专利名称：一株降解棉酚的红冬孢酵母及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，涉及一株降解棉酚的红冬孢酵母及其应用。
背景技术：
棉籽饼粕是重要的植物蛋白质饲料资源，在一定程度上可以弥补蛋白质资源的不足，但由于棉籽饼粕中存在棉酚、氨基酸含量低且不平衡和粗纤维含量高等原因限制了其在养殖业中的大量广泛使用。饲粮中包含一定量的游离棉酚(free gossypol, FG)会对动物生长、繁殖以及胃肠道和体组织器官产生负面作用。利用微生物发酵棉籽粕，不但可使re 含量大大降低而起到脱毒作用，而且可以显著提高棉籽粕的营养价值，使其在畜禽饲料中使用量显著增加。顾赛红等和Zhang等研究表明，微生物发酵棉籽粕降低了棉粕中棉酚含量，同时提高了蛋白质和氨基酸等营养物质的含量及消化吸收率。Wu等和Kornegay等亦有类似的研究结果。张文举等利用热带红冬孢酵母菌ZD-3对棉籽粕进行固体发酵，脱毒率高达91. 91%。目前微生物发酵棉籽粕的研究，主要集中在对脱毒菌株的筛选及其脱毒效果和脱毒后粗蛋白等常规营养成分变化的研究。但是微生物发酵棉籽粕仍存在诸多问题发酵菌株性能不稳定、耐受性低；微生物的脱毒机理复杂，高效脱毒菌株降解棉酚的详细机制仍然不清楚；菌种发酵棉籽粕及其工艺条件尚缺乏充分的理论基础。本实验室已筛选出棉酚降解率为71. 90%、粗蛋白提高28. 96%的复合发酵菌株，单一菌株最高脱毒率达88. 88% (夏新成，李贵强，滕安国，等.复合发酵棉籽粕菌种筛选、鉴定及其发酵工艺参数优化研究，[J]中国粮油学报，2010，，25(1) :91-97)。优良的菌种是发酵工业的基础和关键，因此， 选育性能优良的生产菌种是改善发酵产品质量的关键。所以本发明通过诱变，进一步改良、 筛选菌种，以期得到棉酚降解率更高的优良菌株，为棉籽饼粕的广泛安全使用提供基础。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中棉酚降解菌性能不稳定的缺陷，提供一株稳定性高、棉酚降解能力强的棉酚降解菌株。本发明生产的降解菌株可极显著降低棉籽粕的棉酚含量，提高了棉籽粕的营养价值，丰富了高效降解棉籽粕毒性的菌种资源。本发明成功地解决了饲料工业和养殖业中棉籽粕饲用率低、蛋白质饲料资源紧缺的问题，为棉籽饼粕的广泛安全使用提供了基础。本发明的另一目的是提供该棉酚降解菌株的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现红冬孢酵母HJ-D-20 (Rhodosporidium paludigenum)，该菌株于 2010 年 11 月 26 日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 4372。红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)主要形态学特性为红色，圆形。红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)主要培养学特性为该菌株能在马铃薯琼脂培养基中生长，能在查氏培养基中生长。红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)主要生理生化特性为该菌株能发酵葡萄糖；能以0. 4%醋酸棉酚为唯一碳源进行生长。该菌株(CGMCCNo. 4372) 16srDNA 的 Genbank 登录号为 AF444493. 1。
经菌种鉴定， HJ-D-20为酵母菌目酵母菌科红冬孢酵母属Rhodosporidium paludigenum。在实验室三角瓶培养条件下红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)对游离棉酚的降解率达90%以上，棉籽粕re含量较发酵前极显著降低(p <o.oi)，cp含量亦极显著提高(P < 0. 01)。因此，本发明所述的红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)可在生物降解游离棉酚
中应用。本发明所述的红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)可在高浓度游离棉酚含量的棉籽粕的生物处理中应用。有益效果本试验用紫外线、硫酸二乙酯处理原始菌株，筛选分离到一株耐高浓度棉酚的优势菌红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)，对其生物学特性和耐棉酚机理进行了初步研究，并在棉籽粕的发酵工艺中得到了成功应用。该菌株克服了现有棉酚降解菌性能不稳定的缺陷，在筛选培养基中传代3代后，初筛中是优势菌株，复筛中依然是优势菌株，说明其具有良好的稳定性。并且该菌株对醋酸棉酚的降解率为90. 80%,CP提高率为24. 59%，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。该降解菌株的发酵底物可以部分代替豆粕，缓解蛋白质资源的不足。因此，本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。使用本发明高浓度醋酸棉酚降解菌株生物降解游离棉酚，具有生产使用成本低， 使用方便，去除效果好的优点，因此红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)适合在动物饲料的发酵工艺中投加使用，可以缩短生化处理系统的启动时间，并提高处理效果。菌种保藏信息红冬孢酵母HJ-D-20 (Rhodosporidium paludigenum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 4372，保藏日期为2010年11月26日。
