专利名称：一种β－甘露聚糖酶的基因序列及其编码的重组酶的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种β-甘露聚糖酶的基因序列，该基因编码的重组酶的制备和含有该酶的制品。具体地说，本发明涉及编码嗜碱芽孢杆菌(alkaliphilic Bacillus)N16-5的β-甘露聚糖酶DNA分子，涉及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。
β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.1.78)是一种半纤维素酶，可以水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖(参见Tipdon，R.S.et al.Advances inCarbohydrate Chemistry and Biochemistry，32299-316，AcademicPress，New York，1976.)。甘露聚糖是自然界中存在的一种较为丰富的半纤维素资源，数量仅次于纤维素。豆科植物种子、针叶树木材、绿色咖啡豆等都含有大量的甘露聚糖，一些植物胶，如田青胶、角豆胶、魔芋精粉等几乎完全是由半乳糖或葡萄糖与甘露糖组成的甘露聚糖。利用β-甘露聚糖酶对上述植物材料进行深加工和综合利用具有很大的应用潜力，特别是在食品、医药方面具有重要性应用价值，因为β-甘露聚糖酶可把植物甘露聚糖降解为甘露寡糖，甘露寡糖能促进人体肠道正常菌群的生长发育(参见Akino，T.et al.Agric.Biol.Chem.，52773-779，1988)，这对提高人体的健康水平具有重要意义。
β-甘露聚糖酶已从不同来源的的生物中分离，如芽孢杆菌、气单孢菌、黄单孢菌、梭孢菌、青霉、木霉和链霉菌等(7)。相关的专利和文献的出发点主要在于处理造纸工业中的半纤维素(参见Buchert et al.USP5,661,021 Aug.26，1997；Ratto，M.et al.Biotechnol.Letters，10661-664，1988；和Christgau et al.USP5,795,764 Aug.18，1998)，尚未有一种适合于甘露寡糖生产的β-甘露聚糖酶产品，其主要问题是酶活性复杂，底物水平低等，直接影响甘露寡糖的产率和收率。β-甘露聚糖酶水解植物甘露聚糖反应在碱性条件下进行，可以增加半纤维素在水中的溶涨性，从而有利于酶的作用。目前已知的微生物β-甘露聚糖酶最适pH一般在酸性或中性范围，日本研究的兼性嗜碱芽孢杆菌AM001，最适pH在8.5-9.0，并试图进行甘露寡糖的酶法生产，对甘露寡糖的转化率29％。另外，甘露聚糖酶基因的专利与文献报道近年来较多(参见USP5,661,021和USP5,795,764)，但很少有嗜碱菌碱性β-甘露聚糖酶基因的报道。
本发明的一个目的是提供一种β-甘露聚糖酶基因。
本发明的另一个目的是提供一种制备β-甘露聚糖酶的方法。
本发明的再一个目的是提供含有所述的β-甘露聚糖酶基因重组表达质粒和重组菌株，并将其基因表达产物用于高效生产甘露寡糖。
本发明提供了一种编码嗜碱芽孢杆菌N16-5的β-甘露聚糖酶的DNA分子，该β-甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO2。
按照本发明的DNA分子，其中，所述的DNA分子包括SEQ NO1 DNA序列。
本发明还提供了含有如上所述的DNA序列的重组表达质粒。
按照本发明的重组表达质粒，其中，所述的重组表达质粒为含有以上所述的DNA序列的重组表达质粒pMAN1和重组表达质粒pMAN2。
本发明还涉及含有如上所述的重组表达质粒的重组菌株，包括嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株，大肠杆菌JM109菌株JM109MAN1和大肠杆菌JM109菌株JM109MAN2。
按照本发明的再一个方面，本发明提供了一种制备具有酶活性的β-甘露聚糖酶的方法，包括下述步骤(1)从嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株中提取总DNA，经限制酶部分水解，得到DNA片段，将其连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含β-甘露聚糖酶基因的重组表达质粒pMAN1及重组大肠杆菌菌株JM109MAN1；(2)从重组表达质粒pMAN1分离出含β-甘露聚糖酶基因的DNA片段，再经限制酶部分水解，得到小片段DNA，将其连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含β-甘露聚糖酶基因的重组表达质粒pMAN2及重组大肠杆菌菌株JM109MAN2。
