专利名称：玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用。
背景技术：
玉米是重要的粮食、饲料和工业原料作物，在国民经济发展中占有重要地位。我国 自2007年以来，玉米已是播种面积上的第一大作物。氮肥是玉米产量的重要的限制因素。 然而，氮肥施用量上升的幅度远远大于玉米增产的幅度，我国玉米生产对氮肥的依赖强，氮 肥利用效率低，玉米等禾谷类作物氮利用效率平均仅约为33%。大量施用氮肥，还引起地下 水硝酸盐含量超标、地表水体富营养化等面源污染。因此，玉米氮利用效率与耐低氮相关的 基础与应用研究是我国当前农业科研领域的重大需求，具有十分重要的意义。当前，玉米品 种增产的主要途径是进一步增加播种密度，随着密度的上升，玉米植株之间对环境养分的 竞争将进一步加剧。因此，氮高效与耐低氮玉米品种选育是未来商业玉米育种中品种培育 与遗传改良的重要方向。由于氮高效利用等复杂农艺性状往往受多基因位点控制和环境影响等原因，常规 筛选很难收到理想效果。谷氨酰胺合成酶是玉米等禾谷类作物氮利用效率相关的氮同化、 活化、转运与再同化途径的代谢中枢酶，是氮同化及氮利用效率的关键基因，也是了解玉米 等禾谷类作物氮利用效率的重要切入点。研究也表明，低氮情况下籽粒数的高低对产量的 影响最大，因此，提高低氮逆境下玉米穗部籽粒数，是耐低氮品种改良与选择的重要方向。育种材料选育过程中，杂交、回交或自交过程中均是人工授粉，授粉质量直接决定 了籽粒数与结实性，待选育材料的籽粒数并不是基因效应的体现。同时，籽粒数还受复杂的 环境效应影响。因此，材料选择过程中，常规育种方法无法对玉米籽粒数性状进行选择。也 即通常所说的，育种过程中性状对选择不会响应。此外，研究低氮逆境下育种材料的产量对 低氮处理的表现，需要建立贫瘠试验条件。发展一种普通条件下依据基因型选择的技术可 以有效的解决上述两个问题，具有重要的开发与利用价值。
发明内容
本发明的目的是提供玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开 发与应用，具体设计一种12bp的标记，基于该标记的引物对及其在辅助鉴别在低氮环境下 具有不同单株籽粒数目性状的玉米中的应用。本发明提供了辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的引物对， 是序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。所述引物对可用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米。本发明还保护一种辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的方 法，包括如下步骤以待测玉米的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增；如果PCR 扩增产物为一种，且大小为329bp，待测玉米为插入纯合型；如果PCR扩增产物为一种，且大小为317bp，待测玉米为缺失纯合型；缺失纯合型(优良基因型)玉米在低氮环境下的单株 籽粒数目高于插入纯合型(非优良基因型)玉米在低氮环境下的单株籽粒数目。如果PCR 扩增产物为两种，大小分别为329bp和317bp，待测玉米为插入/缺失杂合型，可以其后代 中，分离得到缺失纯合型(优良基因型)。本发明还保护一种玉米育种方法，是选择所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米进行 育种。本发明还保护另一种玉米育种方法，包括如下步骤将供体亲本与受体亲本杂交 得到Fl代，将Fl代自交，得到F2代；以F2代玉米的基因组DNA为模板，用所述引物对进行 PCR扩增；PCR扩增产物为一种且大小为317bp的F2代玉米为选育得到的玉米；所述供体亲 本为采用所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米，所述受体亲本为采用所述方法鉴别出的插入 纯合型玉米。所述供体亲本具体可为玉米品种CA156，所述受体亲本具体可为玉米品种武314。PCR扩增产物可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法或琼脂糖凝胶电脉溴化乙锭 (EB)进行检测。所述引物对可用于制备辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米 的试剂盒。本发明还保护序列表的序列4所示的DNA，即12bp的缺失区域，该区域可以作为分 子标记，用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米，进而用于玉米育 种。以上所述低氮环境均指全氮量低于0. 4% (质量百分含量)的土壤。耐氮贫瘠稳产品种是发展方向，选择低氮逆境下高籽粒数是重要的选择性状。本 发明的方法可用于选择低氮逆境下具有高籽粒数性状的玉米品种，将其用于育种。本发明 的方法可以在早期种子(取部分胚乳不影响播种后种子活力)或幼苗阶段筛选，受体可以 是已知的常用的玉米育种亲本，也可以是未知材料，如自交系、杂交种、地方品种、开放授粉 群体等种质资源，获得含有目标基因型的个体，对培育高产、稳产、抗逆的玉米品种具有重 要指导作用，是针对基因的选择，加快育种速度，降低育种成本，并具有操作简单，成本低 廉，周期短的优点，适于推广应用，为玉米种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法，具有很 高的开发价值。
