专利名称：一种从爪哇伪枝藻中提取藻蓝蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种从爪哇伪枝藻中提取藻蓝蛋白的方法，属于生物技术领域。
技术背景爪哇伪枝藻是一种广泛分布于荒漠生境的丝状蓝藻,它属于蓝藻门、蓝藻纲、 段殖体目、伪枝藻科、伪枝藻属。目前，对爪哇伪枝藻的利用一般只停留在进行 人工藻结皮上。爪哇伪枝藻之所以用于形成人工藻结皮进行荒漠治理，主要的是 由于其富含藻蓝蛋白。藻胆蛋白是存在于某些藻类(主要是红藻和蓝藻)藻胆体中 的一类色素复合蛋白。藻胆蛋白具有强烈的荧光性，发橙红色荧光，而其本身则 呈红色、紫色或蓝色等，故为有色多肽。按光谱特性可把藻胆蛋白分成四类藻 红蛋白，藻蓝蛋白，藻红蓝蛋白和别藻蓝蛋白。藻蓝蛋白是其中的一类蓝色色素 蛋白。藻蓝蛋白除可用于植物光合作用研究外，还具有很高的应用开发价值可 作为纯天然的色素，用于食品、化妆品和染料等工业；试剂级藻蓝蛋白可制成荧 光试剂，应用于医学临床诊断和免疫学及生物工程等研究领域中；还可制成药品 用于医疗保健。目前在食品等行业中使用的蓝色素主要还是化学合成色素，而天 然蓝色素使用的很少，藻蓝蛋白大多是从螺旋藻和大型海藻中提取得到，它们的 藻蓝蛋白含量大都比爪哇伪枝藻的要低，另外，培养大型海藻的成本远比培养爪 哇伪枝藻的成本要高。 发明内容本发明的目的在于提供一种从爪哇伪枝藻中提取藻蓝蛋白的方法，此方法易 行、操作方便、安全可靠、成本低、产品质量好，且设备简单适宜于工业化生产。实现本发明目的采用的技术方案是一种从爪哇伪枝藻中提取藻蓝蛋白的方 法包括如下步骤A、培养液的配制按每升水加入磷酸氢二钾0. 02 0. 05g、硫酸镁0.06 0. 09g、氯化钙0. 02 0. 05g、柠檬酸0. 004 0. 008g、柠檬酸铁铵0. 004 0. 008g、 乙二胺四乙酸二钠盐0.001 0.003g、碳酸钠0.01 0.04g，微量元素溶液 0.5-2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸270 300mg、四水氯 化锰170 200mg、七水硫酸锌18 25mg、 二水钼酸钠15 30mg、五水硫酸铜6 10mg，完全溶解后搅匀即制得培养液；B、 爪哇伪枝藻的培养首先是一级培养，将爪哇伪枝藻种置于培养液中通 气培养，调节气流在1.5-3. 5L.min—'，光强控制在65-85 n E. m-2. s-、温度控制 在22 35'C，培养5 10天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养 所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在2.5 5L.min—'，无菌 处理，光强控制在75 95u E.nT2.s—'，温度控制在22 35°C，培养5 10天后 转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培养液 中通气培养，调节气流在3 6L.min—'，无菌处理，光强控制在70 衡E.m-2.s-'，温度控制在22 35'C,培养5-10天后作为继续培养的接种种 源；继续培养首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种接入小循环培 养池，控制温度在22 35'C，利用自然光进行光照，控制光照强度在120 180ii E.nr2.s-'，搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培养池中培 养4 7天的爪哇伪枝藻转接到大循环培养池中，按小循环培养池与大循环培养 池中培养液的体积比为1:20-25进行扩大，大循环培养池中控制温度在22 35 。C，利用自然光进行光照，控制光照强度在120 180u E.m—2.s—'培养10 20天 后的爪哇伪枝藻过滤收得爪哇伪枝藻藻浆；上述爪哇伪枝藻接种时，按每升培养液0.1-0.5g湿重的比例接入。C、 爪哇伪枝藻粉的制备将藻浆离心获得爪哇伪枝藻藻泥，经浓縮、脱水、 干燥、粉碎后得到爪哇伪枝藻粉；D、 爪哇伪枝藻藻蓝蛋白的抽提向爪哇伪枝藻粉中加入7 10倍重量的 0.05 0. 1 mo1.1/1， pH值为6.0 8.0的磷酸缓冲溶液并充分搅匀，然后置于 -10 -20'C下冰冻，待冻结后取出置于20 3(TC下融溶，待完全融溶后，再将 其冰冻，如此反复冻融3 5次，绝大部分藻蓝蛋白从爪哇伪枝藻细胞中被提取 出来，然后3000 6000rpm离心10-15min，收集上清液即为藻蓝蛋白粗提液；E、 纯化在冰浴条件下，在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为50 70%的 硫酸铵避光盐析20 40min，然后在3 5。C下3000—6000rpm离心15 — 25min， 弃除上清液，用一倍体积的0. 05 0. lmol. L—', pH值为6. 0 8. 0的磷酸缓冲液 溶解沉淀物，避光透析20 30h后离心，取上清液用0.05 0. lmol丄-'，pH值为 6. 0 8. 0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE—52离子交换柱，并用0. 05 0. lmol. L—'，pH值为6. 0 8. 0的磷酸缓冲液和0. 1 0. 3mol. L—'的NaCl溶液洗脱，收集蓝色 组分，冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。本发明与现有技术相比，具有以下优点和卓著的效果方法易行、经济快捷、 操作方便、安全可靠、产量高、产品质量好，且设备简单适用于工业化规模生产。
