专利名称：海芋凝集素蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物凝集素蛋白基因的克隆及其应用，特别是涉及海芋凝集素蛋白基因的cDNA序列及其编码的蛋白质序列。本发明进一步涉及海芋凝集素基因在植物抗虫基因工程的应用。
背景技术：
植物凝集素是指含有至少一个非催化结构域的并能可逆结合到特异单糖或寡糖的植物蛋白。
植物凝集素没有共同的结构特性。多数凝集素含共价结合的糖分子，属糖蛋白。凝集素分子中糖类的组成与其它糖蛋白相似，主要是甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、唾液酸，少量凝集素含有木糖、阿拉伯糖。有些凝集素不含共价结合的糖。多数凝集素分子的蛋白质部分含有较高的天冬氨酸、丝氨酸和苏氨酸，占总氨基酸含量的30％，而含硫氨基酸少或甚至完全没有。凝集素分子量相差很大，从几万至数十万。很多凝集素有聚集倾向，受溶液pH、温度等的影响。
植物凝集素是一类具高度特异性糖类结合活性的蛋白，这是它们区别所有其它植物蛋白的标志。其糖结合特异性性有以下几个特点1，凝集素可以特异结合的糖类的范围是非常大的。2，不同结构的凝集素可能识别相同的糖类。植物凝集素的糖结合特异性主要由结合位点的三维结构决定。3，大多数凝集素对寡糖具有更高的亲和力。4，多数凝集素的特异性通常不是针对植物细胞的糖分子，而常常是微生物或害虫的内表面或外表面的聚糖。5，具有较好的稳定性。特别是那些参与植物抗性机制的凝集素。它们大多数不会被动物或昆虫胃肠的蛋白酶所降解，在很大的pH范围内稳定，热稳定性强。
植物凝集素的生理功能主要有1.防御病原体入侵、2.在共生固氮中的作用、3.在细胞粘着中的作用、4.介导胞饮作用、5.在病原菌感染宿主巨噬细胞吞噬中的作用、6.在种子成熟和萌发过程中发挥作用、7.抗虫性。
植物凝集素分布广泛，高等植物中约有14％含有植物凝集素，在蝶形花科中比例高达43％，禾本科中比例达12％，目前已从豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科、石蒜科等植物中共发现1000多种植物凝集素，其中豆科植物凝集素达600多种，其种子内的植物凝集素含量最高，达种子蛋白质总含量的10％左右。
从进化与结构相关性分类，植物凝集素大致可以分成7个不同的家族1.豆科凝集素；2.单子叶植物甘露糖结合凝集素，主要存在于石蒜科、天南星科、兰科、百合科、凤梨科这五个科中；3.包含Hevin结构域的壳多糖结合蛋白；4.2型核糖体失活蛋白；5.葫芦科韧皮部凝集素；6木菠萝素家族；7苋科凝集素。
海芋凝集素经初步实验结果表明，对各类蚜虫、菜粉蝶、菜青虫等有一定的胃毒作用，其中对豆蚜效果比较好。另外还对豆蚜的生长发育具有抑制作用和影响生殖作用，并抑制豆蚜蜜露分泌行为。其作用机理可能是海芋凝集素被昆虫取食后，在消化道内与消化液蛋白酶等结合(蛋白质大多含有糖链，故凝集素能与其结合)，抑制后者的酶活力，使其不能有效地分解蛋白质，使昆虫营养来源受阻，最终引起昆虫死亡。
植物基因工程运用最新的分子生物学研究进展，和先进的基因工程技术将相关的基因，如抗虫、抗病、抗旱、耐盐碱等的基因，转导入植物体内，并使之得以表达。目前成功地将雪花莲凝集素GNA(Galanthus Nivalisagglutinin)基因转导到烟草、马铃薯、水稻、棉花和番茄上，取得了显著的社会经济效益。
关于植物凝集素基因的克隆，通过NCBI中的基因数据库(Genbank)，可以搜索到388条有关植物凝集素的基因序列。
海芋中仅克隆出它的蛋白酶抑制剂基因，在本发明申请之前还没有海芋凝集素蛋白基因克隆的任何报道。
本发明目的是从海芋中克隆出凝集素蛋白基因，为海芋凝集素运用到转基因抗虫作物上，工厂化生产，及医学研究和相关运用上提供分子基础和条件。
发明内容
本发明提供的海芋凝集素蛋白基因是从海芋组织(植株)中以RACE PCR方法分离得到的，其特征为(1)具有序列表中序列1的核苷酸(cDNA)序列，其中第1～63位碱基为含有启动子调控元件和5’端非凝集素翻译区的序列，第64～873位碱基为开放读码框(ORF)，第874～1124位碱基为3’端非凝集素翻译区的序列。