图1为两年低氮环境下各性状对产量性状及性状之间的作用的通径分析；叶绿素 含量以SPAD计测定大喇叭口期相对叶绿素含量值；生物量以GreenSeeker测定的大喇 叭口期相对生物量NDVI值；# φ = 0. 01水平显著；ns 不显著。图2为实施例5中F2代植株的鉴定电泳图；size 分子量marker ；I 纯合插 入(Insertion)基因型；D 纯合缺失(Deletion)基因型；C 插入/缺失杂合的共显性 (Co-dominant)基因型。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验
4方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。 实施例1中用于优异等位基因鉴定的180个玉米自交系(见表1)均为我国玉米 育种当前经常应用的亲本自交系；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。各个自 交系的遗传背景分析结果参见(Chuanxiao Xie, Shihuang Zhang,Minshun Li,Xinhai Li, Zhuanfang Hao,Li Bai,Degui Zhang,Yehong Liang. (2007)Inferring genome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbredlines. J. Genet. & Genomics 34(8) :738_748)，并作为主要遗传类群的依据。
表1关联性分析自然群体自交系及其系谱来源
权利要求
辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的引物对，是序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。
2.权利要求1所述引物对在辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米 中的应用。
3.一种辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的方法，包括如下步 骤以待测玉米的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增；如果PCR扩 增产物为一种，且大小为329bp，待测玉米为插入纯合型；如果PCR扩增产物为一种，且大小 为317bp，待测玉米为缺失纯合型；缺失纯合型玉米在低氮环境下的单株籽粒数目高于插 入纯合型玉米在低氮环境下的单株籽粒数目。
4.一种玉米育种方法，是选择权利要求3所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米进行育种。
5.一种玉米育种方法，包括如下步骤将供体亲本与受体亲本杂交得到Fl代，将Fl代 自交，得到F2代；以F2代玉米的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩 增；PCR扩增产物为一种且大小为317bp的F2代玉米为选育得到的玉米；所述供体亲本为 采用权利要求3所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米，所述受体亲本为采用权利要求3所述 方法鉴别出的插入纯合型玉米。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述供体亲本为玉米品种CA156，所述受体 亲本为玉米品种武314。
7.权利要求1所述引物对在制备辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状 玉米的试剂盒中的应用。
8.序列表的序列4所示的DNA。
9.权利要求8所述DNA在辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米中的应用。
10.权利要求8所述DNA在玉米育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用。本发明提供分子标记是序列表的序列4所示的DNA。基于该标记，本发明提供了序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。所述分子标记和所述引物对可用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米，进而用于玉米育种。本发明的方法可以在早期种子或幼苗阶段筛选，对培育高产、稳产、抗逆的玉米品种具有重要指导作用，可以加快育种速度，降低育种成本，并具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为玉米种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法，具有很高的开发价值。
文档编号C12N15/11GK101942512SQ201010263549
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者吴永升, 张世煌, 张德贵, 李新海, 李明顺, 白丽, 翁建峰, 谢传晓, 郝转芳, 陈现平 申请人:中国农业科学院作物科学研究所