专利名称：基因或核酸序列的酶切-连接长序列半合成方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸序列，尤其涉及一种特定长核酸序列的获得方法。
技术背景在生命科学及医学研究中，特定核酸(如全基因或复杂脱氧核糖核酸) 序列的获得已经成为一种必不可少的过程。目前其获得特定序列的途径主要有反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR法)和化学合成法两种。前者的基本原理是设计特异性引物，用目标生物的核糖核酸或脱氧核糖核酸为模板，进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR反应)，扩增得到 目标序列，能够得到的序长度一般在1500个碱基对以下。化学法是用人工合成互补引物，然后应用聚合酶链式反应(PCR)扩 增得到目的片段， 一般能够得到序列的长度一般在3000个碱基对以下，此 外，化学合成序列的错误率与所合成序列的长度呈正相关。所以，如何得 到10000个碱基对或以上的长片段基因或复杂脱氧核糖核酸序列一直是困 扰基因和基因组研究，特别是关于一些长度较大的重要功能基因研究的问 题。如何克服上述缺陷是科技技术人员要解决的问题。 发明内容本发明需要解决的技术问题是提供了一种基因或核酸序列的酶切-连接 长序列半合成方法，旨在解决上述的问题。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下步骤实现的目标基因或核酸序列分析对要求合成或获得的目标序列进行分析，设计分段化学合成的片段长度、分割位点；目标基因或核酸序列的片段化学合成根据上述分析的结果，用化学 合成法合成目标基因或脱氧核糖核酸序列的片段，在合成时人为引入适当 的限制性内切酶识别位点；目标基因或核酸序列各片段的限制性酶切反应用能够识别上述位点 的限制性内切酶进行酶切反应，产生含有粘性末端的片段；目标基因或核酸序列各片段的正确连接用适当连接酶对分段合成的 基因或核酸序列的片段进行常规的酶促连接反应。与现有技术相比，本发明的有益效果是可获得10000个碱基对，目 前最长达到13000碱基对；并且错误率低、成本也低。
图1是本发明以限制性内切酶BpiI的一个实施例。请按照提示修改具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述 由图l可见目标基因或核酸序列分析对要求合成或获得的目标序列进行分析， 设计分段化学合成的片段长度、分割位点，以避免片段中含有不适当的限 制性内切酶识别位点，以及达到片段的大小适合化学合成、错误率最小和 成本最低之目的；最重要的是在化学合成前进行精确设计，使得各片段 左右两端的粘性末端均不相同，以保证各片段能够按照设计的顺序正确连 接。设计时将目标基因或合算序列分为3段进行化学合成，其中有2个拟 利用的区段，即NNNNNN/000000区段和RRRRRR/QQQQQQ区段，其 中，N、 O、 R、 Q为任意碱基，但必须符合以下原则a) N与O是互补配对碱基，R和Q是互补配对碱基；b) NNNNNN/000000区段和RRRRRR/QQQQQQ区段不完全一致；目标基因或核酸序列的片段化学合成根据上述分析的结果，用化学 合成法合成目标基因或脱氧核糖核酸序列的片段(如图1中的化学合成片 段l、 2、 3等)，在合成时人为引入适当的限制性内切酶识别位点(如图l 中的Bpi I限制性内切酶识别位点，用箭头表示)；目标基因或核酸序列各片段的限制性酶切反应用能够识别上述位点 的限制性内切酶进行酶切反应，产生含有粘性末端的片段(图1中含有粘 性末端的片段l、 2、 3等)；目标基因或核酸序列各片段的正确连接用适当连接酶对分段合成的 基因或核酸序列的片段进行常规的酶促连接反应。由于在化学合成前的精 确设计，使得各片段左右两端的粘性末端均不相同，以保证各片段能够按 照设计的顺序正确连接。以图l为例由于N与O是互补配对碱基，R和Q是互补配对碱基，所以含有粘性末端的片段l (含有粘性末端OOOO)和 含有粘性末端的片段2 (含有粘性末端NNNN)能够正确连接，而含有粘性 末端的片段2的另一端同时还含有粘性末端QQQQ，但由于粘性末端QQQQ 与片段1的粘性末端OOOO不配对，所以含有粘性末端的片段2不可能反 向连接在片段1上。其余片段的连接类推。最后，即可得到按照设计正确 连接的目的基因或核酸的全长序列。
权利要求
1. 一种基因或核酸序列的酶切-连接长序列半合成方法，是通过以下步骤实现的目标基因或核酸序列分析对要求合成或获得的目标序列进行分析，设计分段化学合成的片段长度、分割位点；目标基因或核酸序列的片段化学合成根据上述分析的结果，用化学合成法合成目标基因或脱氧核糖核酸序列的片段，在合成时人为引入适当的限制性内切酶识别位点；目标基因或核酸序列各片段的限制性酶切反应用能够识别上述位点的限制性内切酶进行酶切反应，产生含有粘性末端的片段；目标基因或核酸序列各片段的正确连接用适当连接酶对分段合成的基因或核酸序列的片段进行常规的酶促连接反应。
2. 根据权利要求1所述的基因或核酸序列的酶切-连接长序列半合成方 法，将目标基因或合算序列分为3段进行化学合成，其中有2个拟利用的区段，艮Pnnnnnn/oooooo区段和rrrrrr/qqqqqq区段，其中，n、O、 R、 Q为任意碱基，但必须符合以下原则a) n与O是互补配对碱基，R和Q是互补配对碱基；b) nnnnnn/000000区段和RRRRRR/QQQQQQ区段不完全一致。
全文摘要
本发明涉及基因或核酸序列的酶切-连接长序列半合成方法，是通过以下步骤实现的，目标基因或核酸序列分析对要求合成或获得的目标序列进行分析，设计分段化学合成的片段长度、分割位点；目标基因或核酸序列的片段化学合成根据上述分析的结果，用化学合成法合成目标基因或脱氧核糖核酸序列的片段，在合成时人为引入适当的限制性内切酶识别位点；目标基因或核酸序列各片段的限制性酶切反应用能够识别上述位点的限制性内切酶进行酶切反应，产生含有粘性末端的片段；目标基因或核酸序列各片段的正确连接用适当连接酶对分段合成的基因或核酸序列的片段进行常规的酶促连接反应；可获得10000个碱基对，最长达到13000碱基对；并且错误率低、成本也低。
文档编号C12P19/00GK101275163SQ20071003880
公开日2008年10月1日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者磊 周, 肖爱军, 赫英俊, 邵永胜 申请人:上海捷瑞生物工程有限公司