专利名称：一个具有双抗虫基因的植物表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属植物抗虫基因工程领域，涉及用化学方法合成了苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体蛋白CrylAc基因中编码完全活化了的杀虫蛋白的基因片段，以下简称Bt基因；在Bt基因的末端加上合成的具有内质网定位功能的多肽编码序列而形成嵌合Bt基因BtS29K，这种结构有利于提高Bt杀虫蛋白的稳定性，也有利于与蛋白酶抑制剂基因一起构建双抗虫基因表达载体；采用DNA重组技术将嵌合Bt基因与慈姑蛋白酶抑制剂的融合基因构建成双抗虫基因(或称为双价抗虫基因)的植物表达载体。用这些载体通过对植物的遗传转化获得高效抗虫转基因植物。
苏云金芽孢杆菌(Bt)的晶体蛋白可作为生物农药特异地毒杀某些昆虫，该晶体蛋白被昆虫摄取后，在昆虫肠道的碱性条件下溶解产生130KD左右的前毒素分子。经肠道蛋白酶水解前毒素的C端被降解，最后产生由N端65-70KD组成的毒蛋白。该毒蛋白的N端一段残基(就CrylA而言为28个)也要被肠蛋白酶加工去掉才能形成完全活化的毒蛋白。活化的毒蛋白与敏感昆虫中肠上皮细胞上的受体结合，插入到中肠细胞膜上形成0.5-1.0nm的小空或离子通道，引起胞内离子的外渗及水的内渗，结果细胞溶涨破裂，大量细胞遭到破坏，使幼虫停止进食而死亡。已证明Bt晶体蛋白对人体无毒性作用，所以Bt制剂已作为一种无公害的天然的微生物杀虫剂在农业、林业及环境卫生等方面应用了近五十年，Bt制剂的产量也在逐年增加。但由于在自然条件下Bt晶体蛋白稳定性差，不能渗透到组织内部以及杀虫谱窄等因素的限制使该生物杀虫剂的发展一直受到很大的制约，所以目前对农业害虫的防治主要还是靠化学杀虫剂。八十年代中期随着植物基因工程技术的成熟、Bt基因克隆的成功及对Bt晶体蛋白杀虫剂机制研究的深入，使人们有可能将Bt基因转入植物获得可表达杀虫蛋白的抗虫转基因植物。目前，全世界已有二十六种以上的Bt转基因植物，包括棉花，玉米，水稻等主要农作物在内。这些转基因植物都获得了明显的抗虫性。
野生型Bt晶体蛋白基因在转基因植物中的表达量非常低。在CaMV35S启动子驱动下其表达量约占总可溶性蛋白的0.001％左右，所以不能使转基因植物获得毒杀多数对Bt毒蛋白不太敏感的昆虫，如很多农作物的主要鳞翅目害虫。
Perlark等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324-3328，1991)根据植物基因的密码子使用频率及可能影响植物mRNA稳定性的基序在保持原Bt基因编码的氨基酸序列不变前提下，对Bt晶体蛋白基因Cryl Ab和CrylAc进行了部分改造或全部重新合成。部分改造和重新合成的基因在转基因植物中表达的杀虫蛋白量比野生型基因的表达量分别提高了约10倍和100倍。然而，Bt基因在植物中表达调控中许多问题仍待进一步研究，Bt转基因植物的实际应用中在有些方面还需要很大改进在抗虫转基因植物选育过程中往往发现，抗虫性高的转基因植物其农艺性较差，影响其产量和品质，而农艺性状与原始品种相似的植株抗虫性却不够理想。原因可能有以下几点1.转化再生过程中可能引起体细胞的变异。
2.外源基因在植物染色体上插入的位置不同可能会激活或干扰某些植物基因的表达等都可能导致农艺性状的改变。
3.外源基因产物在转化细胞中的积累，特别是在高水平表达时外源蛋白在植物细胞中的积累，可能对细胞的正常生理功能造成很大干扰，最后导致植物某些特状的改变。
目前对上述问题尚未得到很好解决。本发明的目的是通过将信号肽序列引入Bt基因以使其表达产物能定位于内质网上，提高杀虫蛋白的稳定性，减轻外源蛋白对细胞正常功能的干扰，有助于获得农艺性状优良的抗虫转基因植株。
此外，目前的应用中单一使用Bt基因转化的抗虫转基因植物还有一个比较严重的问题，就是在其使用一段时间之后昆虫会对Bt毒蛋白产生耐受性，从而使抗虫作物的效果大为减低。当前有人使用两种杀虫机制大不相同的蛋白来转化植物，企图在植物中同时表达两种类型的抗虫基因，这样不但可以提高转基因植物的抗虫活性，扩大抗虫谱，而且对于避免或延缓目标昆虫产生耐受性从而延长抗虫转基因植物的有效使用期也会发挥重要作用。目前研究的比较多的是蛋白酶抑制剂基因与Bt基因一起转化植物来获得双价抗虫转基因植物。但迄今在这方面的研究结果还不是很理想，有的结果反而表明同时表达Bt基因和蛋白酶抑制剂基因却没有单独表达Bt基因的抗虫性高(Santos，MO et al，MolecularBreeding 3183-194，1997)。原因很可能是由于在昆虫体内Bt蛋白杀虫活性的发挥受到蛋白酶抑制剂的抑制或干扰，因为在这些实验中研究者用的都是5′端编码区完整的Bt基因，所产生的蛋白仍属于杀虫毒蛋白的前体蛋白，在昆虫肠道内这种蛋白仍需要昆虫的蛋白酶对其N端进行加工，去掉一段(如对CrylAc而言为28个氨基酸)后才能使Bt蛋白完全活化成为有杀虫活性的蛋白(Nagamatsu et al.Agric.Biol.Chem.48611-619，1984)，蛋白酶抑制剂的存在干扰或抑制了这个活化过程从而影响了Bt杀虫蛋白活性的发挥。
针对目前存在的上述问题，本发明合成了从N端第29个氨基酸残基开始至第613个氨基酸组成的CrylAc基因，这是目前人工合成的最短的有活性的Bt基因，并在该基因5’端加上编码鼠的κ轻链信号肽的72bp序列及3′端加上编码内质网定位肽KDEL的核甘酸序列，最后构建成的这个嵌合Bt基因命名为BtS29K，该基因的表达可使杀虫蛋白停留在内质网腔内，由此大大提高了Bt蛋白的稳定性，从而增加了这一杀虫蛋白在组织中的积累量；同时，Bt蛋白积累在细胞内质网中，避免与其他功能细胞器接触，大为减轻了由于外源蛋白在细胞中的积累而对植物细胞产生的负影响，最终获得有较好农艺性状的转基因植株。