具体实施方式
从爪哇伪枝藻中提取藻蓝蛋白的具体步骤如下A、 培养液的配制按每升水加入磷酸氢二钾0. 04g、硫酸镁0. 075g、氯化钙0. 036g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、乙二胺四乙酸二钠盐O.OOlg、碳酸钠0.02g，微 量元素溶液lml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸286mg、四水 氯化锰181mg、七水硫酸锌22.2mg、 二水钼酸钠25. 2mg、五水硫酸铜7. 9mg， 完全溶解后搅匀。B、 爪哇伪枝藻的培养(1) 一级培养将爪哇伪枝藻种接入装有培养液的三角瓶(150 200ml)中， 静止培养或通气培养，通气培养时，调节气流大小在2.5L.min'，气流经过棉花 球进行无菌处理，光强控制在70u E.m-2.s—'，温度控制在3(TC。当培养7 10 天后，转入到二级培养。(2) 二级培养将一级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶(500 1000ml)中通气培养，调节气流大小在3L.min—',无菌处理，光强控制在 80u E.m，s—'，温度控制在30。C。当培养7 10天后，转入到三级培养。(3) 三级培养:将二级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶(5000 20000ml)中通气培养，调节气流大小在5L.min—'，无菌处理，光强控制在 90u E.m-2.s-'，温度控制在3(TC。当培养7 10天后，便可作为继续培养的接 种种源。(4) 继续培养① 小循环培养池U 2m3)培养采用三级培养后所得的藻种，接入小循环 培养池。釆用玻璃温棚控制温度在3(TC，利用自然光进行光照，采用遮荫网控 制光照强度在120 180u E.m—2.s—',叶轮或潜水泵搅动培养基。② 大循环培养池(40 60m3)培养将小循环培养池中培养4 7天的爪哇伪枝藻转接到大循环培养池中，小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比 为1:20 25，其他培养条件与小循环培养池的培养条件相同。上述爪哇伪枝藻接种时，按每升培养液0. 1-0. 5g湿重的比例接入。C、 爪哇伪枝藻粉的制备将大循环培养池中培养15 20天后的爪哇伪枝藻用泵抽到过滤装置——振 动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得爪哇伪枝藻藻浆，然后将藻浆经过离心机 离心，获得爪哇伪枝藻藻泥，经浓縮、脱水、干燥、粉碎后得到爪哇伪枝藻粉。D、 爪哇伪枝藻藻蓝蛋白的抽提向爪哇伪枝藻粉中加入7-10倍重量的0. 05-0. lmol. L—1， pH值为6. 0 8. 0 的磷酸缓冲溶液，充分搅匀。然后置于-10 -2(TC下冰冻，待冻结后取出，置于 20 30'C下融溶，待其完全融溶后，再将其冰冻。如此反复冻融3 5次。绝大 部分藻蓝蛋白从爪哇伪枝藻细胞中被提取出来，然后3000 6000rpm离心10 15min。收集上清液，即为藻蓝蛋白粗提液。E、 纯化在冰浴条件下，在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为50 70%的硫酸铵避光 盐析20 40min，然后在3 5。C下3000 6000rpm离心15 25min，弃除上清液， 用一倍体积的0.05 0. lmol.L—1, pH值为6.0 8.0的磷酸缓冲液溶解沉淀物，避 光透析20 30h后离心，取上清液用0.05 0. lmol.L—'， pH值为6. 0-8. O的磷酸缓 冲液平衡好的DEAE—52离子交换柱，并用0.05~0. lmol.L—'， pH值为6. 0 8. 0的 磷酸缓冲液和O. 1 0. 3mol. L—'的NaCl溶液洗脱，用自动部分收集器收集蓝色组 分，冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。
权利要求
