专利名称：高纯度藻胆蛋白的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种更简单、更经济和更高效的方法分离纯化高质量的、高附加值的藻胆蛋白制品，属于从海洋生物中分离纯化有经济价值物质的新方法，具体说就是高纯度藻胆蛋白的分离方法。
背景技术：
藻胆蛋白可以广泛应用于医学诊断、临床医学等。藻胆蛋白种类多，荧光强，易于同生物素、抗体等结合，因此藻胆蛋白可以作为新一代荧光探针；藻胆蛋白具有一些独特的疗效，例如作为肿瘤光动力治疗的光敏剂，提高机体的免疫功能等；取代人工合成色素，用作食品和化妆品的添加剂，不仅可以避免人工色素对人体可能的副作用，而且藻胆蛋白本身就有极强的保健功能。国外的许多公司相继投资开发藻胆蛋白，产品售价十分可观。例如，Sigma公司生产的高纯度藻胆蛋白零售价约为每毫克120美元左右，藻胆蛋白标记的荧光探针为每毫克150美元左右(Sigma公司2001年产品目录)。
有关藻胆蛋白的应用方面的专利主要有美国专利U.S.PatentNo.4859582和U.S.Patent No.4542104，用以保护藻胆蛋白作为荧光探针的应用；美国专利U.S.Patent No.5163898和中国专利CN1091976A保护螺旋藻藻蓝蛋白作为肿瘤治疗光敏剂的应用。中国专利CN1106414A和CN1130028A介绍了从螺旋藻中分离藻蓝蛋白的方法，以上两个专利所用的方法均是螺旋藻藻蓝蛋白粗制方法，虽然简单，但得到的藻蓝蛋白纯度极低，仅能作为食品添加剂，根本不能作为生化试剂。目前常用的高纯度藻胆蛋白的分离方法基本都是根据文献Biochemistry，13，2960(1974)和Journal of Cell Biology，93，981(1982)提供的方法，即首先用蔗糖密度梯度离心的方法分离纯化藻胆蛋白的聚合体—藻胆体，将藻胆体解聚为藻胆蛋白，再用凝胶过滤(Sephadex G-200)的方法纯化藻胆蛋白。这些方法存在如下缺点1、用蔗糖密度梯度超速离心费时费力，因为超速离心机的设备价格昂贵，很多单位没有超速离心机的设备，同时用超速离心的方法不适合大规模分离纯化藻胆蛋白；2、在用凝胶过滤的方法时所使用的分离材料Sephadex G-200价格昂贵；3、用凝胶过滤的方法所用的时间太长，仅平衡层析柱就需要约一周的时间；4、用上述的方法分离纯化藻胆蛋白的得率太低，一般得率小于1％。正是由于上述分离技术的这些缺陷，使得国际市场上藻胆蛋白售价过于昂贵。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种高纯度藻胆蛋白的分离方法，简化分离工艺，加快分离速度，提高得率，降低成本，从而有利于大规模的工业化生产高纯度的藻胆蛋白。
本发明采用低渗的方法制备藻类粗提物，使用自制的羟基磷灰石作为藻胆蛋白的吸附剂。不是将羟基磷灰石装入层析柱中，再分离藻胆蛋白，而是将自制的羟基磷灰石和藻类的粗提物按比例混合，使粗提液中的藻胆蛋白充分吸附于羟基磷灰石上。从而避免了粗提物中残渣和粘性多糖堵塞层析柱的难题。具体步骤如下一、用低渗的办法制备藻类的抽提物；二、将羟基磷灰石和藻类粗提物混合，使粗提物中的藻胆蛋白吸附到羟基磷灰石上，采用自然沉淀或者低速离心的方法使结合有藻胆蛋白的羟基磷灰石沉淀，去除上清液中藻类粗提物的其他组分；三、进一步用0.001M至0.005M磷酸盐缓冲液(pH6.8)洗涤结合有藻胆蛋白的羟基磷灰石2到3次，以去除没有结合或者结合不牢固的其他组分；四、用0.010M至0.050M的磷酸盐缓冲液(pH6.8)将藻蓝蛋白或者藻红蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来，收集藻蓝蛋白或者藻红蛋白；五、再用0.05M至0.15M磷酸盐缓冲液(pH6.8)洗脱羟基磷灰石，得到别藻蓝蛋白组分。所得的藻胆蛋白制品得率至少为20％，其得率范围为20％--60％。
如果将从步骤四、五得到的藻胆蛋白产物，再重复步骤二、三、四、五，重复与羟基磷灰石的吸附和洗脱过程，得到的藻胆蛋白纯度将达到或者达到4--6，高于国外大公司出售的高纯度藻胆蛋白产品。
使用以上方法可以有效地达到两个目的(1)、将藻胆蛋白从藻类粗提物中分离出来；(2)、将不同的藻胆蛋白(如藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白等)分开。
本发明与现有技术相比，主要具有如下优点1、藻类内含物的抽提采用低渗的方法，不需要特殊的设备(如超声波破碎仪等)，同时羟基磷灰石可以自己制备，因而非常经济；2、不需要超速离心、装层析柱以及在层析柱上加样等复杂的操作，同时也不需要平衡以及洗脱层析柱等非常费时的过程，一般只需一天的时间就可以完成操作，因此操作简单方便；3、成本低，如果不包括劳动力成本，初步估算仅为国外同类产品的二十分之一；4、得率高，至少可以达到20％以上，是目前常用的藻胆蛋白分离方法得率的20倍，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