附图简要描述
图1为本发明的碱性β-甘露聚糖酶基因重组质粒pMAN1构建模式图。
图2为本发明的碱性β-甘露聚糖酶基因重组质粒pMAN2构建模式图。
图3为本发明的碱性β-甘露聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达。
图4为本发明的来自嗜碱芽孢杆菌N16-5的β-甘露聚糖酶DNA序列。
图5为本发明的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列。
下面结合附图对本发明进行详细描述。
本发明是基于本发明的发明人的下述发现而完成的嗜碱芽孢杆菌N16-5在碱性条件下产生大量碱性β-甘露聚糖酶，该酶特别适于水解植物多糖形成甘露寡糖，如酶解魔芋粉等，寡糖转化率达80％以上。
本发明从嗜碱芽孢杆菌N16-5分离得到β-甘露聚糖酶的基因，它是1479bp的DNA，其DNA序列图如图4所示(SEQ ID NO1)编码一个由493个氨基酸组成的蛋白质，其氨基酸序列图如图5所示(SEQ ID NO2)。通过常规方法获得了含有该基因的重组表达质粒，转化大肠杆菌使重组菌株表达β-甘露聚糖酶。因此本发明同时提供了一种可能性，即通过遗传工程或分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到嗜碱芽孢杆菌或其它受体菌，由嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株或其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的β-甘露聚糖酶。本发明涉及的β-甘露聚糖酶特别适合于甘露寡糖的酶解生产，也为利用魔芋多糖等为原料大量生产甘露寡糖提供了一种可能。
本发明涉及的β-甘露聚糖酶特别适合于甘露寡糖的酶解生产，为建立利用魔芋多糖等为原料，大量生产甘露寡糖的工艺，提供了一种可能。
为达到本发明的目的，制备本发明的β-甘露聚糖酶及其重组表达质粒和重组菌株的方法包括如下步骤(1)从嗜碱芽孢杆菌N16-5中提取总DNA，经限制酶部分水解，得到DNA片段，连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pMAN1及重组大肠杆菌菌株JM109MAN1；(2)从重组质粒pMAN1分离出含β-甘露聚糖酶基因的DNA片段，再经限制酶水解，获得小片段DNA，连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pMAN2及重组大肠杆菌JM109MAN2。
在可使上述β-甘露聚糖酶基因表达的条件下培养该重组菌，在含有β-甘露聚糖的培养基上，菌落周围形成透明圈，证明该重组菌表达β-甘露聚糖酶活性。该蛋白质具有甘露聚糖酶活性，pI为4.3，最适pH9.5，最适温度70℃，可高效水解植物甘露聚糖产生寡糖。测序表明，该酶结构基因是1479bp的DNA，编码一个由493个氨基酸组成的蛋白质。
上述基因的表达产物，水解魔芋精粉，进行寡糖转化。底物浓度5-15％，反应温度40-60℃，反应pH 9-10，时间8-24小时，反应结束后，以醋酸，柠檬酸或盐酸调pH至5-6，加0.5-2％粉末或颗粒状活性炭脱色。过滤即可得到甘露寡糖糖浆。寡糖转化率80％以上，总收率70％以上，其中2-8糖占总糖的80％以上，该寡糖对于促进体内双歧杆菌的生长、提高人体健康水平具有重要作用。
本发明涉及的β-甘露聚糖酶是一新型的β-甘露聚糖酶。根据酶的氨基酸序列相似性，目前已知的β-甘露聚糖酶分属于糖苷水解酶第5和26两个家族(参见Ethier，N.et al.Appl.Environ.Microbiol.644428-4432，1998)。通过对本发明涉及的β-甘露聚糖酶基因推导的氨基酸序列比较分析，本发明涉及的β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族中的一员，与其它已报道的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列相比，相似性小于60％。
