专利名称：亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法，用于海洋 赤潮藻的分子生物学检测，属于微生物分子技术领域。
背景技术：
我国自1972年以来因赤潮造成的经济损失每年高达10亿元以上，有些特大赤潮 一次就能影响到几千平方公里的海域，造成几亿元的经济损失。尤其是近年来赤潮频繁发 生，给国家造成了巨大损失。因此，赤潮藻的检测尤为重要，赤潮藻的快速、灵敏、准确的检 测，可以起到预警赤潮爆发的作用。现在主要通过形态学分类方法、免疫学、分子生物学技术对有毒赤潮藻进行检测。 形态学分类方法常常由于样品中低的生物浓度等困难，限制了人们对赤潮藻的鉴定。免疫 学方法存在抗原抗体特异性识别问题和抗原抗体交叉干扰等的缺陷。分子生物学技术因其 操作简便、快速、灵敏等优点弥补了两种方法的不足。我国沿海赤潮生物有40多个属，150余种，除属于原生动物的红色中缢虫外均为 浮游植物，其中甲藻70余种。亚历山大藻是一种可产生麻痹性贝毒素(PSP)的海洋甲藻， 其适应能力强、生存范围广，是引起赤潮的主要藻。荧光定量聚合酶链反应Real-time PCR技术(Real-time FluorescentQuantitative Polymerase Chain Reaction, real-time PCR),是指在 PCR 反 应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对 未知模板进行定量分析的方法。Real-time PCR的质量保证最为重要的一个因素就是标准 品的使用。定量结果的准确性在很大程度上依赖标准品的准确性，因此定量标准品的制备 就显得尤为重要。以往以DNA或PCR产物做标准品都存在不稳定的缺点，容易引起结果不 准确现象。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种亚历山大藻荧光定量聚合酶链 反应标准品的构建方法，方法简便，构建的标准品能用于快速、方便的进行亚历山大藻的 real-time PCR检测，检测灵敏度高。为实现上述目的，本发明利用基因克隆和real-time PCR技术，构建亚历山大藻 real-time PCR标准品。通过提取的亚历山大藻A. catenella ACDHOl的DNA为模板，聚合 酶链反应扩增A. catenella的18S rDNA到28S rDNA基因片段，并将扩增产物和T载体连 接，构建重组质粒。经确认的重组质粒梯度稀释成聚合酶链式反应标准品；以5. 8S-b5’和 5. 8S-b3’为引物，以重组质粒标准品为模板，real-time聚合酶链反应，根据反应中的临界 循环数以及重组质粒标准品的梯度浓度制备标准曲线。本发明方法可以应用于亚历山大藻的real-time PCR检测。本发明方法具体步骤如下
1.对培养的亚历山大藻细胞计数，提取亚历山大藻A. catenellaA⑶HOl的DNA，并 测定DNA在260nm的吸光值；2.以提取的 Acatenella ACDHOl 的 DNA 为模板，以 18S rDNA 序列 5 ‘ -CTTAGAGGAAGGAGAAGTCG-3，和 28S rDNA 序列 5 ‘ -GGAGGGACCAGCTACTA-3，为引物，聚合 酶链式反应扩增18S rDNA-28S rDNA区的片段；扩增的1600bp片段与pEASY-Blunt Simple 载体连接成重组质粒，将重组质粒转化宿主菌Transl-Tl，提取宿主菌Transl-Tl内重组质 粒，经聚合酶链式反应鉴定及测序分析确认；3.检测经确认的重组质粒260nm吸光值，确定重组质粒的原液拷贝浓度，并将重 组质粒原液稀释，得到梯度浓度为107-102COpieS/mL数量级的real-time聚合酶链式反应 重组质粒标准品；4.以重组质粒标准品为模板，以5.8S-b5，5 ‘GATGAAGAATGCAGCAAAATG3，禾口5.8S-b3，5 ‘CAAGCAAACCTTCAAGAATATCC3，为引物，进行real-time聚合酶链式反应，根据反应中的临界循环数以及重组质 粒标准品的梯度浓度，制作real-time聚合酶链式反应标准曲线。采用本发明方法，可以准确、高效、快速地构建亚历山大藻real-time PCR的标准 品。克服了传统形态学观察方法费时、不准确的缺点，以及克服了以DNA或者PCR产物作为 real-time PCR标准品不稳定的缺点。本发明成功构建了包含A. catenella ACDHOl核糖体18S rDNA到28S rDNA基因 片段的重组质粒，重组质粒作为real-time PCR标准品，标准曲线的线性范围为IO2 IO7 拷贝，阈值循环数与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r = 0. 99),E = 1. 16， 扩增效率较好。本发明适合亚历山大藻分子生物学检测中real-time PCR标准品的构建和亚历山 大藻的real-time PCR检测。