(2)编码序列表中序列2所示的氨基酸多肽序列，该序列由270个氨基酸残基组成，具有前后二个甘露糖特异结合的三维功能结构域，一个结构域由Gln(谷氨酰胺Q)，Asp(天冬氨酸D)，Asn(天冬酰胺N)，Val(缬氨酸V)，Tyr(酪氨酸Y)五个氨基酸构成的。其中构成前一个结构域的五个AA的位置分别为Gln51、Asp53、Asn55、Val57、Tyr59，后一个的为Gln170、Asp172、Asn174、Val176、Tyr178。海芋凝集素的生物学特性主要表现为可逆地特异结合甘露糖，从而使昆虫产生厌食反应导致最终死亡。
(3)具有系列表中序列1的核苷酸序列(cDNA sequence)；或与序列1的第64～873位碱基序列中连续100个碱基以上的区域有95％以上的同源性，具有编码与序列2同等的功能蛋白质的核苷酸序列。
(4)编码海芋凝集素前体蛋白的氨基酸多肽序列，该多肽具有序列表中序列2所示的序列；或编码具有同等功能的由序列2衍生的多肽序列，或其保守性变异多肽，或其活性片段。
据本发明提供的海芋凝集素蛋白基因序列信息，序列1，序列2，本领域技术人员可以通过以下方法轻易地获得与海芋凝集素蛋白AML等同的基因。
①用AML基因片段为探针筛选海芋的基组文库获得；②根据AML基因序列信息设计寡核苷酸引物(含简并性引物)，用PCR扩增方法从海芋的基因组获得；③在AML基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；④用化学合成的方法获得。
本发明所述的术语AML等同基因，是定义为与AML基因的核苷酸序列或氨基酸序列相比有一个或若干个核苷酸或氨基酸残基的差异，包括碱基或氨基酸残基的改变、缺乏、或插入，或与AML基因序列中的连续100个碱基以上的区域有95％以上的同源性，且其基因表达产物的功能与AML表达产物的功能相同。
因此，本发明提供的AML基因还包括AML等同基因，它们为下列核苷酸序列之一，或编码下列氨基酸多肽序列之一的核苷酸序列(1)将序列1的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺乏或添加，具编码与序列2等同功能蛋白质的衍生核苷酸序列；(2)与序列1的第64～873位碱基序列中连续100碱基以上的区域具有95％以上的同源性，且编码与序列2等同的核苷酸序列；(3)将序列2的氨基酸多肽序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺乏或添加，且具有与序列2同等功能的衍生氨基酸多肽序列，或其保守性变异多肽，或其活性片段。
本发明提供的AML基因具有重要的应用价值。应用之一是将所述的AML构建植物转化载体，用任何一种转化方法将AML基因导入棉花或其它植物细胞，可获得能表上所述基因的转基因作物，从而达到抗虫效果。
本发明提供的AML基因的另一个应用是将该基因转化到表达载体，并使之表达产生相应的蛋白，之后将表达蛋白应用到农业、医学或其它方面。
本发明可产生巨大的经济、社会效应。将本发明克隆的基因转化到植物中，则可使作物产生明显的抗虫作用，特别是对刺吸式口器类害虫。从而减少农药的施用，减少农药对环境、生态及整个人类产生的不良影响。
以下结合实施例和附图对本发明提供的海芋凝集素蛋白基因的克隆过程，基因功能分析，以及应用途径作具体说明。
图1为AML蛋白基因的5’Race-PCR扩增产物的电泳检测图。图中M表示2000bp的Marker，泳道1为以W4236为引物的5’Race-PCR产物，约为700bp，泳道2为以W4237为引物的5’Race-PCR产物，约为600bp。
W42365’-GCCGTTGCCGTGGGTGTTGGACTGCCA-3’ (27bp)W42375’-TGCCGTCGCCGTAGAGGACCTG-3’ (22bp)
图2为AML蛋白基因的5’Race-PCR扩增产物与pMD 18-T vector载体重组质粒的单双酶切产物的电泳检测图。图中M表示λ-HindIII digest。
1.1、1.2分别为pUC18空质粒用EcoRI、HindIII的单酶切产物、1.3为双酶切产物2.1、2.2分别为图4.8中的重组质粒1用EcoRI、HindIII的酶切产物2.3为双酶切产物3.1、3.2分别为图4.8中的重组质粒2用EcoRI、HindIII的酶切产物3.3为双酶切产物图3为AML蛋白基因的3’Race-PCR扩增产物的电泳检测图。图中M表示2000bp的Marker，泳道1为以W2989为引物的3’Race-PCR产物，约为600bp，泳道2为以W2986为引物的3’Race-PCR产物，约为770bp，泳道3为以W2987为引物的3’Race-PCR产物，约为800bp。