1、一种从爪哇伪枝藻中提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤A、培养液的配制按每升水加入磷酸氢二钾0.02～0.05g、硫酸镁0.06～0.09g、氯化钙0.02～0.05g、柠檬酸0.004～0.008g、柠檬酸铁铵0.004～0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001～0.003g、碳酸钠0.01～0.04g，微量元素溶液0.5-2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸270～300mg、四水氯化锰170～200mg、七水硫酸锌18～25mg、二水钼酸钠15～30mg、五水硫酸铜6～10mg，完全溶解后搅匀即制得培养液；B、爪哇伪枝藻的培养首先是一级培养，将爪哇伪枝藻种置于培养液中静止培养或通气培养，调节气流在1.5-3.5L.min-1，光强控制在65-85μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在2.5～5L.min-1，无菌处理，光强控制在75～95μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在3～6L.min-1，无菌处理，光强控制在70～100μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5-10天后作为继续培养的接种种源；继续培养首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种接入小循环培养池，控制温度在22～35℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m-2.s-1，搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培养池中培养4～7天的爪哇伪枝藻转接到大循环培养池中，大循环培养池中控制温度在22～35℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m-2.s-1培养10～20天后的爪哇伪枝藻过滤收得爪哇伪枝藻藻浆；C、爪哇伪枝藻粉的制备将藻浆离心获得爪哇伪枝藻藻泥，经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到爪哇伪枝藻粉；D、爪哇伪枝藻藻蓝蛋白的抽提向爪哇伪枝藻粉中加入7～10倍重量的0.05～0.1mol.L-1，pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲溶液并充分搅匀，然后置于-10～-20℃下冰冻，待冻结后取出置于20～30℃下融溶，待完全融溶后，再将其冰冻，如此反复冻融3～5次，绝大部分藻蓝蛋白从爪哇伪枝藻细胞中被提取出来，然后3000～6000rpm离心10-15min，收集上清液即为藻蓝蛋白粗提液；E、纯化在冰浴条件下，在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为50～70％的硫酸铵避光盐析20～40min，然后在3～5℃下3000～6000rpm离心15～25min，弃除上清液，用一倍体积的含0.05～0.1mol.L-1，pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液溶解沉淀物，避光透析20～30h后离心，取上清液用0.05～0.1mol.L-1，pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE一52离子交换柱，并用0.05～0.1mol.L-1，pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液和0.1～0.3mol.L-1的NaCl溶液洗脱，收集蓝色组分，冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。
2.根据权利要求1所述的从爪哇伪枝藻中提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为1:20 25。
全文摘要
本发明公开了一种从爪哇伪枝藻中提取藻蓝蛋白的方法，首先将磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐、碳酸钠，微量元素溶液按比例配制成爪哇伪枝藻培养液；其次将爪哇伪枝藻置于培养液中培养并制取爪哇伪枝藻粉，最后从爪哇伪枝藻粉中提取爪哇伪枝藻藻蓝蛋白并将其纯化。本发明方法易行、操作方便、安全可靠、产量高、产品质量好，且所用设备简单适用于工业化规模生产。
文档编号C07K1/14GK101240012SQ200810046769
公开日2008年8月13日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者刘永定, 沈银武, 王焰新, 胡春香, 谢作明 申请人:中国地质大学(武汉)