通过三个实施例进一步详述本发明的方法。
实施例1取20克购自山东省东营市胜利油田的钝顶螺旋藻干粉。加入蒸馏水200ml，冰箱内4℃条件下放置24小时，低速离心去残渣，上清液为螺旋藻粗提液，总体积为151ml，OD620＝46.660(含粗藻胆蛋白量为1003.26毫克)；称取1克羟基磷灰石，放在带盖的离心管中，用0.001M磷酸盐缓冲液平衡，然后加入4ml螺旋藻粗提液(含藻蓝蛋白量约为26.576毫克)，离心管上下倒置10分钟，使之充分吸附，低速离心2分钟去上清液；用上述缓冲液洗涤吸附有藻胆蛋白的羟基磷灰石两次；再加入0.030M的磷酸盐缓冲液洗脱藻蓝蛋白，至洗脱液无色为止，合并洗脱液，总体积为37ml，OD620＝1.133，含藻蓝蛋白约为5.969毫克；从螺旋藻粗提液中获得藻蓝蛋白的得率约为22.460％。如果再进行一次羟基磷灰石吸附与洗脱过程，藻蓝蛋白的纯度A620/A280可以达到4.5，而Sigma公司所售的藻蓝蛋白的纯度仅为4.4(Sigma公司2000年产品目录)，高于Sigma公司所售的藻蓝蛋白的纯度。
实施例2前面的处理步骤与实施例1相同，不用0.003M的磷酸盐缓冲液，而改用用0.05M的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱至羟基磷灰石无色为止；洗脱液总体积为52ml，OD620＝0.909，含藻蓝蛋白约为6.732毫克；从螺旋藻粗提液中获得藻蓝蛋白的得率约为25.330％。如果再进行一次羟基磷灰石吸附与洗脱过程，藻蓝蛋白的纯度A620/A280也可以达到4以上。
实施例3三叉仙菜采自青岛汇泉湾，分别用海水和自来水洗涤藻体2次后，加入等体积的自来水浸泡24小时，过滤去除藻体的残渣，经测定粗提液滤液的OD560＝3.808；称取2克羟基磷灰石，放在带盖的离心管中，用0.001M磷酸盐缓冲液(pH6.8)平衡，然后加入16ml三叉仙菜粗提液(含藻红蛋白量约为7.4mg)，离心管上下倒置10分钟，使之充分吸附，低速离心2分钟去上清液；用上述缓冲液洗涤吸附有藻胆蛋白的羟基磷灰石两次；再加入0.030M的磷酸盐缓冲液洗脱藻红蛋白，至洗脱液无色为止，合并洗脱液，总体积为72ml，OD565＝0.504，含藻红蛋白约为4.4mg；从三叉仙菜粗提液中获得藻红蛋白的得率约为59％。如果再进行一次羟基磷灰石吸附与洗脱过程，藻红蛋白的纯度A565/A280可以达到4以上。一般认为藻红蛋白A565/A280在3.5以上，就是很纯的了，而国外Sigma公司所售的藻红蛋白的产品没有给出具体的纯度。
权利要求
1.一种高纯度藻胆蛋白的分离方法，其特征在于包括以下各步骤一、用低渗的办法制备藻类的抽提物；二、将羟基磷灰石和藻类粗提物混合，使粗提物中的藻胆蛋白吸附到羟基磷灰石上，采用自然沉淀或者低速离心的方法使结合有藻胆蛋白的羟基磷灰石沉淀，去除上清液中藻类粗提物的其他组分；三、进一步用0.001M至0.005M磷酸盐缓冲液(pH6.8)洗涤结合有藻胆蛋白的羟基磷灰石2到3次，以去除没有结合或者结合不牢固的其他组分；四、用0.010M至0.050M的磷酸盐缓冲液(pH6.8)将藻蓝蛋白或者藻红蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来，收集藻蓝蛋白或者藻红蛋白；五、再用0.05M至0.15M磷酸盐缓冲液(pH6.8)洗脱羟基磷灰石，得到别藻蓝蛋白组分，所得的藻胆蛋白制品得率为20％-60％。
2.按照权利要求1所述的高纯度藻胆蛋白的分离方法，其特征在于将从步骤四、五中得到的藻胆蛋白产物再重复步骤二、三、四、五，重复与羟基磷灰石的吸附和洗脱过程，得到的藻胆蛋白纯度将达到4-6。
全文摘要
高纯度藻胆蛋白的分离方法是一种分离纯化高质量的藻胆蛋白制品的方法。为了简化工艺,加快速度,降低成本,主要包括以下步骤:用低渗的办法制备藻类的抽提物;将羟基磷灰石和藻类粗提物混合,去除上清液中藻类粗提物的其他组分;进一步用低浓度磷酸盐缓冲液洗涤结合有藻胆蛋白的羟基磷灰石,以去除其他组分;用中等浓度磷酸盐缓冲液将藻蓝蛋白或者藻红蛋白从羟基磷灰石上洗脱下来,收集藻蓝蛋白或者藻红蛋白;再用较高浓度磷酸盐缓冲液洗脱羟基磷灰石,得到别藻蓝蛋白组分。本发明提高了藻胆蛋白的得率和纯度,有利于大规模工业化生产高纯度的藻胆蛋白,降低分离纯化成本。
文档编号C07K1/14GK1344723SQ01127370
公开日2002年4月17日 申请日期2001年9月3日 优先权日2001年9月3日
发明者王广策, 孙海宝, 马圣媛, 曾呈奎 申请人:中国科学院海洋研究所