专利名称：在酵母菌中产生衣康酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种产生衣康酸(itaconic acid)的方法，且特别涉及一种以甘油为 基质在酵母菌中产生衣康酸(itaconic acid)的方法。
背景技术：
在化学工业中高度需要的衣康酸(itaconic acid, ΙΑ)为前体化合物一般使用于 多种产品的制造，例如丙烯酸系纤维(acrylic fiber)、橡胶、人工钻石与镜片。特定丝状 真菌(filamentous fungi)(例如黑穗菌(Ustilago)、膏药病菌(Helicobasidium)与曲 菌(Aspergillus))将单糖转换为此化合物。已发现顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)在衣康酸的生物合成中扮演关键角色。
发明内容
本发明意外地发现，当将经基因修饰表达顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞培养在含甘油的培养基 中时，其高度产生衣康酸(itaconicacid)。因此，本发明以使用甘油作为基质在酵母细胞中产生衣康酸的方法为特征。 此方法包括(i)提供经基因修饰的酵母菌宿主细胞，其包含第一表达框(expression cassette)，第一表达框包括第一酵母菌启动子(promoter)，第一酵母菌启动子可操作地被 连结至编码顺乌头酸脱羧酶的核苷酸序列，(ii)在允许甘油转换为衣康酸的适合条件下， 培养酵母菌宿主细胞于含有甘油浓度为5至700g/L(例如，5至250g/L)的培养基中，以及 (iii)收集此培养基以分离衣康酸。在此方法中，甘油可为合成衣康酸的唯一基质。酵母菌 宿主细胞(例如，解脂耶氏酵母)可还包含第二表达框，与视需要包含第三表达框，其各包 括酵母菌启动子，被操作地连结至编码柠檬酸合成酶(citrate synthase, CS)或乌头酸酶 (aconitase，Aco)的核苷酸序列。上述的任何酵母菌启动子可为hp4d、pTEF、pRPS7或pG3P。 三个表达框的每一个可包括引导序列(Ieadersequence)于编码顺乌头酸脱羧酶、柠檬酸 合成酶或乌头酸酶的核甘酸序列的上游且读码框定向(in-frame with)至编码顺乌头酸脱 羧酶、柠檬酸合成酶或乌头酸酶的核甘酸序列。在一个例子中，引导序列编码MSAILSTTSKS FLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS的氨基酸序列。在另一例子中，其编码MKLATAFTILTAVLA。本发明也包括核酸序列，其包括第一、第二，与视需要而定第三表达框，各表达框 包含酵母菌启动子，其与编码衣康酸合成相关的酶的核苷酸序列操作性连结。在一个例子 中，核酸包含两个表达框，编码顺乌头酸脱羧酶的第一表达框与编码柠檬酸合成酶或乌头 酸酶的第二表达框。在另一实施例中，核酸包含编码编码顺乌头酸脱羧酶、柠檬酸合成酶与 乌头酸酶的三个表达框。为了让本发明的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施 例，并配合所附图示，作详细说明如下。
图1为图式，其显示在表达顺乌头酸脱羧酶、柠檬酸合成酶与乌头酸酶的经基因 修饰的解脂耶氏酵母细胞中甘油至衣康酸的转变。图2A为图式，其显示表达顺乌头酸脱羧酶(框a)、顺乌头酸脱羧酶与柠檬酸合成 酶(框b)、顺乌头酸脱羧酶与乌头酸酶(框c)，及顺乌头酸脱羧酶、柠檬酸合成酶与乌头酸 酶(框d)的DNA框。图2B为表达载体pYLE的图谱。Sal I与Cla I为克隆上述读码框的限制位点。图3为曲线图，其显示在不同时间点，在含甘油与葡萄糖的培养的培养基中的衣 康酸浓度。在上述图中101表示甘油；103表示经基因工程的酵母细胞；105表示发酵作用；107表示衣康酸
具体实施例方式此处所述为使用甘油(可为生质柴油副产品)101作为基质在经基因工程的酵母 细胞103中(经发酵作用105)产生衣康酸(itaconicacid) 107 (生物材料的构成要素)的 方法。参见图1。设计经基因修饰的酵母菌(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵 母(Saccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、毕赤酵母菌(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)与 Pseudozyma antarctica)以高禾呈 度表达顺乌头酸脱羧酶，与视需要而定以高程度表达柠檬酸合成酶及/或乌头酸酶。此处使用的术语“顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase) ”或 “CAD”意指自然发生的顺乌头酸脱羧酶(例如，叙述在Dwiarti et al. , J. Bioscience and Bioengineering,94(l) :29_33，2002 and W02009/014437 中的土曲菌(Aspergillus terreus)顺乌头酸脱羧酶)与其功能等同物(functional equivalent)。