘤，作病理H&E染色图。
图10是取接种人类食管癌细胞的裸鼠，70天处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移的情况。
图11表示取接种人类食管癌细胞的裸鼠70天处死后的肿瘤，作病理H&E染色的图片(肿瘤组织，上皮来源)，显示高表达CyclinB1单克隆致肿瘤侵犯肌层。
图12是取接种人类食管癌细胞的裸鼠连续观察3个月，之后处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移的情况。
图13是取接种人类食管癌细胞的裸鼠连续观察3个月，之后处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，作病理H&E染色，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移情况。高表达Cyclin B1单克隆致裸鼠肿瘤肺转移。
图14是注连续观察3个月，之后处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，作病理H&E染色，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移情况。高表达Cyclin B1单克隆致裸鼠肿瘤侵犯骨和横纹肌。
具体实施例方式
以下将结合附图和实施例详细说明本发明的技术方案，并通过实验进一步证实本发明的效果。下述的实施例仅仅是说明目的，而无限定之意。
实施例1采用免疫组织化学的方法分别比较205例配对食管癌癌组织和癌旁组织的Cyclin B1蛋白表达水平的差异，分析Cyclin B1蛋白表达水平与临床预后、病理分级、肿瘤分化之间的相关性。其试验结果见图1，试验中表明，CycinB1蛋白主要表达在胞浆(部分可见合并核阳性。试验中采用的评分标准如下阳性强度评分
阳性细胞比例评分
两者的乘积8.1～12分强阳性(++)4.1～8分弱阳性(+)0～4分阴性(一)。(重复取材的相同病例相同阶段病变按平均值计)作为最后结果。
试验中还采用了205例正常对照的人食管粘膜，187例取到食管正常上皮(其余取到的为间质或组织脱片而造成信息损失。正常鳞状上皮阴性(-)129者例，弱阳性(+)42例，强阳性(++)161例。
对于食管浸润癌组织的获得是205例病例中9例未取到浸润癌或组织脱片造成信息损失，196例有信息(informative)41例(一)，72例+，83例++。因此，试验中，癌旁的癌前病变64例-，77例+，8例++原位癌67例22例-，43例+，2例++重度不典型增生48 22例-，20例+，6例++中度不典型增生19 7例-，12例+轻度不典型增生15 13例-，2例+经过采用SPSS统计结果，表明ESCC的表达较正常鳞状上皮明显上调(X2＝98.634，p＜0.001)。在癌中的表达与分化程度有关(X2＝9.599，p＝0.048)。中、低分化者比高分化者有较高表达(高分化阴性16例，弱阳性18例，强阳性13例，阳性率31/47＝65.95％，中分化阴性14例，弱阳性32例，强阳性47例，阳性率79/93＝84.95％，低分化阴性11例，弱阳性22例，强阳性23例，阳性率45/56＝80.36％。
试验中还发现Cyclin B1蛋白表达水平与性别无关(X2＝3.735，p＝0.154)，与年龄(小于等于50岁和大于50岁组)无关(X2＝0.753，p＝0.686)，与有无淋巴结转移无关(X2＝4.234，p＝0.120)，与肿瘤深度无关(X2＝11.324，p＝0.079)，与TNM分期无关(X2＝11.880，p＝0.157)。
在癌前病变中表达较正常鳞状上皮明显上调(X2＝30.950，p＜0.001)，比浸润癌的表达低(X2＝61.762，p＜0.001)。
实施例2发明人利用现有技术的方法，例如Western blot检测KYSE2，KYSE30，KYSE140，KYSE150，KYSE180，KYSE410，KYSE450，KYSE510，COLO-680，EC9706，T12，KYSE70等12种市售的食管癌细胞系，筛选出Cyclin B1蛋白低表达的KYSE150细胞系，转染pCDNA3.1 Cyclin B1质粒(参照LipofectamineTM2000说明)，通过细胞免疫荧光(UltraSensitive S-P试剂盒说明书进行操作)、RT-PCR、Western blot检测手段挑选Cyclin B1蛋白高表达的单克隆，构建稳定细胞株。再采用生长曲线、Transwell等细胞生物学方法观察高表达Cyclin B1的细胞株与转染空载体的阴性对照在细胞生物学方面的差异。