另外由于该Bt蛋白已无N端28个氨基酸，所以是一个完全活化了的成熟的杀虫蛋白。这种蛋白不再需要昆虫肠道的消化酶进行活化，所以本发明的提供的BtS29K基因非常适于和有抗虫功能的蛋白酶抑制剂基因配合，构建成双基因或多基因的抗虫转基因植物，从而消除蛋白酶抑制剂对Bt蛋白活化作用的影响，真正发挥这两类不同抗虫基因产物的抗虫功能。目前，本发明已经获得了双价的抗虫转基因植物，实验证明它比之单价的转基因植物有着更好的抗虫效果。
在本发明中首次使用了κ轻键信号肽编码序列、KEDL编码序列与合成的CrylAc基因组建嵌合CrylAc基因，也是首次用5’端缺失的CrylAc基因与蛋白酶抑制剂融合基因API-BA构建的双抗虫基因表达载体。我们已经使用这些基因的表达载体转化植物获得了新的抗虫性更高的转基因植物，如烟草，棉花、扬树等，实验证实本发明可较好地解决前面所说的问题。
为了实现本发明的目的，具体采取如下的技术步骤通过Bt CrylAc基因寡核苷酸引物的合成；CrylAc基因片段的合成及克隆(附
图1)；CrylAc基因的组装得到编码CrylAc活性蛋白基因克隆pBtf29K(附图2)；CrylAc基因序列与信号肽编码序列的连接，构建带有信号肽编码序列的Bt CrylAc基因克隆pS29K；嵌合CrylAc基因S29K插入二元表达载体pBin438构成植物表达载体pBS29K(附图3)，并将其转化到土壤农杆菌[Agrobacterium tumefaciens]LBA4404；与具有抗虫功能的蛋白酶抑制剂基因构建双抗虫基因植物表达载体pBS29K-BA(附图8)。
含pBS29K-BA的大肠杆菌(Escherichia coli)已交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。其登记号为CGMCC NO.0452。
pBS29K和pBS29K-BA或它们的根癌土壤农杆菌LBA4404转化子应用于植物转化，可以获得农艺性状好、具有抗虫性的转基因植物。
为了更好地理解本发明，结合下列附图对本发明予以详细说明附
图1.CrylAc基因片段的合成及亚克隆构建示意中缩写PI-1～PV-9不同寡核苷酸引物的编号，编号后面括号内的数字为引物的碱基数；SKpBluescriptIISK+；KLKlenow enzyme；AmAmpicillin抗性基因；Kb千碱基对；BmBamHI；R1EcoRI；RVEcoRV；ScSacI；SLSalI。
A. 从第29个氨基酸开始的第一区段(BamH1-EcoR1)亚克隆pBtsI-29的构建B. 第二区段(EcoR1-EcoRv)亚克隆pBtsII的构建C. 第三区段(EcoRV-EcoR1)亚克隆pBtsIII的构建D. 第四区段(EcoRI-SacI)亚克隆pBtsIV的构建E. 第五区段(SacI-XhoI)亚克隆pBtsVK的构建附图2.CrylAc活性蛋白基因克隆pBtf29K的构建附图3.嵌合Bt基因S29K的重组质粒pS29K及S29K的植物表达载体pBS29K的构建附图4.合成的含分泌信号肽及内质网定位肽编码序列的活性CrylAc嵌合基因(BtS29K)的核苷酸序列及氨基酸序列附图5.合成的CrylAc活性蛋白编码区DNA序列与野生型CrylAc相应部分DNA序列的比较。
W(上行)……野生型CrylAc基因序列(HD-73)；M(下行)……合成的CrylAc基因序列。方框内的碱基为W和M序列不同的碱基附表 改造前后CrylAc活性蛋白编码区密码子使用频率的变化及与植物密码子使用频率的比较。
密码子百分比指该密码子在该基因编码区内与编码相同氨基酸的密码子总数的比例。
植物密码子使用频率％指在双子叶植物中的使用频率(MurrayEE.et al.Nucleic Acid Res.17477-499 1989)附图6.A.API-A基因片段的PCR扩增及重组质粒pAHA的构建B.API-B基因片段的PCR扩增及重组质粒pAHB的构建C.慈菇蛋白酶抑制剂融合基因API-BA重组质粒pAH-BA的构建附图7.API-BA基因的DNA序列及推导的氨基酸序列图中剪头表示可能的蛋白质的加工位点附图8.融合基因API-BA植物表达载体pBBA及双抗虫基因植物表达载体pBS29K-BA的构建附图9a.转化再生烟草植株的PCR检测
PCR用Bt基因特异的引物pIIm+和PLV-6-泳道1.λ-Ecotl4I DNA ladder泳道2.非转化烟草NC89对照泳道3-15.pBS29K-BA转化再生植株附图9b.转化再生烟草植株的PCR检测PCR用BA基因特异引物B1和A2泳道1、10.λ-Ecotl4I ladder泳道8.非转基因烟草NC89对照泳道9.pBS29K-BA作为模板的阳性对照泳道2-7.pBS29K-BA转化再生植株附图9c.转基因烟草植株的Southem blot分析9c-a与BA基因探针杂交结果泳道1.BA基因片段(1.1kb)泳道2.非转基因烟草作为阴性对照泳道3、4、5、6.分别为pBS29KBA转化的烟草12#，18#，5#和8#9c-b与Bt基因探针杂交结果泳道1.非转基因烟草作为阴性对照泳道2.Bt片段作为阳性对照(1.8kb)泳道3、4、5、6.分别为pBS29KBA转化的烟草12#，18#，5#和8#附
图10.转基因烟草的蛋白免疫分析泳道1.大肠杆菌表达的CrylAc蛋白(68KD)泳道2.非转基因烟草对照泳道3-9.不同转基因烟草植株附
图11.不同基因结构转化再生植株对棉铃虫的抗性分布各基因结构后面所注的括号内数字表示总的参试植株数附
图12.pBS29KBA转基因棉花的抗棉铃虫试验上行左、右叶片为转pBS29KBA双价基因的棉株叶片，中间叶片为非转基因植株对照下行左、中、右分别是来自转pB29K、非转基因对照及pBS29K的单价抗虫基因的棉株叶片附
图13A.抗虫转基因棉花中Bt基因的PCR检测泳道1. λ-Ecotl4I ladder.