以下提供为示范 的土曲菌(Aspergillusterreus)顺乌头酸脱羧酶的核甘酸序列(序列标识号1)与氨基 酸序列(序列标识号2)土曲菌(Aspergillus terreus)顺乌头酸脱羧酶atgaccaagcagtctgctgattccaacgcgaagtctggtgtgacctctgagatctgtcacMTKQ SADSNAKSGVT SEICHtgggcgtctaatctcgccactgatgatatcccgagcgacgttctggagcgtgcaaaatacWASN LATDDIPSDVL ERAKYctgatcctggatggtatcgcgtgcgcgtgggtaggtgctcgtgtcccatggtctgaaaaaLILD GIACAffVGARV PffSEKtacgttcaagcgaccatgtctttcgaacctccgggtgcgtgtcgtgtcatcggttacggcYVQA TMSFEPPGACR VIGYGcagaaactgggtccggtagcggctgccatgacgaactctgcatttattcaggcgaccgaa
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ctgaattgtccggttaaatccccactggtttaaLNCPVKSP LV-此处使用的术语“柠檬酸合成酶”与“乌头酸酶”分别将意指将草酰乙酸 (oxaloacetate)转换为柠檬酸(citrate)，与将柠檬酸或异柠檬酸(isocitrate)转换为乌 头酸的酶，其包括两者自然发生的酶与其功能等同物(functional equivalent)。以下提供 为大肠杆菌(Escherichia coli)柠檬酸合成酶(citrate synthase)的核甘酸序列(序列 标识号3)与氨基酸序列(序列标识号4)、乌头酸酶A(aC0nitase Α)的核甘酸序列(序 列标识号5)与氨基酸序列(序列标识号6)以及乌头酸酶B(aC0nitase B)的核甘酸序列 (序列标识号7)与氨基酸序列(序列标识号8)大肠杆菌(Escherichia coli)柠檬酸合成酶atggctgatacaaaagcaaaactcaccctcaacggggatacagctgttgaactggatgtgMADTKAKL TLNGDTAV ELDVctgaaaggcacgctgggtcaagatgttattgatatccgtactctcggttcaaaaggtgtgLKGTLGQD V I D I R T L G SKGVttcacctttgacccaggcttcacttcaaccgcatcctgcgaatctaaaattacttttattFTFDPGFT STASCESK ITFIgatggtgatgaaggtattttgctgcaccgcggtttcccgatcgatcagctggcgaccgatD G D E G I L L H R G F P I D Q LATDtctaactacctggaagtttgttacatcctgctgaatggtgaaaaaccgactcaggaacagSNYLEVC Y I L L N G E K PTQEQtatgacgaatttaaaactacggtgacccgtcataccatgatccacgagcagattacccgtYDEFKTT V T R H T M I H EQITRctgttccatgctttccgtcgcgactcgcatccaatggcagtcatgtgtggtattaccggcLFHAFRR DSHPMAVM CGITGgcgctggcggcgttctatcacgactcgctggatgttaacaatcctcgtcaccgtgaaattALAAFYH DSLDVNNP RHREIgccgcgttccgcctgctgtcgaaaatgccgaccatggccgcgatgtgttacaagtattccAAFRLLS KMPTMAAM CYKYSattggtcagccatttgtttacccgcgcaacgatctctcctacgccggtaacttcctgaatIGQPFVY PRNDLSYA GNFLNatgatgttctccacgccgtgcgaaccgtatgaagttaatccgattctggaacgtgctatgMMFSTPC E P Y E V N P I LERAMgaccgtattctgatcctgcacgctgaccatgaacagaacgcctctacctccaccgtgcgtDRILILH ADHEQNAS TSTVRaccgctggctcttcgggtgcgaacccgtttgcctgtatcgcagcaggtattgcttcactgTAGSSGA N P F A C I A A GIASLtggggacctgcgcacggcggtgctaacgaagcggcgctgaaaatgctggaagaaatcagcWGPAHGG ANEAALKM LEEIStccgttaaacacattccggaatttgttcgtcgtgcgaaagacaaaaatgattctttccgc
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其它柠檬酸合成酶与乌头酸酶的例子列在下方表1中表1、示范的柠檬酸合成酶与乌头酸酶的GenBank登录号(GenBankAccession Numner)
权利要求
一种在酵母菌中产生衣康酸的方法，包括提供经基因修饰的酵母菌宿主细胞，该宿主细胞包含第一表达框，其包括第一酵母菌启动子，该第一酵母菌启动子可操作地被连结至编码顺乌头酸脱羧酶的核苷酸序列；在含有甘油浓度为5 700g/L的培养基中培养该酵母菌宿主细胞；以及收集该培养基以分离衣康酸。