W29865’-ACTACGCCGCCGTCSTCCATCCGGA-3’ (25bp)(S为G或C)W29875’-TCTACGGCCCATCCGTCTTCAAGA-3’ (24bp)W29895’-TGGCAGTCCAACACCCACGGCAACG-3’ (25bp)图4为AML蛋白基因的3’Race-PCR扩增产物与pMD 18-T vector载体重组质粒的单双酶切产物的电泳检测图。图中M表示λ-HindIII digest。1.1、1.2分别为pUC18空质粒用EcoRI、HindHI的单酶切产物、1.3为双酶切产物2.1、2.2分别为图4.7中的重组质粒2用EcoRI、HindIII的酶切产物、2.3为双酶切产物3.1、3.2分别为图4.7中的重组质粒3用EcoRI、HindIII的酶切产物、3.3为双酶切产物图5为AML基因全长序列的RACE-PCR产物电泳图。图中M表示2000bp的Marker，泳道1、2为以W6045为引物的3’Race-PCR产物的两个重复，约为1150bp。
W60455’-GATCACGGCGAAGAAGAGGTGT-3’ (22bp)实施例1、海芋凝集素蛋白基因(AML)3’端序列的克隆本发明用RACE PCR发克隆AML基因的3’端序列。首先检索Genbank和相关文献，搜索到与海芋近缘的天南星科下的其它三种植物的五种凝集素或类似蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，将五者进行排列分析，找出其中保守性高的三段区域用来设计3’RACE PCR必需的基因特异性引物(GSP)，然后进行3’RACE PCR扩增获得3’端序列片段，再将PCR产物直接与pMP 18-T vector载体相连，转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过含AMP的LB平板来进行抗性筛选重组质粒，从平板上挑选单菌落摇瓶培养，提取重组质粒后进行单双酶切反应加电泳检测，用到的两种酶分别为E10RI和HindIII，将双酶切产物中含有目的片段的重组质粒进行测序。
2、AML基因5’端序列的克隆本发明运用RACE PCR法克隆AML基因的5’端序列。基本原理和操作过程与3’端RACE PCR相同。但它只在保守性高的二段区域设计二条GSP进行反应。
3、AML基因的全长序列的获得和克隆在完成3’和5’测序后，将两端序列通过中间的重迭部分进行拼接合并，从而获得全长序列。从5’端起始部分选取22个碱基合成引物，作为克隆全长序列的RACE PCR所需的基因特异性引物。将RACE PCR产物进行电泳检测，结果表明长度大小正好和拼接获得的全长序列相符。
4、由所得的全长cDNA序列，通过用几种不同的翻译(工具)软件如primer premier 5.0、DNA sis V2.5、ExPASy网站中的translate，从cDNA推倒出氨基酸序列。海芋凝集素的氨基酸序列包含270个氨基酸，其中包括前后两个甘露糖特异结合的结构域，由Gln(谷氨酰胺)，Asp(天冬氨酸)，Asn(天冬酰胺)，Val(缬氨酸)，Tyr(酪氨酸)五个氨基酸组成。
海芋凝集素蛋白基因cDNA and AA sequence电子文件<110>华南农业大学<120>海芋凝集素素cDNA和AA序列<160>2<210>1<211>1124<212>DNA<213>海芋(Alocasia macrorrhiza(L.)Schott)<220>
<221>cDNA sequence<222>(1)...(1124)<220>
<221>CDS<222>(64)...(876)<400>1gatcacggcg aagaagaggt gttagggttt tgaatttagt agctagcagc aaccccattc 60ctc atg gcc aag ctc ctc ctc ttc ctc ctc ccg gcc att ctc ggc ctc ctc gtt cct cgg 120Met Ala Lys Leu Leu Leu Phe Leu Leu Pro Ala Ile Leu Gly Leu Leu Val Pro Arg 19tca gcc acg gca ata ggc atc aac tac ctg ctg tcc gga gaa acc ctg gac acg aac ggc 180Ser Ala Thr Ala Ile Gly Ile Asn Tyr Leu Leu Ser Gly Glu Thr Leu Asp Thr