泳道2. 阴性对照，非转基因棉花。
泳道3. 阳性对照，pBS29K质粒。
泳道4-8.不同的转基因棉花植株附
图13B.抗虫转基因棉花中API基因的检测泳道1-6.不同的转基因棉花植株泳道7. 阴性对照，非转基因棉花。
泳道8. 阳性对照，pBS29K-BA质粒。
泳道M. λ-Ecotl 4I ladder.
实施例一用Bt基因S29K与蛋白酶抑制剂基因构建双抗虫基因植物表达载体1 苏云金杆菌CrylAc基因编码杀虫活性蛋白的基因片段合成1.1Bt CrylAc基因寡核苷酸引物的合成寡核苷酸引物由中科院微生物研究所新技术中心用Applied Biosystem的DNA合成仪合成，经OPC(寡核苷酸纯化柱)或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后即可用于双链DNA的合成。为了克隆方便，根据CrylAc基因内存在的内切酶识别位点，将该基因的毒性区分为五个区段进行引物合成。在5′端的第一个引物pI-1(+)中，除CrylAc的编码序列外，在该基因的第29个密码子(ATC)上游增加了一个起始密码子ATG，以便合成的基因的转录产物可以正确开始翻译，在ATG与第29个密码子之间还加了GCT密码子以使形成一个在植物中典型的Kozak序列，为了克隆的方便，在该引物的5′端还加上了一个BamHI的识别序列。在最3′端的引物pV-9K中除CrylAc基因3′端序列外还加入了一个编码KDEL四肽的序列、一个终止密码子和一个XhoI识别序列。第一区段(PI)共4个引物(BamH1-EcoR1)，它们的序列如下PI-1(+)5′ GG GAT CCA ACA ATG GCT ATC GAG ACC GGT TAC ACT CCA ATCGAC ATC TCC TTG TCC TTG ACA CAG TTT CTG CTC AGC GAG TTC83merPI-2(-)5′ACC CCA GAT GAT GTC AAC TAG TCC GAG CAC GAA CCC AGCACC TGG CAC GAA CTC GCT GAG 60merPI-3(+)5′ATC ATC TGG GGT ATC TTT GGT CCA TCC CAA TGG GAC GCA TTCCTG 45merPI-4(-)5′GC GAA TTC TTC GAT CCT CTG GTT GAT GAG CTG TTC AAT TTGAAC CAG GAA TGC GTC第二区段(PII)共8个引物(EcoR1-EcoRV)，它们的序列如下PII-1(+)5′ AA GAA TTC GCC AGG AAC CAG GCC ATT TCT AGG TTG GAAGGA CTC AGC AAT CTC TAC CAA ATC TAT 65merPII-2(-)5′CTC CCT GAG AGC TGG GTT AGT AGG ATC GGC CTC CCA TTCTCT GAA AGA CTC TC ATA GAT TTG GTA 66merPII-3(+)5′ T CTC AGG GAG GAG ATG CGT ATT CAA TTC AAC GAT ATG AACAGC GCC TTG ACC ACT GCT ATC CCA T 65merPII-4(-)5′ TT AGC GGC TTG AAC GTA CAC GGA CAA GAG AGG CAC CTGGTA GTT CTG GAC TGC GAA CAA TGG GAT AGC 68merPII-5(+)5′CAA GCC GCT AAT CTT CAT CTC AGC GTG CTT CGA GAC GTTTCA GTG TTT GGA CAG AGG TGG GGA TTC G 67merPII-6(-)5′ C GGT GTA GTT TCC AAT GAG CCT AGT AAG GTC GTT GTA TCTGCT ATT GAT GGT TGC AGC ATC GAA TCC CCA 70merPII-7(+)5′AAC TAC ACC GAC TAT GCT GTT CGT TGG TAC AAC ACT GGTTTG GAG CGT GTC TGG GGT CCT GAT AGC AGA 69merPII-8(-)5′ AC GAT ATC CAA CAC TGT AAG GGT CAA TTC TCT CCT GAA CTGGTT GTA TCT CAC CCA ATC TCT GCT ATC AG 70mer第三区段(PIII)共5个引物(EcoRV-EcoR1)，它们的序列如下PIII-1(+)5′ TG GAT ATC GTG GCT CTC TTC CCG AAC TAT GAC AGC AGAAGG TAC CCA ATC CGT ACT GTT TCC CAA CTT ACC AGA GAG77merPIII-2(-)5′ CTG GGC AGA AAC ACG GAA GCT ACC GTC GGA ATT CTC AAGAAC TGG GTT AGT ATA GAT CTC TCT GGT A 67merPIII-3(+)5′ T TCT GCC CAG GGT ATA GAA AGA AGC ATC AGG AGC CCT CATCTC ATG GAC ATC TTG AAC AGC ATA ACT ATC 70merPIII-4(-)5′ CTG GTG TCC AGA CCA ATA GTA GTA TCC TCT ATG AGC ATCGGT GTA GAT AGT TAT 55merPIII-5(-)5′ GT GAA TTC GGG ACC GCT GAA TCC AAC TGG GAG GGC CATGAT CTG GTG TCC A 51mer第四区段(PIV)共6个引物(EcoR1-SacI)，其序列如下PIV-1(+)5′ CC GAA TTC ACC TTC CCT CTC TAT GGA ACT ATG GGT AACGCC GCT CCA CAA CAA AGG ATC GTT GCT CA 67merPIV-2(-)5′ GAA TGG CCT TCT GTA CAA AGT GGA AGA CAA GGT TCT GTAGAC ACC CTG ACC TAG TTG AGC AAC GA 65merPIV-3(+)5′ A AGG CCA TTC AAT ATC GGT ATC AAC AAC CAG CAA CTT TCCGTT CTC GAT GGA ACA GAG TTC GCC TAT 67merPIV-4(-)5′ A GCT AGC AAC GGT TCC GGA CTT TCT GTA AAC AGC GGA TGGCAA GTT AGA AGA GGT TCC ATA GGC GGA C 68merPIV-5(+)5′ GTT GAT AGC TTG GAC GAA ATT CCA CCA CAG AAC AAC AATGTG CCA CCC AGG CAA GGA TTC AGC CAC AGG T 70merPIV-6(-)5′ AGG AGC TCT GAT GAT GCT CAC GCT ACT GTT GCT GAA ACCGGA ACG GAA CAT GGA CAC ATG GCT CAA CCT GTG GCT72mer第五区段(PV)共9个引物(SacI-Xhol)，其序列如下PV-1(+)5′ TC AGA GCT CCT ATG TTC TCT TGG ATA CAT CGT AGT GCT GAGTTC AAC AAT ATC ATT GCA TCC GAT AGC ATC 71merPV-2(-)5′ CC TGA AAT GAC TGA ACC ATT GAA GAG AA GTT TCC CTT AACTGC AGG AAT TTG AGT GAT GCT ATC G 66merPV-3(+)5′ TC ATT TCA GGA CCA GGA TTC ACA GGA GGA GAC CTC GTTAGA CTC AAC AGC AGT GGA AAT AAC ATC 65merPV-4(-)5′ATA TCT GGT AGA GTT CGT GTG AGG TAT GCT TCT GTG ACT CCT
ATT CAT CTC AAC GTT AAT TGG GGT 67merPV-5(+)5′ T ACC AGA TAT AGA GTT CGT GTG AGG TAT GCT TCT GTG ACTCCTATT CAT CTCAAC GTT AAT TGG GGT 67merPV-6(-)5′ GAG GTT ATC CAA GGA GGT AGC TGT AGC TGG AAC TGT GTTGCT GAA GAT AGA TGA ATT ACC CCA ATT A 67merPV-7(+)5′ G GAT AACCTC CAA TCC AGC GAC TTC GGA TAC TTT GAG AGCGCC AAT GCT TTC ACA TCT TCA CTC GGC AAC70merPV-8(-)5′T CAC ACC TGC AGT TC ACT AA GTT TCT AAC ACC CAC TAT GTTGCC GAGT 50merPV-9K(-)5′ CA CTC GAG ATC TCA AAG CTC GTC CTT TTC GAG TGT TGCAGT AAC TGG AAT GAA CTC AAA TCT GTC TAT GAT CAC ACCTGC 80merPV-9(-)5′ CA GTC GAC TCA TTC GAG TGT TGC AGT AAC TGG AAT GAACTC AA TCT GTC TAT GAT CAC 65mer1.2CrylAc基因片段的合成及克隆取各个区段中两个相邻引物各20pmol(10μl)混合，在70℃变性10min，自然冷却后加入10 X Klenow酶缓冲液(100mmol/L Tris-Cl PH7.5，0.5mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，50mmol/L DTT)2μl，Klenow DNA聚合酶1单位，加dNTP至0.1mmol/L在总体积20μl内37℃保温1h，反应产物与另一个经Klenow酶聚合反应产生的相邻大片段混合变性后，在两端引物存在下进行PCR扩增以产生更大的DNA片段。PCR反应在20或50μl体积中由50mmol/L KCl，10mmol/L，Tris-HCl pH8.8，1.5mmol/LMgCl2，0.1mg/ml BSA，0.2mmol/L dNTP，5′端和3′端引物各1μmol/L，0.05U/μl Taq DNA polymerase，1μl/每个反应来自Klenow或PCR反应的产物作为模板组成的反应混合物以94℃变性4min然后94℃，1min；40-50℃(退火温度根据引物与模板配对的碱基数确定)，1min；72℃，1min反应30个循环。每个区段的PCR最终产物经相应的内切酶酶解后与用同样酶解的克隆载体pBluecriptIISK+或pSP71连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含X-gal和IPTG的LB平板上选取白色菌落，经质粒提取、质粒的酶切分析及DNA序列分析后即可选到Cry1Ac基因片段的亚克隆pBtSI(第一区段)，pBtSII(第二区段)，pBtSIII(第三区段)，pBtSIV(第四区段)和pBtSVK(第五区段)。这五个亚克隆的构建过程见附
图1A-E。以上的DNA酶切、载体的制备、连接反应、感受态细胞的制备、DNA转化、克隆的筛选都可按照《分子克隆》一书(Sambrook J.et al.《Molecular Cloning》2nd ed.CSH Laboratory Press，1989)所述方法进行。DNA序列分析按Pharmacia公司T7DNA sequencing Kit提供的方法进行。1.3 CrylAc基因的组装经序列分析证明各个亚克隆中Bt基因片段的序列正确后，用常规的重组DNA技术按各亚克隆的酶切位点彼此按次序连接后即得到编码CrylAc活性蛋白的基因克隆pBtf29K。pBtf29K构建过程见附图2.1.4 CrylAc基因序列的矫正及与信号肽编码序列的连接(a)、在对每个亚克隆进行序列分析后发现在有些克隆中有碱基的缺失或置换。为了获得完全正确的基因序列，在亚克隆基础上用按Clontech公司的定点突变盒说明书的方法对有误的碱基处进行定点突变。突变的选择引物为Stu/ScaI 5′GTGGACTGGTGAAGTACTCAACCAAGTC或AflIII/BglII引物5′CAGGAAAGAAGATCTGAGCAAAAG。突变引物由需改变的碱基与两端10-15个碱基组成的寡核苷酸组成。突变引物应与选择引物在同一条DNA链上。
对亚克隆pBts12(29)中Bt基因片段中EcoRI左右出现的碱基错误则用两对引物通过PCR方法进行了改正，为便于筛选突变的转化子，同时将此EcoRI位点去除。两对引物分别为①PI-1+mI-mI- 5′ CCTGGCGAACTCTTCGATCCTCTGGTTGATGAG 33mer②PII-8+mII+mII+5′ ATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATTTCTAGG 36mer对pBts12(29)改造后的重组质粒定名为pBts12(29m)PCR反应条件及克隆方法同前所述。