图1为本发明的方法流程图。图2为亚历山大藻核糖体DNA模式图。图 3A. catenelIaACDH 01 的目的基因 PCR 电泳图。图4为本发明中real-time PCR标准曲线。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不构成对 本发明的限定。图1为本发明方法的流程框图。如图1所示，本发明首先提取亚历山大藻 A. catenella ACDHOl 的 DNA，以 A. catenella ACDHOl 的 DNA 为模板，以 18SrDNA 序列和 28S rDNA序列为引物，PCR扩增18S rDNA_28S rDNA区的片段，扩增的片段与pEASY-Blunt Simple载体连接，重组质粒测序后，作为标准品，进行real-time PCR标准曲线的测定。利 用此标准曲线可以对待测的亚历山大藻进行real-time PCR检测。
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本发明实施例按以下步骤进行1.亚历山大藻的培养和计数亚历山大藻A. catenellaA⑶H 01分别接种到f/2 人工海水培养基中，20°C，光照培养14h，黑暗培养10h。培养器皿为经高压灭菌的250mL三 角烧瓶，每个瓶中加入150mL培养液后，按5 1的比例加入藻液，置于光照箱中静置培养， 通过传统的显微镜方法进行藻细胞计数，吸取0. Im L不同浓度藻液，置于容量为0. Im L、表 面积为20mmX20mm的计数框内，在显微镜下全部计数，计数3次取其平均值。亚历山大藻DNA的提取取4mL藻细胞液离心并加入150 μ L缓冲液 (20mMTris-HCL, ρΗ 7. 5)冲洗 2 次，细胞沉淀用 Qiagen DNeasy Blood&tissue kit 试剂 盒提取DNA。对提取的DNA进行紫外分光光度计检测(DU-650，Beckman)，根据0D260nm/ 0D280nm值对DNA的质量和浓度进行评估。2. A. catenella ACDHOl 的 18S-28S rDNA 基因扩增及克隆以 A. catenella ACDHOl 的 18S rDNA 5 ‘-CTTAGAGGAAGGAGAAGTCG-3，和 28S rDNA 5 ‘-GGAGGGACCAGCTACTA-3，为引物，以 A. catenellaACDHOl 的 DNA 为模板，PCR 扩 增18S-28S rDNA目的条带。亚历山大藻核糖体DNA模式图如图2所示，包括18S rDNA, ITSl (内转录间隔区，internaltranscribedspacer)，5. 8S rDNA, ITS2 和 28S rDNA。反应 体系(25 μ L) :5XPCR buffer，5· 0μ L ;2· 5mMdNTP mixture，2· 5 μ L (各 0· 2mmol/L)；上 游引物，0. 5μ L(0. 5ymol/L)；下游引物 0. 5μ L(0. 5ymol/L)；模板 DNA，2. 0yL(30ng)； Transstart Fastpfu DNA polymerase, 0· 5 μ L ；灭菌双蒸 7jC, 13. 5 μ L。反应条件 95°C 2min ；95°C 20s, 52°C 20s, 72°C 2min，30 循环；72°C 8min。1. 0%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒(上海生物工程有限公司)回收并纯化 1600bp片段。图3为常规聚合酶链式反应扩增A. catenella ACDH01的18SrDNA_28S rDNA 区1600bp片段。纯化产物与载体PEASY-Tl (北京全式金生物技术有限公司)连接，并转化 大肠杆菌 Transl-Tl (980(/acZ)AM15A/acX74fct/R(rk"mk+) ArecA1398e t/Alto A)，采用质