RT-PCR所采用的引物Cyclin B1上游5-TCC AAG CCC AAT GGA AAC AT-3下游5-ATG CTC TCC GAA GGA AGT GC-3产物大小551kbpGAPDH上游5-GCT GAG AAC GGG AAG CTT GT-3下游5-GCC AGG GGT GCT AAG CAG TT-3产物大小299kbpWestern Blot采用的抗体
生长曲线的绘制
(1).消化细胞，计数，接种在六孔板中，每孔30000个。
(2).每隔24小时取出一板，消化细胞，分别计数。
(3).七天后统计数值，绘制生长曲线。
体外侵袭实验(Trans-well)使用Chemotaxis Chamber(Neuro Probe，USA)检测细胞的侵袭能力。在上层小室的50μl培养基中包含1×104个细胞，下层小室的30μl基质中含有5μg/mlfibronectin(Sigma，USA)。带有8μm小孔的聚碳酸脂膜置于两层小室之间，37℃5％CO2的孵箱孵育6小时。小心刮下没有迁移的上层细胞后，聚碳酸脂膜在甲醇中固定10分钟，Giemsa染色1小时。显微镜下观察，照相计数。随机取10个视野计数，统计数值，绘制柱形图。
试验结果在上述12种食管癌细胞系中，KYSE150细胞系Cyclin B1的蛋白表达量低(见图2)。通过转染KYSE150细胞系，并利用细胞免疫荧光、Western blot检测方法获得稳定高表达Cyclin B1的细胞株(见图3、4)。高表达Cyclin B1的稳定细胞株与转染pCDNA3.1空载体的阴性对照组细胞株相比，细胞生长旺盛，生长曲线呈明显上升趋势(见图5)。Transwell检测表明高表达Cyclin B1细胞株穿透能力明显高于转染pCDNA3.1空载体的阴性对照组细胞株(见图6)。说明Cyclin B1可导致肿瘤细胞的恶性度增加、肿瘤细胞的转移能力增强。
实施例3裸鼠致瘤实验选用4周龄BALB/C裸鼠(购于中国医学科学院肿瘤医院动物中心)，雄性，于裸鼠右侧背部(近尾侧)接种人类食管癌细胞，200万细胞/只，每7天观察一次，测量肿瘤大小，观察裸鼠一般情况，连续观察3个月，分别在28天、70天以及3个月之后处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，作病理H&E染色，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移情况。本实验重复了三次。
裸鼠致瘤实验共分为四组接种，分别为KYSE150、空载、高表达Cyclin B1的克隆1、克隆2，每组10只裸鼠。重复3次。
依据公式v＝4/3πr12r2(r1为短径，r2为长径)，计算肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。(见图7)实验结果H&E染色结果显示，肿瘤为上皮来源，确为接种的人类食管癌细胞导致肿瘤发生。高表达Cyclin B1的克隆1、2接种裸鼠后，肿瘤生长速度快，肿瘤体积明显大于KYSE150组、pCDNA3.1空载组。克隆1、2接种裸鼠后，肿瘤侵犯肌层、横纹肌、骨，远处可见肺转移，而KYSE150组、pCDNA3.1空载组未见(见图8-14)，特别是肺转移比例为50-70％。其中图8所示为取接种人类食管癌细胞的裸鼠，28天处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移情况。图9所示为28天取裸鼠的肿瘤，作病理H&E染色，证实为上皮来源，确为接种的人类食管癌细胞导致的肿瘤发生。
表1显示本实施例的肿瘤侵袭、转移情况统计情况。
表1
换言之，本发明实施例证实了细胞周期调控蛋白Cyclin B1在促进人类食管癌侵袭转移中的作用。
权利要求
1.哺乳动物包括人的细胞周期调控蛋白Cyclin B1在制备抗人类食管癌侵袭转移药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及哺乳动物包括人的细胞周期调控蛋白Cyclin B1在制备抗人类食管癌侵袭转移药物中的用途。
文档编号A61P35/00GK1868536SQ20061009576
公开日2006年11月29日 申请日期2006年7月4日 优先权日2006年7月4日
发明者詹启敏, 宋咏梅, 黄振, 赵春玲, 薛丽燕, 吕宁, 陈阿梅, 付明, 董立佳 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所