本发明涉及的β-甘露聚糖酶的性能不同于已知的β-甘露聚糖酶，其最适pH和温度，在迄今发现的β-甘露聚糖酶中是最高的。本发明提供了利用常规方法获得此新型的β-甘露聚糖酶的结构基因、重组表达质粒和重组菌体模式，使本发明的β-甘露聚糖酶由其它菌株或在其它培养条件产生。同时，本发明提供了一种以魔芋精粉为原料，酶解生产甘露寡糖的有效方法，对甘露寡糖的转化率可达80％。
本发明β-甘露聚糖酶具有如下特征(1)由嗜碱芽孢杆菌N16-5或其衍生菌产生，衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株；
(2)具有图4所示的DNA序列编码；(3)具有图5所示的氨基酸序列；(4)其特性至少有下述的一种1)具有甘露聚糖酶活性，pI为4.3，最适pH9.0，最适温度70℃，分子量51000道尔顿；2)具有甘露聚糖酶活性，pI为2.5，最适pH10.0，最适温度70℃，分子量38000道尔顿；3)具有甘露聚糖酶活性，pI为2.5，最适pH9.0，最适温度70℃，分子量34700道尔顿；(5)可高效水解植物多糖产生寡糖。
进一步地，本发明涉及一DNA分子，该DNA分子编码本发明涉及的β-甘露聚糖酶，此DNA核苷酸序列(1)由图4所示的DNA序列可编码部分组成；(2)编码一蛋白质，其氨基酸序列如图所示的氨基酸序列。
下面通过实施例对本发明进行进一步详细的说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。实施例1嗜碱芽孢杆菌N16-5总DNA的提取采用从中国内蒙乌杜淖碱湖分离的嗜碱芽孢杆菌N16-5，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mMEDTA(pH8.0)，混匀后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。实施例2β-甘露聚糖酶基因的克隆取前面所述的总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶EcoRI部分水解，经琼脂糖凝胶电泳，得到2-10kbDNA片段。取2μl(5μg)EcoRI酶解DNA片段与1μl(1μg)经EcoRI酶解的质粒pUC19DNA在20μl连接体系进行连接反应，其中含2μl(10X连接缓冲液)，1μlT4DNA连接酶，14μl水。连接体系在16℃反应16小时，转化感受态大肠杆菌JM109后，涂于含Amp(氨苄青霉素)，IPTG和X-gal的LB固体培养基上。37℃培养16-18小时，挑取白斑于含Amp和甘露聚糖的液体培养基或含Amp和甘露聚糖的固体培养基，37℃培养18-20小时，能够液化甘露聚糖或在含有β-甘露聚糖的固体培养基上形成透明圈的菌落，确定为阳性克隆(见图3)。对阳性菌落用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片段插入质粒，其大小约为8.0kb。含该DNA片段的重组质粒称为pMAN1(见
图1)，含此重组质粒pMAN1的重组大肠杆菌称为大肠杆菌JM109MAN1。
此重组质粒pMAN1可高频转化大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜碱芽孢杆菌N16-5的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，证实重组质粒pMAN1中插入的DNA片段来自嗜碱芽孢杆菌N16-15的染色体DNA。实施例3β-甘露聚糖酶基因的亚克隆和序列取10μ1的质粒pMAN1中的插入DNA片断在50μl体系中，进行各种限制酶酶解反应，如AccI、HindIII、PstI、EcoRI和XbalI等的单或双酶切反应，37℃保温1.5小时，琼脂糖凝胶电泳纯化回收DNA片段。如前所述方法，将得到的单一或双酶解DNA片段连接到质粒pUC19DNA或pGEM-4Z，形成一系列亚克隆质粒，转化感受态大肠杆菌JM109，相应地获得一系列重组大肠杆菌，培养后测其酶活，结果显示含有HincII酶切DNA片段的重组大肠杆菌具有甘露聚糖酶活性，该HincII酶切DNA片段约为3.5kb。含该DNA片段的重组质粒称为pMAN2(见图2)，含此重组质粒pMAN2的重组大肠杆菌称为大肠杆菌JM109MAN2。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果见图4，HincII酶切DNA片段全长3419bp，含有一个长1479bp的开放阅读框架(ORF)，由ATG起始密码子开始，到ATT终止密码子结尾。