Asn Gly 39cat ctc agg aac ggc aac ttc gac ttg gtc atg cag gag gac tgc aac gcc gtc ctg tac 240His Leu Arg Asn Gly Asn Phe Asp Leu Val Met Gln Glu Asp Cys Asn Ala Val Leu Tyr 59aat ggc ggt tgg cag tcc aac acg gcc aac aga gga cga gac tgc aag ctc tcc ctg acc 300Asn Gly Gly Trp Gln Ser Asn Thr Ala Asn Arg Gly Arg Asp Cys Lys Leu Ser Leu Thr 79gac tac ggc gaa ctc gtc atc aaa aat ggc gac gga tcc act gtc tgg agg agc ggt tcc 360Asp Tyr Gly Glu Leu Val Ile Lys Asn Gly Asp Gly Ser Thr Val Trp Arg Ser Gly Ser 99cag tcc gac aag ggc aag tac gcc gcc gtc gtc cat ccg gat ggg agg ctg gtc gtc tac 420Gln Ser Asp Lys Gly Lys Tyr Ala Ala Val Val His Pro Asp Gly Arg Leu Val Val Tyr 119ggg cca tcc gtc ttt aat att aat ccc tgg gtc ccc ggc ctc aac agc ctg cgg ctc ggc 480Gly Pro Ser Val Phe Asn Ile Asn Pro Trp Val Pro Gly Leu Asn Ser Leu Arg Leu Gly 139aac atc ccc ttc aca agc aac atg ctc ttc tcc gaa caa gtc ctc tac gaa gac ggc agg 540Asn Ile Pro Phe Thr Ser Asn Met Leu Phe Ser Glu Gln Val Leu Tyr Glu Asp Gly Arg 159
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权利要求
1.一种分离得到的海芋凝集素蛋白基因，其特征在于(1)具有序列表中序列1的核苷酸序列，其中第1～63位碱基为含有启动子调控元件和5’端非凝集素翻译区的序列，第64～873位碱基为开放读码框(ORF)，第874～1124位碱基为3’端非凝集素翻译区的序列；(2)编码序列表中序列2所示的氨基酸多肽序列，该序列由270个氨基酸残基组成，具有前后二个甘露糖特异结合的三维功能结构域；(3)具有系列表中序列1的核苷酸序列或与序列1的第64～873位碱基序列中连续100个碱基以上的区域有95％以上的同源性，具有编码与序列2同等的功能蛋白质的核苷酸序列；(4)编码海芋凝集素前体蛋白的氨基酸多肽序列，该多肽具有序列表中序列2所示的序列；或编码具有同等功能的由序列2衍生的多肽序列，或其保守性变异多肽，或其活性片段。
2.根据权利要求1所说的基因，其特征在于所编码的氨基酸多肽序列含有由5个氨基酸残基重复单位PPR组成的功能结构域，该结构域由Gln(谷氨酰胺Q)，Asp(天冬氨酸D)，Asn(天冬酰胺N)，Val(缬氨酸V)，Tyr(酪氨酸Y)五个氨基酸构成的，其中前一个的五个AA位置分别为Gln51、Asp53、Asn55、Val57、Tyr59，后一个为Gln170、Asp172、Asn174、Val176、Tyr178。
3.一种分离得到的海芋凝集素蛋白基因，其特征在于将基因或含有基因的载体转化棉花或其它植物，培养能表述所说基因的转基因作物，从而具有抗虫作用。
全文摘要
本发明提供了一个来源于海芋的凝集素蛋白的核苷酸(cDNA)序列及其编码的氨基酸(AA)多肽序列。该基因属于甘露糖结合凝集素基因家族的成员，为一个组成型表述的基因。本发明还涉及用该基因转化棉花或其它植物，将该基因序列运用到医学或其它方面。
文档编号C12N15/29GK1537943SQ0313995
公开日2004年10月20日 申请日期2003年7月28日 优先权日2003年7月28日
发明者侯学文, 朱亚然, 王捷, 潘科 申请人:华南农业大学