(b)、带有信号肽编码序列的Bt CrylAc基因克隆pS29K的构建为了使Bt基因产物能有效地定位于细胞的内质网上，用编码CrylAc第29-613氨基酸及KDEL的基因与鼠单链抗体信号肽编码序列连接后构建成嵌合Bt基因S29K的重组质粒pS29K具体构建过程见附图3。
单链抗体信号肽编码序列的引物如下AT31(+)5′CTGGATCCAACAATGGGCATCAAGATGGAGACCCACTCTCAGGTGTTCGTGTAC 54merAT32(-)5′TGAGATCTGTGTCCACACCAGACAACCAAAGCAACATGTACACGAACACCTG 52mer合成的(嵌合Cry1Ac基因)S29K的DNA全长1857bp，其序列见附图4。合成的S29K基因中编码CrylAc杀虫活性蛋白部分共1755bp编码从第29-613氨基酸。合成中共改变了342个碱基涉及到311个密码子的改变，占总密码子的53.2％。但总的氨基酸序列未发生变化。GC比由野生型的37.6％提高到47.4％，改造前后的核苷酸序列同源性为80％。其改造前后氨基酸密码子使用频率的比较及与植物优化密码子的比较见附表，与野生型CrylAc基因核苷酸序列的比较见附图5。S29K基因全长1857bp，除包含上述1755bp Bt基因序列外，还包括72bp编码信号肽、12bp编码KDEL及15bp连接信号肽与Bt基因的结合部位序列(见附图4)。2、嵌合CrylAc基因S29K的植物表达载体的构建及农杆菌的转化二元表达载体pBin438含有由带双增强子的CaMV 35S启动子(DE35Sp)、TMV-RNA cDNA的Ω片段一来自pBR322的BamHI-SalI片段及Nos转录终止序列组成的外源基因表达框架(李太元等，中国科学(B辑)24276-282，1995)。用BamHI和XhoI将pS29K中的嵌合CrylAc基因S29K切出后插入到pBin438的BamHI和SalI位点之间构建成植物表达载体pBS29K。经酶切分析证明构建正确后用冻融法(An et al，Methodsin Enzymology 153293，1987)将其转化到土壤农杆菌(A.tumefaciens)LB4404中，经卡那霉素筛选，质粒分析证明pBS29K结构完全正确后即可用于植物转化。这个植物表达载体的具体构建过程见附图3。3.慈菇蛋白酶抑制剂(API)融合蛋白基因(BA)的构建慈菇是泻泽科的一种水生蔬菜，含有丰富的蛋白酶抑制剂，对多种害虫有较强的抑制和致死作用。API有两个组分，API-A和API-B，A和B均为双头多功能蛋白酶抑制剂。中科院上海生化所杨慧铃等(中国科学B辑，121271-1276，1990)的研究结果表明，API-A能同时等当量抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，对激肽酶的抑制作用较弱；API-B能等当量抑制2克分子的胰蛋白酶，对激肽酶的抑制活力与API-A相似，但对胰凝乳蛋白酶的抑制作用远比抑制剂A弱。许文峰等(生物化学与生物物理学报25207-215，1993)首先克隆了API-A和API-B cDNA，从而为利用这两个基因进行抗虫转基因研究奠定了基础。
为了同时发挥A和B两个抑制剂的作用从而获得更好的抗虫效果，我们将API-A和API-B构建成融合蛋白基因，具体步骤如下引物合成及API-BA基因的构建API-B引物B15′GCTGGATCCACCATGGCGGCCTCCAACGCT 27merB25′TGCCTGCAGAGATCTCATTGCGAGTGCGTCGAA 33merAPI-A引物A15′GTCGGATCCTGCCACGGAGATCCCGTC 27merA25′TGCAAGCTTCTCGAGCTACTGCGGTGCAGTTTTC 34mer用上海生物化学所戚正武，龚蓁蓁先生提供的API-A和API-B cDNAM13噬菌体克隆作模板用上述引物分别进行PCR，将PCR产物经适当酶切后与同样酶解的载体pUC19连接即得这两个基因的克隆pAHA和pAHB(见附图6-A和6-B)，经序列分析证明正确后将API-A基因用HindIII和BamHI从pAHA切出与HindIII-BglII酶切的pAHB连接即得B和A的融合基因API-BA，含API-BA的重组质粒命名为pAH-BA(见附图6-C)。API-BA融合蛋白基因的DNA序列及推导的氨基酸序列见附图7所示。PCR、酶切分析、克隆及测序方法与上文所述一致。
在API-BA基因中API-B的N端信号肽和API-A基因C端8肽的编码序列都被保留下来，B和A的连接处保留了B前体蛋白C端2个氨基酸残基，A前体蛋白N端信号肽的C端3个氨基酸残基以及由BglII和BamHI连接产生的两个氨基酸残基。这样的结构应该不会影响对前体蛋白的加工。在植物中表达后仍有可能被加工成API-A和API-B两个成熟蛋白。4.API-BA基因植物表达载体及嵌合CrylAc基因BtS29K与API-BA双抗虫基因植物表达载体的构建用BamHI和XhoI酶切pAH-BA将API-BA基因分离出来后与BamHI-SalI酶解的pBin438连接即得API-BA基因的植物表达载体pBBA；上述API-BA基因片段与BamHI-SalI酶解的pD12(pD12的结构见田颖川等，植物学报42263-268，2000)连接后得重组质粒pDBA。API-BA基因在pDBA中处于DE35SP(双增强子的35S启动子)——TMVΩ片段下游，Nos转录终止序列上游，用HindIII将此表达框架切下后与HindIII酶解，虾碱性磷酸酶处理的pBS29K连接即得带有API-BA和S29K(由CrylAc与信号肽序列组成的嵌合CrylAc基因)的双抗虫基因植物表达载体pBS29K-BA。PBBA和pBS29K-BA的构建过程见附图8。pBS29K-BA的大肠杆菌转化子是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的，其登记号为CGMCC No.0452。
在pBS29K-BA中API-BA基因可作为蛋白酶抑制剂基因的一个代表，任何具有抗虫活性的蛋白酶抑制剂基因都可以取代API-BA与BtS29K基因构建成双抗虫基因表达载体。5.根癌土壤杆菌的转化将pBBA和pBS29K-BA转化到根癌土壤杆菌LBA4404的方法同本实施例一中所述。所得转化子中的重组质粒经酶切分析证明正确后即可用于植物转化。