具体实施例方式实施例1菌种诱变及初筛1)菌种的复壮将原试验获得的于4°C下保藏的菌种红酵母HJ-Y去掉液体石蜡，将其菌悬液ImL 接入加有IOOmL PDA液体培养基的250mL三角瓶中，于28°C恒温汽浴摇床培养48h，转速为 200r/min。该酵母HJ-Y的筛选方法同夏新成，李贵强，滕安国，等.复合发酵棉籽粕菌种筛选、鉴定及其发酵工艺参数优化研究，[J]中国粮油学报，2010，，25(1) :91-97中的菌种筛选方法。2)菌株选定在超净操作台上，用接种环挑取复壮后菌液在PDA固体培养基平板上进行传代培养，挑选生长良好、性状稳定并呈单一菌落生长的纯菌株。将纯化的各单一菌株转接在查氏培养基平板上，传代5次后，保存菌种为诱变所用。 3)诱变出发菌株的预培养将选定的诱变出发菌株接种于0.3%棉酚无糖查氏培养基平板上，于30°C恒温培养箱培养到对数期，同时保存菌种。挑取对应平板上的菌落，通过无菌操作配制成浓度为 IO8个/mL的菌悬液，接种ImL菌悬液于盛有IOOmLO. 3%棉酚无糖查氏培养基的250mL三角瓶中，在30°C、200r/min下摇床培养，在无菌条件下用pH为6. 0的无菌磷酸缓冲溶液配制菌悬液，显微计数板计数，调整菌体浓度到约IO7个/mL。4)紫外诱变时间的选择紫外灯功率为15W，波长254nm，紫外灯距培养皿30cm，照射时间分别为0、20、25、 30、35、45、60、90、120s。照射完后的菌液用黑布包好，并于4°C冰箱静置30min，防止经紫外线照射损伤的DNA被可见光修复。在红外灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和已经紫外照射过的菌悬液各 0. 5mL，进行梯度稀释，分别取10-4、10_5、10-6稀释度的稀释液涂布于对应的固体筛选培养基上，在30°C的恒温培养箱中倒置培养3-5d (用黑袋子包好平板)。通过平板菌落计数法计算各菌株的致死率。5)硫酸二乙酯(DES)诱变时间选择诱变出发菌种培养至对数生长期，加无菌磷酸缓冲液(PBS)制成菌悬液(约IO7 个/mL)。取菌悬液4mL、PBS(pH = 6. 0) 16mL、DES 0. 4mL充分混合(DES的体积分数为 2% ),30°C 恒温振荡处理 0、20、25、30、35、45、60、90、120min，反应结束后，加入 0. 5mL 25% Na2S2O3中止反应，进行Io-1UO-2UO-2UO-4UO-5UO-6梯度稀释，分别取10_4、10_5、10_6稀释度的稀释液涂布于对应的含色氨酸0. lg/100ml和咖啡碱0. 025mol/L的固体筛选培养基平板上，在30°C的恒温培养箱中倒置培养3-5d，通过平板菌落计数法计算各菌株的致死率。6)复合诱变超净工作台上，红光环境下将调整好浓度的菌悬液(IO7个/mL)分别取5mL移入6 个直径为7cm(含灭菌转子)的无菌培养皿中(3个为一组)，将培养皿置于磁力搅拌器上， 紫外灯功率为15W，波长254nm，紫外灯距培养皿30cm，进行搅拌；诱变时间为15、20、40、60、 90s。控制反应温度为30°C。将紫外诱变后的培养皿中的菌悬液分别转入盛有PBS (pH = 6. 0) 15mL的250mL 三角瓶中(含玻璃珠10个)，并于4°C冰箱静置30min，取出，加入化学诱变剂硫酸二乙酯 0. 4mL,于气浴摇床振荡器上，诱变时间20min，具体反应剂量如表3所示。恒定温度30°C。 反应完毕，立即加入25% Na2S2O3无菌溶液0. 5mL,以终止反应。将诱变后的菌体转移至有IOmL查氏液体培养基的250mL三角瓶中，并加入色氨酸和咖啡碱以使突变基因稳定，防止回复突变，菌液于30°C恒温振荡培养2h，生理盐水适当稀释，涂布于含0. 5-lg咖啡碱的0. 4%棉酚查氏培养基平板上，30°C恒温、避光培养3-5d。 取出平板计算诱变条件下各菌株的致死率。7)筛选方法致死率在70% -80%的诱变效果较好，能得到较多的正突变，观察单一诱变和复合诱变后筛选培养基中长出的菌株的生长情况，挑取致死率在70% -80%且生长情况较好 (菌落直径大小较大，生长较迅速)的菌株和未经诱变的对照株HJ-Y，传代3次后接种至筛选培养基作初步筛选，观察其生长情况(见表1)。在固体筛选培养基中进行初筛后，经三次传代培养稳定后，选择生长旺盛的菌株HJ-D-20、HJ-D-30以及HJ-Z-20-D-20进入复筛。
表 1
菌株生长情况
HJ-Z-15-D-20-
HJ-Z-120-HJ-D-30+ +
HJ-D-20+ + +
HJ-Z-20-D-20+ + +
