活性增强的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种活性增强的酮还原酶突变体，其源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，具有中E9R、S42Q、T190L、E234M的一个或多个突变。本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2-20倍；且本发明反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；此外本发明反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。
【专利说明】活性增强的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酮还原酶，本发明涉及酮还原酶突变体及其制备方法，特别涉及一种源于木兰假丝酵母的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法
【背景技术】
[0002]阿托伐他汀钙(商品名LIPIT0R由辉瑞公司销售)、罗苏伐他汀钙(商品名CREST0R由阿斯利康公司销售)以及匹伐他汀(商标名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本销售)，是重要的降胆固醇他汀类药物。而手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯是这些重要的他汀类药物的关键的手性中间体。国内2009年该中间体的产量为400吨，预计未来几年内，国内产量将达到1000吨以上，直接经济效益在数亿元。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，得率低，成本高，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。采用酶法制备及手性(S) -4-氯-3-羟基-丁酸乙酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性很较低，使用10g/L粗酶粉20小时仅可转化lg/L的酮底物，也使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。
[0003]木兰假丝酵母(Candida magnoliae)中天然存在的野生型酮还原酶,能将4_氯乙酰乙酸乙酯(COBE)转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是供一种活性增强的酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-20倍
[0005]实现本发明目的的技术方案是:本公开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与木兰假丝酵母(Candida magnoliae)产生的野生型酮还原酶(SEQ ID NO:2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型KRED酮还原酶”指由源自木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的野生型酮还原酶基因SEQ ID NO:1编码的，并具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酮还原酶。该酶可将4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物(例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物(例如S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)转化率增加的酮还原酶。
[0006]本发明提供一种酮还原酶突变体,其源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的野生型酮还原酶，能够将4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。所述酮还原酶突变体，与SEQ ID N0.2的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。
[0007]上述酮还原酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变:E9R，S42Q，T190L，E234M。
[0008]上述酮还原酶突变体，优选自序列SEQ ID N0.4。全长突变的酮还原酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段)诸如通过助溶标签(如SUMO蛋白)、纯化标签(如结合金属的His标签)和细菌定位信号(如分泌信号)的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。
[0009]上述酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-20倍。
[0010]本发明提供一种编码酮还原酶酶突变体的基因，其优选自SEQ ID N0.3，其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。
[0011]本发明提供一种重组质粒，其源自SEQ ID N0.5，比PET系列及PQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacUV5操纵子、大肠杆菌trp操纵子、大肠杆菌tac操纵子等。
[0012]本发明提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达酮还原酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过recombineering重组工程使载体整合到基因组中。
[0013]本发明提供一种制备酮还原酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤:(a)采用木兰假丝酵母构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备酮还原酶突变体。
[0014]所述步骤(a)为将来自木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQ ID NO:I)进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到改进后的表达载体(SEQ ID N0.5)的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DHl中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为:
[0015]F:5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTC 3’；
[0016]R:5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTACGGCAGGGTGTAACCAC 3’。
[0017]类似的，将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到改进后的表达载体(SEQ ID N0.5)的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DHl中。
[0018]所述步骤(c)为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌DHl单菌落接种于1ml高压灭菌后的第一培养基中:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 8/1，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁
0.027 g/L,甘油5g/L,葡萄糖0.8g/L,灭菌后添加氨节青霉素至100mg/L。30°C,250rpm过夜培养。次日取IL三角瓶，按1:100的接种比例接入到10ml高压灭菌后的第二培养基中:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氢二钠3.55 g/L,磷酸二氢钾3.4 g/L,氯化铵2.68 g/L,硫酸钠0.71 g/L,七水硫酸镁0.493 g/L,六水氯化铁0.027 g/L,甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30°C中培养至菌体OD 5-6,立刻将三角瓶置于25°C摇床中，250rpm培养lh。加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25°C，250rpm继续培养12h。
[0019]本发明具有积极的效果:(1)本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了 2-20倍，利用该酶可生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯制备
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；(2)本发明反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；(3)本发明反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保，因此利用本发明研究开发的节能减排、环境友好的高新生物技术生产药物手性中间体，具有非常广阔的市场前景。
【具体实施方式】
[0020](实施例1)
[0021]野生型及酮还原酶突变体表达载体的构建
[0022]将来自木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQ ID NO: I)进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到改进后的表达载体(SEQ ID N0.5)的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DHl中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为:
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[0024]R:5’ AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTACGGCAGGGTGTAACCAC 3’ 。