实施例二 抗虫转基因植物1.烟草的转化用无菌培养的烟草NC89的叶片通过与根癌土壤杆菌共培养的叶盘法(Horch et al.Science 2271229-1231，1985)将以上构建的pBS29K，pBBA，pBS29K-BA中的T-DNA(包括NPTII基因和相应的抗虫基因)转入到烟草染色体上分别获得了一批抗卡那霉素的抗虫转基因烟草植株。2.转化再生烟草植株的分析2.1转化再生植株的PCR检测烟草DNA提取和转基因烟草的PCR检测按李太元等所述方法(中国科学B辑24276-282，1994)进行，CrylAc基因特异引物为PIIm+ 5′ ATCTATGCAGAGTCTTTCAGAPLV-6-5′ GAGGTTATCCAAGGAGGT用这两个引物进行PCR所得产物应是1370bP。API-BA基因特异引物为B1GGATCCACCATGGCGGCCTCCAACGCTA2CTCGAGCTACTGCGGTGCAGTTTTC用这一对引物进行PCR扩增所得产物应是约1.2kb。部分抗卡那霉素的再生植株的PCR结果见附图9a和9b。这些PCR结果表明S29K或S29K-BA双抗虫基因可能已整合到烟草的染色体上。2.2 Southern杂交分析(1)植物DNA的提取取2克叶片在液氮中研磨成粉后按Paterson等报导的方法(PlantMol.Bol.Rep，11(2)，1993)提取细胞核DNA。DNA的定量用紫外测定法，即1OD260＝50μg/ml或在Agarose电泳后用EB染色比较确定。(2)植物DNA的酶解和电泳取20μgDNA加入150单位的HindIII和20μl 10×限制性内切酶缓冲液，加无菌重蒸水至总体积为200μl，37℃保温过夜。然后加入20μl 3MNaAc PH5.5及2倍体积的95％乙醇，混匀后置-70℃ 15min，12000rpm离心5min沉淀DNA，用70％乙醇洗沉淀一次，将DNA沉淀真空干燥后溶于适量TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA PH8.0)，在0.8％Agarose胶上以80V电泳分离DNA。(3)DNA的转膜、引物标记及杂交反应均参照分子克隆一书(Sambrook etal.CSHL Press，1989)所述进行，所用探针为用α-32P-dCTP和Ready To GoDNA标记试剂盒标记的EcoRV和XhoI酶解的S29K基因片段(1.1Kb)。对部分植株的Southern杂交结果(见附图9C)证明BT基因和API-BA基因已整合到所检测的烟草染色体中，而且在所检测的植株中都是单拷贝插入。2.3转基因烟草中的Bt杀虫蛋白质检测取100mg新鲜叶片，液氮研磨后加入100μl 2×上样缓冲液，100℃煮3-5min，12000rpm离心5min后，所得上清即可用于电泳分析。
取上述蛋白提取液20μl，在10％SDS-PAGE胶上，用Tris-甘氨酸缓冲体系(PH8.3)，电压60V，电泳4-6hr。电泳结束后，用Bio-Rad半干转移仪恒压9伏，30min将蛋白转移至用甲醇预处理的PVDF膜上。然后将膜置于溶液III中封闭未结合蛋白的位置，室温下摇1hr或4℃过夜；将膜转入一抗反应液(溶液I+1％BSA，ProteinA Spharose6B柱纯化过的免抗CrylAc抗体，1∶500倍稀释)中，室温摇1hr；用溶液I洗3次，每次3-5min；将膜置于显色液(10ml溶液II+33μlNBT+66μlBCIP)中显色。Western blot所用溶液如下2×上样缓冲液125mM Tris-HCl PH6.8，20％甘油，4％SDS，0.2％溴酚蓝，2％巯基乙醇半干转移缓冲液48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.0375％SDS，20％甲醇溶液I20mmol/L Tris-HCl PH7.4，0.15mol/L NaCl，1mmol/LEDTA，0.1％Tween-20溶液II0.1mol/L Tris，0.1mol/L NaCl，5mmol/L MgCl2(PH9.5)溶液III含5％脱脂牛乳粉的溶液I。
部分植株的定性Westem blot分析结果见附
图10，结果表明改造后的Bt基因在转基因植株中有明显的表达。特异免疫反应的蛋白分子量与1.8KbCrylAc基因5′端片段在大肠杆菌中表达产物(泳道1)大小一致。但对有关信号肽是否发挥了其应有的功能及其加工情况尚需进一步的实验证明。API基因在转基因植株中的表达及加工情况也尚需通过进一步检测来确定。2.4转基因烟草的抗虫实验取转基因烟草或非转基因烟草的新鲜叶片用无菌水冲洗干净并用纱布将叶上的水吸干后放入小塑料盒内，每盒放一头人工饲养的棉铃虫(Heliothis armigera Hübner)，每株烟草的叶片接12头虫。虫试盒加盖以防棉铃虫逃逸及水分的蒸发，在25℃放置3天和5天后统计幼虫死亡率。抗虫试验重复三次。各抗虫基因结构的转化再生烟草虫试结果归纳为附
图11。虫试结果表明加信号肽和内质网定位肽的Bt基因(BtS29K)和API-A和B融合蛋白基因(BA)的转化植株中高抗棉铃虫植株(死亡率在80-100％)的比例分别占总虫试植株数的54％和39％，而双抗虫基因(S29K-BA)转化植株的高抗植株占63.5％。高抗植株的比例明显高于仅转化单一抗虫基因的，比仅转化BtS29K的高9.5％，比仅转API-BA的高25.2％。带有单链抗体信号肽和C端带有内质网定位肽，N端从第29个氨基酸开始的Bt基因(BtS29K)与蛋白酶抑制剂基因共同转化植物所产生的转双抗虫基因植物的抗虫性比单独表达Bt基因或蛋白酶抑制剂融合基因(API-BA)植株的抗虫性都明显地高。表明本发明所合成的嵌合Bt基因的结构有利于培育转双抗虫基因的抗虫植物。从而使利用不同抗虫机制的抗虫基因来获得抗虫性更高，抗虫谱更宽的转基因植物，延期或避免目标昆虫产生耐受性的策略成为可能。3.抗虫转基因棉花利用BtS29K或Bt29K与API基因构建的双抗虫基因表达载体已通过土壤农杆菌介导法转化了棉花，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花纯合系(见附
图12)。双价抗虫棉的PCR结果见附
图13A和13B。转化方法参考李燕娥等(棉花学报10237-243，1998)所述。
本发明提供的BtS29K及BtS29K-BA基因可用于植物转化，获得相应的具有高抗虫性的的转基因植物。
权利要求