该完整的ORF编码一个由492个氨基酸组成的蛋白质。实施例4.重组β-甘露聚糖酶的纯化和特性重组菌 E.coli JM109MAN2的菌体悬于10mM甘氨酸缓冲液(pH9.6)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组β-甘露聚糖酶的粗酶液。此上清酶液经DEAE-Sephadex A-25离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组β-甘露聚糖酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为51000道尔顿，与理论上推算的分子量(54000道尔顿)相近；用PAGEIEF测得的重组酶的等电点pI为4..3；重组酶反应的最适pH为9..5，最适温度为70℃。高压液相色谱法测得重组β-甘露聚糖酶水解魔芋粉产生2-8糖等一系列寡糖。实施例5重组β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉进行寡糖转化2.5L反应器中装1.8L水，升温至55℃，加入Na2CO34.8克，NaHCO33克，β-甘露聚糖酶1.8×104单位，魔芋粉180克。55℃保温16小时。用HCl调pH至5.5-6.0，加入颗粒状活性炭10克，升温至100℃并保持5分钟，冷却至70℃进行过滤(普通工业滤布)，所得产物中2-8糖占总糖的80％以上，寡糖转化率80％以上，收率70％以上(表1)。
表1，甘露寡糖组份变化(克/100ml)时间(h)总糖 寡糖 2-6糖转化率09.4 // 049.2 1.72546％ 19％89.7 6.89470％ 71％169.6 8.17881％ 85％
权利要求
1.编码嗜碱芽孢杆菌N16-5的β-甘露聚糖酶的DNA分子，该β-甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO2。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于该分子包括SEQ NO1 DNA序列。
3.含有权利要求1所述的DNA序列的重组表达质粒。
4.如权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于该重组表达质粒为含有权利要求1所述的DNA序列的重组表达质粒pMAN1和含有 1所述的DNA序列的重组表达质粒pMAN2。
5.含有权利要求3所述的重组表达质粒的重组菌株。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于所述的菌株包括嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株，大肠杆菌JM109菌株JM109MAN1和大肠杆菌JM109菌株JM109MAN2。
7.一种制备具有酶活性的β-甘露聚糖酶的方法，包括下述步骤(1)从嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株中提取总DNA，经限制酶部分水解，得到DNA片段，将其连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含β-甘露聚糖酶基因的重组表达质粒pMAN1及重组大肠杆菌菌株JM109MAN1；(2)从重组表达质粒pMAN1分离出含β-甘露聚糖酶基因的DNA片段，再经限制酶部分水解，得到小片段DNA，将其连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含β-甘露聚糖酶基因的重组表达质粒pMAN2及重组大肠杆菌菌株JM109MAN2。
全文摘要
本发明公开了由嗜碱芽孢杆菌(alkaliphilicBacillus)N16－5总DNA获得的碱性β－甘露聚糖酶基因(β－mannanase gene)及其制备方法,构建了原核表达质粒,转化大肠杆菌表达β－甘露聚糖酶。通过核苷酸序列和氨基酸序列比较,该酶为一新型β－甘露聚糖酶。以该酶水解魔芋精粉等产生一系列寡糖,寡糖的总转化率为80%以上,由此生产的甘露寡糖在功能食品上具有重要的应用价值。
文档编号C12N9/42GK1351169SQ0013006
公开日2002年5月29日 申请日期2000年10月26日 优先权日2000年10月26日
发明者马延和, 薛燕芬, 刘洪灿, 周培瑾 申请人:中国科学院微生物研究所