粒提取试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)提取白色重组菌落的重组质粒，用载体引 物T7/M13进行PCR扩增筛选，并对扩增结果阳性的重组质粒进行测序(上海美季生物技术 有限公司)确认。在http://www. ncbi. nlm. nih. rov上采用Blast软件进行序列同源性比 对。3. Real-timePCR 标准品的测定检测经确认的重组质粒260nm吸光值，确定重组质粒的原液拷贝浓度，并将重组 质粒原液稀释，得到梯度浓度为107-102COpieS/mL数量级的real-time聚合酶链式反应重 组质粒标准品。4. Real-time PCR标准曲线的测定以重组质粒标准品为模板，以 5. 8S-b5，5 ‘GATGAAGAATGCAGCAAAATG3，和 5. 8S-b3，5 ‘CAAGCAAACCTTCAAGAATATCC3，为引物，进行 real-time 聚合酶链式反 应。冰上配制 real-time PCR 反应液SYBR Premix Ex Taq II 10. 0 μ L，上游引物 5.8S-b5，(10. 0μΜ)0. 8μ L,下游引物 5. 8S_b3，(10. 0 μ Μ) 0. 8 μ L, ROX ReferenceDye 0. 4μ L, DNA 模板 6· 0μ L，共 20μ L ；real-time PCR 程序95°C 2min ；95°C 15s，52°C 15s, 72°C 20s,40循环。每个样品3次重复，根据反应中的临界循环数(Threshold cycle, Ct) 以及重组质粒标准品的梯度浓度对数值，制作real-time聚合酶链式反应标准曲线。获得的real-time PCR标准曲线如图4所示。本发明用于亚历山大藻real-time PCR检测的实例四株待测藻(A. catenella, A. affine, A. Iusitanicum 禾口 k. minutum)的 DNA 定量并稀释后作为模板，以重组质粒作为标准品，以5. 8S-b5’和5.8S-b3’为引物，进行 real-time PCR检测。能够检测到最少的细胞数目分别为24 (A. catenella) ,35 (A. affine)、 78 (A. lusitanicum)禾口 105 (A. minutum)个细胞。
权利要求
一种亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)对培养的亚历山大藻细胞计数，提取亚历山大藻A.catenella ACDH01的DNA，并测定DNA在260nm的吸光值；2)以提取的A.catenella ACDH01的DNA为模板，以18S rDNA序列5‘ CTTAGAGGAAGGAGAAGTCG 3’和28S rDNA序列5‘ GGAGGGACCAGCTACTA 3’为引物，聚合酶链式反应扩增18S rDNA 28S rDNA区的片段；扩增的1600bp片段与pEASY Blunt Simple载体连接成重组质粒，将重组质粒转化宿主菌Trans1 T1，提取宿主菌Trans1 T1内重组质粒，经聚合酶链式反应鉴定及测序分析确认；3)检测经确认的重组质粒260nm吸光值，确定重组质粒的原液拷贝浓度，并将重组质粒原液稀释，得到梯度浓度为107 102copies/mL数量级的real time聚合酶链式反应重组质粒标准品；4)以重组质粒标准品为模板，以5.8S b5’5‘GATGAAGAATGCAGCAAAATG3’和5.8S b3’5‘CAAGCAAACCTTCAAGAATATCC3’为引物，进行real time聚合酶链式反应，根据反应中的临界循环数以及重组质粒标准品的梯度浓度对数值，制作real time聚合酶链式反应标准曲线。
全文摘要
本发明涉及一种亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法，通过提取A.catenella ACDH01的DNA，聚合酶链反应扩增A.catenella的18SrDNA到28S rDNA基因片段，并将扩增产物和T载体连接，构建重组质粒。经确认的重组质粒梯度稀释成聚合酶链式反应标准品；以5.8S-b5’和5.8S-b3’为引物，以重组质粒标准品为模板，real-time聚合酶链反应，根据反应中的临界循环数以及重组质粒标准品的梯度浓度对数值制备标准曲线。本发明建立了带有A.catenella的18S rDNA-28S rDNA基因片段的重组质粒real-time聚合酶链反应标准品，采用一对通用引物，可以准确、高效、快速地对待测的亚历山大藻进行real-time聚合酶链反应检测。
文档编号C12R1/89GK101914615SQ201010186100
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者张风丽, 李志勇 申请人:上海交通大学