1.一种在植物中高效定位表达的抗虫基因，其特征在于它是一种如下列核苷酸序列所示的由1857个核苷酸组成的嵌合基因。ATGGGCATCAAGATGGAGACCCACTCTCAGGTGTTCGTGTACATGTTGCTTTGGTTGTCTGGTGTGGACACAGATCCAACAATGGCTATCGAGACCGGTTACACTCCAATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTCAGCGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTGCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTTTGGTCCATCCCAATGGGACGCATTCCTGGTTCAAATTGAACAGCTCATCAACCAGAGGATCGAAGAGTTCGCTAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGACTCAGCAATCTCTACCAAATCTATGCAGAGTCTTTCAGAGAATGGGAGGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCAGGGAGGAGATGCGTATTCAATTCAACGATATGAACAGCGCCTTGACCACTGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGAACTACCAGGTGCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCCGCTAATCTTCATCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTTCAGTGTTTGGACAGAGGTGGGGATTCGATGCTGCAACCATCAATAGCAGATACAACGACCTTACTAGGCTCATTGGAAACTACACCGACTATGCTGTTCGTTGGTACAACACTGGTTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATAGCAGAGATTGGGTGAGATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTTACAGTGTTGGATATCGTGGCTCTCTTCCCGAACTATGACAGCAGAAGGTACCCAATCCGTACTGTTTCCCAACTTACCAGAGAGATCTATACTAACCCAGTTCTTGAGAATTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAGGGTATAGAAAGAAGCATCAGGAGCCCTCATCTCATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACCGATGCTCATAGAGGATACTACTATTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGATTCAGCGGGCCCGAATTCACCTTCCCTCTCTATGGAACTATGGGTAACGCCGCTCCACAACAAAGGATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACTTTGTACAGAAGGCCATTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTCGATGGAACAGAGTTCGCCTATGGGACCTCTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTACAGAAAGTCCGGAACCGTTGATAGCTTGGACGAAATTCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCAGCCACAGGTTGAGCCATGTGTCCATGTTCCGTTCCGGTTTCAGCAACAGTAGCGTGAGCATCATCAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTGAGTTCAACAATATCATTGCATCCGATAGCATCACTCAAATTCCTGCAGTTAAGGGAAACTTTCTCTTCAATGGTTCAGTCATTTCAGGACCAGGATTCACSGGAGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAATAACATCCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCATTTCCCTTCCACATCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTAACTCCTATTCATCTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCTATCTTCAGCAACACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAACCTCCAATCCAGCGACTTCGGATACTTTGAGAGCGCCAATGCTTTCACATCTTCACTCGGCAACTATGTGGGTGTTAGAAACTTTAGTGGAACTGCAGGTGTGATCATAGACAGATTTGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAAAAGGACGAGCTTTGA1857
2.根据权利要求1所述的嵌合基因，它包括编码鼠单链抗体信号肽的序列的第1至第72核苷酸序列；编码苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)Bt杀虫蛋白CrylAc第29至第613位氨基酸的序列的第88至第1842核苷酸序列；及编码一个内质网定位肽的序列的第1843至第1854个核苷酸序列；第73至第87个核苷酸是信号肽编码序列与CrylAc基因连接时由连接部位的核苷酸编码的五个氨基酸的序列。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列下式所示1M G I K M E T H S Q V F V Y M LL W L S G V D T D P T M A I E TG Y T P I D I S L S L T Q F L LS E F V P G A G F V L G L V D II W G I F G P S Q W D A F L V QI E Q L I N Q R I E E F A R N QA I S R L E G L S N L V Q I Y AE S F R E W E A D P T N P A L RE E M R I Q F N D M N S A L T TA I P L F A V Q N Y Q V P L L SV Y V Q A A N L H L S V L R D VS V F G Q R W G F D A A T I N SR Y N D L T R L I G N Y T D Y AV R W Y N T G L E R V W G P D SR D W V R Y N Q F R R E L T L TV L D I V A L F P N Y D S R R YP I R T V S Q L T R E I Y T N PV L E N F D