HJ-Y++注“+++”表示生长良好，菌数为108/mL以上；“++”表示生长一般，菌数为 IO5-IOVmL ；“ + ”表示生长较差，菌数为105/mL以下；“_”表示不生长，菌数为0 ；Z 紫外诱变；D =DES诱变；数字作用时间。实施例2菌种复筛将实施例1筛选得到的HJ-D-20、HJ-D-30、HJ-Z-20-D-20菌株原种及对照菌株 HJ-Y原种分别在筛选培养基上活化，将活化好的菌种分别接种于试管斜面上(配方见筛选培养基)备用。试管种分别接种于含200ml马铃薯液体培养基的IOOOml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，将活化好的菌种接入20ml马铃薯液体培养基于IOOml三角瓶得到一级菌种 (条件为30°C，200r/min摇床培养48h)，取一级菌种接入Iml于装有IOOml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种(条件为30°C，200r/min摇床培养48h)。用HJ-D-20、HJ-D-30、HJ-Z-20-D-20及HJ-Y的二级菌种按5%的接种量接种到游离棉酚含量为6Hmg/kg的棉籽粕发酵底物中，进行发酵，72小时后分别取样测定发酵底物中的游离棉酚的去除率，从表2可以看出，HJ-D-20对游离棉酚的降解率在90%以上，并且有很好的稳定性，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。因此选择HJ-D-20保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 4372，保藏日为 2010年11月沈日。试验表明，用本发明提供的降解菌株可极显著降低棉籽粕的棉酚含量， 提高了棉籽粕的营养价值，丰富了高效降解棉籽粕毒性的菌种资源。本发明成功地解决了饲料工业和养殖业中棉籽粕饲用率低、蛋白质饲料资源紧缺的问题，为棉籽饼粕的广泛安全使用提供了基础。该菌株HJ-D-20(CGMCC No. 4372)在筛选培养基中传代3代后，初筛中是优势菌株，复筛中依然是优势菌株，说明其具有良好的稳定性。同时HJ-D-20能在游离棉酚含量为6Hmg/kg的棉籽粕发酵底物中生长良好，使棉粕中游离棉酚含量降到56. 6Img/ kg也说明了菌株HJ-D-20属于高浓度棉酚耐受菌株。表2诱变后菌株较出发菌株红酵母对发酵效果的影响粗蛋白含量(％)粗蛋白提髙率(％)
43.75±0.003c16.32±0.006°
46.89±0.14Ba24.68±0.37Ba
HJ-D-30 140.46±0.32b 77.12±0.05c 48.52±0.13a29.03±0.35a
HJ-Z-20-D-20 64.12±0.27c 89.56±0.04B 46.87±0.06Ba24.63±0.16Ba注同列上标，不同大小写字母分别表示差异极显著(P < 0.01)和差异显著(P < 0. 05)。Y 原始菌株；Z 紫外诱变；D =DES诱变；数字作用时间。实施例31)将红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)接入20ml马铃薯液体培养基于IOOml 三角瓶得到一级菌种(条件为30°C，200r/min摇床培养48h)，取一级菌种接入Iml于装有 IOOml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种(条件为30°C，200r/min摇床培养 48h)。2)培养至对数期的二级菌种，分别接入游离棉酚含量为6Hmg/kg的棉籽粕发酵底物中，接种量为5%，置于500ml三角瓶中，30°C，恒温静置培养72h。烘干，测定TO及CP 含量，分析发酵效果，见表3。由表3可见经菌株HJ-D-20发酵后，TO降解率达90. 80%，粗蛋白提高率为24. 59 %，棉酚降解率比诱变前提高26. 48 %。表3红冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)的发酵效果分析
权利要求
1.一种红冬孢酵母 HJ-D-20 (Rhodosporidium paludigenum)，该菌株于 2010 年 11 月26日保存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.4372。
2.权利要求1所述的红冬孢酵母HJ-D-20在生物降解游离棉酚中的应用。
3.权利要求1所述的红冬孢酵母HJ-D-20在高浓度游离棉酚含量的棉籽粕的生物处理中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物领域，公开了一株降解棉酚的红冬孢酵母及其应用。红冬孢酵母HJ-D-20(Rhodosporidium paludigenum)，该菌株于2010年11月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.4372。该菌株对醋酸棉酚的降解率为90.78％，CP提高率为24.68％，并且该菌株有很好的稳定性，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。
文档编号A62D101/28GK102154129SQ20111000374
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者周光宏, 夏新成, 林海晶, 江芸, 高峰 申请人:南京农业大学