[0025]类似的，将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到表达载体(SEQID N0.5)的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DHl中。
[0026]酮还原酶突变体的制备
[0027]挑取含有目的表达载体的大肠杆菌DHl单菌落接种于1ml高压灭菌后的培养基中:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氢二钠3.55 g/L,磷酸二氢钾3.4 g/L,氯化铵2.68 g/L,硫酸钠0.71 g/L,七水硫酸镁0.493 g/L,六水氯化铁0.027 g/L,甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。30°C，250rpm过夜培养。次日取IL三角瓶，按1:100的接种比例接入到10ml高压灭菌后的培养基中:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30°C中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25°C摇床中，250rpm培养lh。加入IPTG至终浓度0.1mM,并于25°C，250rpm继续培养12h。
[0028]培养结束后，将培养液于4°C，6000g下离心30min最终得到湿菌体2.6g。然后将沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。再次用蒸馏水重悬，在超声破碎仪下破碎至澄清。破碎后于4°C，12000g下离心30min，收集上清，预冷至_70°C后用冷冻干燥机制备冻干粉。最终得到粗酶冻干粉0.41g。
[0029]酮还原酶活性的测定
[0030]由于NADPH在340nm处有吸收峰，而NADP在340nm处无吸收峰，故可通过检测反应过程中NADPH吸光值的变化，而计算酮还原酶的活性。酮还原酶活力测定体系为:2ml反应体系中，依次加入0.5ml 10mM pH7.0 PBS缓冲液，加入终浓度0.2mM NADPH，2mM 4-氯乙酰乙酸乙酯，加双蒸水补至1.9ml，充分混匀后置于25°C水浴中。将实施2中制备的酮还原酶干粉按适当的比例稀释后，取10ul加入反应体系中，混匀后于340nm处检测每分钟的吸光度变化值。参照NADPH标准曲线计算酮还原酶的酶活。单位酶活(U)定义为每分钟生成lymol NADP所需要的酶量。用同样方法检测野生型酮还原酶的酶活。根据检测的结果计算得到改进后的酮还原酶突变体比野生型酮还原酶酶活提升至少12.5倍。
[0031]以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0032]序列表
[0033]<110>南京朗恩生物科技有限公司
[0034]〈120〉活性增强的酮还原酮及其编码序列
[0035]〈130〉2013
[0036]〈160〉4
[0037]〈170〉PatentIn vers1n 3.3
[0038]〈210〉I
[0039]〈211〉852
[0040]〈212〉DNA
[0041]〈213〉木兰假丝酵母(Candida magnoliae)
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[0189]gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcaggggataacgcagga1500
[0190]aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggccgcgttgctg1560
[0191]gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacgctcaagtcag1620
[0192]aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctggaagctccctc1680
[0193]gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctttctcccttcg1740
[0194]ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggtgtaggtcgtt1800
[0195]cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctgcgccttatcc1860
[0196]ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccactggcagcagcc1920
[0197]actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagttcttgaagtgg1980
[0198]tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctctgctgaagcca2040
[0199]gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccaccgctggtagc2100
[0200]ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatctcaagaagat2160
[0201]cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacgttaagggatt2220
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[0207]gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctattaattgttgc2580
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[0210]cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttagctccttcggt2760
[0211]cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggttatggcagca 2820
[0212]ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgactggtgagtac2880
[0213]tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttgcccggcgtca 2940
[0214]atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcattggaaaacgt3000
[0215]tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttcgatgtaaccc3060
[0216]actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttctgggtgagca 3120
[0217]aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaaatgttgaata 3180
[0218]ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattgtctcatgagc3240
[0219]ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcgcacatttccc3300
[0220]cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaacctataaaaat3360
[0221]aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac3390
【权利要求】
1.一种活性增强的酮还原酶突变体，其源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯，具有以下特征中的一个或多个突变:E9R，S42Q, T190L, E234M。
2.根据权利要求1所述的活性增强的酮还原酶突变体，其特征在于:序列为SEQIDN0.4。
3.根据权利要求1或2所述的活性增强的酮还原酶突变体，其特征在于:其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-20倍。
4.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-3中任一项所述的重组多肽。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于:序列为SEQID N0.3。
6.—种重组质粒,其包括表达载体连接权利要求5所述的多核苷酸，所述载体序列为SEQ ID N0.5。
7.—种宿主细胞，其包含权利要求6所述的重组质粒。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于:所述细胞是大肠杆菌，为大肠杆菌W3110、DHlJP JM109 中的一种。
9.根据权利要求7或8所述的宿主细胞，其特征在于:所述重组质粒的密码子已经为在所述宿主细胞中表达而进行了优化。
10.一种如权利要求1、所述活性增强的酮还原酶突变体的制备方法，包括以下步骤:(a)采用木兰假丝酵母构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因，所述宿主细胞，为大肠杆菌W3110，DHlJP JM109中的一种；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备酮还原酶突变体。
11.根据权利要求10所述活性增强的酮还原酶突变体的制备方法，其特征在于:所述步骤(c)为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于1ml高压灭菌后的第一培养基中，30°C，250rpm过夜培养；次日取IL三角瓶，按1:100的接种比例接入到10ml高压灭菌后的第二培养基中，于30°C中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25°C摇床中，250rpm培养lh，加入IPTG至终浓度0.1mM,并于25°C，250rpm继续培养12h。
12.—种生产他汀类药物的关键的手性中间体的方法，包括在与权利要求1-3任一项所述的酮还原酶突变体的存在下，将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
【文档编号】C12N15/53GK104342411SQ201310321129
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月26日 优先权日:2013年7月26日
【发明者】丁雪峰 申请人:南京朗恩生物科技有限公司