G S F R G S A Q G IE R S I R S P H L M D I L N S IT I Y T D A H R G Y Y Y W S G HQ I M A S P V G F S G P E F T FP L Y G T M G N A A P Q Q R I VA Q L G Q G V Y R T L S S T L YR R P F N I G I N N Q Q L S V LD G T E F A Y G T S S N L P S AV Y R K S G T V D S L D E I P PQ N N N V P P R Q G F S H R L SH V S M F R S GF S N S S V S II R A P M F S WI H R S A E F NN I I A S D S IT Q I P A V K GN F L F N G S VI S G P G F T GG D L V R L N SS G N N I Q N RG Y I E V P I HF P S T S T R YR V R V R Y A SV T P I H L N VN W G N S S I FS N T V P A T AT S L D N L Q SS D F G Y F E SA N A F T S S LG N Y V G V R NF S G T A G V II D R F E F I P618V T A T L E K DE L
4.根据权利要求1所述的嵌合基因，是指BtS29K基因。
5.根据权利要求2所述Bt杀虫蛋白CrylAc的氨基酸序列是权利要求3所述的第30位至614位氨基酸的序列，如下式所示30I E T G Y T P I D I S L S L T QF L L S E F V P G A G F V L G LV D I I W G I F G P S Q W D A FL V Q I E Q L I N Q R I E E F AR N Q A I S R L E G L S N L Y QI Y A E S F R E W E A D P T N PA L R E E M R I Q F N D M N S AL T T A I P L F A V Q N Y Q V PL L S V Y V Q A A N L H L S V LR D V S V F G Q R W G F D A A TI N S R Y N D L T R L I G N Y TD Y A V R W Y N T G L E R V W GP D S R D W V R Y N Q F R R E LT L T V L D I V A L F P N Y D SR R Y P I R T V S Q L T R E I YT N PV L E N F D G SF R G S AQ G IE R S I R S P HL M D I LN S IT I Y T D A H RG Y Y Y WS G HQ I M A S P V GF S G P EF T FP L Y G T M G NA A P Q QR I VA Q L G Q G V YR T L S ST L YR R P F N I G IN N Q Q LS V LD G T E F A Y GT S S N LP S AV Y R K S G T VD S L D EI P PQ N N N V P P RQ G F S HR L SH V S M F R S GF S N S SV S II R A P M F S WI H R S AE F NN I I A S D S IT Q I P AV K GN F L F N G S VI S G P GF T GG D L V R L N SS G N N IQ N RG Y I E V P I HF P S T ST R YR V R V R Y A SV T P I HL N VN W G N S S I FS N T V PA T AT S L D N L Q SS D F G YF E SA N A F T S S LG N Y V GV R NF S G T A G V II D R F E614F I PV T A T L
6.一种重组质粒，它是由权利要求4所述的嵌合Bt杀虫蛋白基因BtS29K与克隆载体pBluescript II SK+构建成的，定名为pSKBt29K的一种重组质粒。
7.一种重组微生物，含有权利要求6所述的重组质粒pSKBt29K。
8.一种能在植物中组成型表达外源抗虫基因的植物表达载体，其特征在于包括权利要求4所述的嵌合Bt杀虫蛋白基因BtS29K和二元表达载体pBin438，该植物表达载体定名为pBS29K。
9.一个含有两种抗虫基因的植物表达载体，其特征是包括一种蛋白酶抑制剂基因，CaMV35S启动子及Nos转录终止序列所组成的表达框插入到权利要求8所述的表达载体pBS29K中而构成的。
10.根据权利要求9所述的含有两种抗虫基因的植物表达载体，其特征在于其中的蛋白酶抑制剂基因是慈姑蛋白酶抑制剂B和A两个基因首尾连接后形成的一种融合蛋白基因，该基因定名为API-BA。
11.根据权利要求9所述的一种具有两种抗虫基因的植物表达载体，其特征在于含有嵌合Bt基因BtS29K及一种蛋白酶抑制融合蛋白基因API-BA的植物表达载体，称为pBS29K-BA。
12.一种重组微生物，它含有权利要求8所述的植物表达载体。
13.一种重组微生物，它也含有权利要求11所述的植物表达载体。
14.根据权利要求13所述的重组微生物，它是大肠杆菌[Escherichiacoli(Migula)]DH5α，菌种保存号为CGMCCNO.0452。
15.根据权利要求13所述的重组微生物，是根癌土壤杆菌[Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)Conn]LBA4404。
16.根据权利要求8、11、12、13、14所述的杀虫蛋白基因的植物表达载体和重组微生物在植物抗虫基因工程中的应用。
全文摘要
本发明提供一个人工合成的融合蛋白基因BtS29K。该基因在植物内表达后产生完全活化的定位于内质网的活性杀虫蛋白CrylAc,适于与有抗虫作用的蛋白酶抑制剂基因一起构建双抗虫基因的植物表达载体以获得抗虫性更高,杀虫谱更广,而且可延缓目标昆虫对抗虫转基因植物产生耐受性的过程。本发明用BtS29K与一个融合蛋白酶抑制剂基因API－BA构建了双抗虫基因植物表达载体pBS29K－BA,用此载体可获得高抗虫性的转基因植物。
文档编号A01N63/00GK1369562SQ01103759
公开日2002年9月18日 申请日期2001年2月13日 优先权日2001年2月13日
发明者田颖川, 郭洪年, 秦红敏, 芦睿, 李常青 申请人:中国科学院微生物研究所