2.根据权利要求1所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该经基因修饰的酵母菌 宿主细胞还包含第二表达框，其包括第二酵母菌启动子，该第二酵母菌启动子可操作地被 连结至编码柠檬酸合成酶或乌头酸酶的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中在该第二表达框中的该 核苷酸序列编码柠檬酸合成酶，且该经基因修饰的酵母菌宿主细胞还包含第三表达框，该 第三表达框由第三启动子所组成，该第三启动子可操作地被连结至编码乌头酸酶的核苷酸 序列。
4.根据权利要求1所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该甘油为产生衣康酸的唯一基质。
5.根据权利要求4所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该培养基含有甘油浓度 为 5-250g/L。
6.根据权利要求1所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该第一酵母菌启动子选 自由hp4d、pTEF、pRPS7与pG3P所组成的群组。
7.根据权利要求2所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该第一酵母菌启动子为 pTEF，且该第二启动子为pRPS7。
8.根据权利要求3所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该第一酵母菌启动子为 pTEF、该第二酵母菌启动子为pRPS7，且该第三酵母菌启动子为pG3P。
9.根据权利要求1所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该第一表达框在编码顺 乌头酸脱羧酶的该核苷酸序列的上游还包括引导序列。
10.根据权利要求9所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该引导序列编码MSAIL STTSKSFLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS 或 MKLATAFTILTAVLA 的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该酵母菌宿主细胞为 解脂耶氏酵母细胞。
12.根据权利要求11所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该酵母菌启动子选自 由hp4d、pTEF、pRPS7与pG3P所组成的群组。
13.根据权利要求11所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该解脂耶氏酵母细胞 还包含第二表达框，其包括第二酵母菌启动子，该第二酵母菌启动子可操作地被连结至编 码柠檬酸合成酶或乌头酸酶的核苷酸序列。
14.根据权利要求13所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该第一酵母菌启动子 为pTEF，且该第二启动子为pRPS7。
15.根据权利要求11所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中在该第二表达框中的 该核苷酸序列编码柠檬酸合成酶，且该解脂耶氏酵母细胞还包含第三表达框，该第三表达 框由第三酵母菌启动子与编码乌头酸酶的核苷酸序列所组成。
16.根据权利要求15所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该第一酵母菌启动子为pTEF、该第二酵母菌启动子为pRPS7，且该第三酵母菌启动子为pG3P。
17.根据权利要求11所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该甘油为产生衣康酸 的唯一基质。
18.根据权利要求17所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该培养基含有甘油浓 度为 5-250g/L。
19.根据权利要求11所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该第一表达框在编码 顺乌头酸脱羧酶的该核苷酸序列的上游还包括引导序列。
20.根据权利要求19所述的在酵母菌中产生衣康酸的方法，其中该引导序列编码MSAI LSTTSKSFLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS 或 MKLATAFTILTAVLA 的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及在酵母菌中产生衣康酸的方法，其使用甘油作为基质在酵母细胞中产生衣康酸(itaconic acid)。酵母细胞高度表达顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase)且是需要高度表达柠檬酸合成酶(citrate synthase)及/或乌头酸酶(aconitase)。
文档编号C12P7/44GK101993899SQ201010263379
公开日2011年3月30日 申请日期2010年8月25日 优先权日2009年8月25日
发明者王嘉宏, 蔡书宪, 邓克立 申请人:财团法人工业技术研究院