专利名称：一种高效诱导微拟球藻脂肪积累的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种高效提高微拟球藻-X57的脂肪含量以及开放式高密度养殖微拟 球藻-X57的方法。
背景技术：
随着全球能源需求的不断扩大，寻求可以替代石油的清洁能源是目前普遍关注的 热点。生物柴油(脂肪酸甲酯)是一种已经得到证实的燃料，以其为可再生性的环保燃料 能源而得到世界的广泛关注，生物柴油具有优良的环保特性，与石化柴油相比，有毒气体的 排放量可降低90%，一氧化碳的排放量可减少约10%，另外，生物柴油原料来源于光合作 用，(X)2的净排放量为零，因此生产和使用生物柴油不会导致温室效应，在美国生物柴油主 要以大豆为原料，其他来源包括棕榈油、菜籽油、动物脂肪酸、玉米油、回收烹饪油和麻疯树 油等，但只能满足当前燃料需求的极小部分，同时种植过程中容易产生土地资源紧缺以及 由此产生的农作物价格上涨的问题，特别在我国人多地少的情况下，这些问题尤其为突出。面对植物原料生产生物柴油的诸多问题，科学家把目光转向了不与农业争地、又 跟植物一样能利用光合作用产油的微藻，藻类的光合作用转化效率高出高等植物的10%以 上，繁衍能力强，生长周期短，比陆生植物产油高出几十倍，当前，国内外有许多科学家在探 索发现新的藻种并研制“工程微藻”，希望能实现规模化养殖，降低成本，为获取油脂资源提 供一条可靠的途径。因此如何提高微藻自身的脂肪积累，提供高效的生物柴油原料，成为了 当今世界新能源领域的研究方向。在众多的微藻种类中，微拟球藻(Narmochloropsis. sp)是单细胞藻类，富含油 脂，含量可达总脂肪酸的18%以上，此外其富含各种蛋白、多不饱和脂肪酸及色素，被认 为是高附加值生物。微拟球藻属绿藻门大眼藻纲，为海水真核生物，细胞球形，细胞大小 2-5 μ m,色素体一个，淡绿色，侧生，眼点淡橘红色，在生长良好的情况下，色素体很深，无蛋 白核，淀粉粒1-3个，细胞壁极薄，细胞颗粒小，微拟球藻生长繁殖快，培养条件简单，能够 进行大规模培养，有着巨大的商业开发潜力，但目前相关领域对微拟球藻的研究较少，应用 也多限于海产生物的饵料。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明选用微拟球藻-X57作为藻种，根据超 声波对生物体的代谢作用，改变现有技术通用的培养条件，提供了一种高效提高微拟球 藻-X57的生长速率和脂肪积累能力以及开放式高密度养殖微拟球藻-X57的方法。本发明 是在不破坏细胞的前提下，采用适当的频率、强度和处理时间，以提高微拟球藻-X57的新 陈代谢效率，加速细胞生长，用本发明方法培养出的微拟球藻-X57细胞数目是通用方法的 1.5-2.0倍，其脂肪含量提高了 40% -65%。本发明目的之一是提供一种微拟球藻-X57的培养基。本发明目的之二是提供一种微拟球藻-X57的培养方法。
本发明目的之三是提供一种诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法。本发明提供的能高效提高微拟球藻-X57脂肪含量的培养基，主要包括氮源、磷源 和铁盐，以及微量元素和水。其中氮源优选硝酸钠，磷源优选磷酸二氢钠，铁盐优选氯化铁， 微量元素优选硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化锰，本发明所述的培养基还可以根据不同的用 途添加其他有益营养成分。
本发明所提供的微拟球藻-X57的培养基命名为FN17，其配方为 氯化钠 18. 0-40. Og/L 硝酸钠 120. 0-220. Omg/L 三氯化铁 2.5-6. 5mg/L 乙二胺四乙酸二钠1. 0-6. Omg/L 磷酸二氢钠 7. 0-18. Omg/L 微量元素0. 5-2. 0ml/L
14. 0-56. 5mg/L 113. 5-453. 0mg/L
其中微量元素的配制方法为
硫酸铜 5. 5-22. 5mg/L硫酸锌
氯化钴 11. 5-45. 5mg/L氯化锰 加蒸馏水至IL
本发明所提供的微拟球藻-X57培养基，较好的配方包括
氯化钠 20.0-35.0g/L硝酸钠 150.0-200.
三氯化铁 3.5-5. 5mg/L乙二胺四乙酸二钠2. 0-3. 5mg/
磷酸二氢钠9. 0-14. 0mg/L微量元素 0. 5-2. Oml/ 其中微量元素的配制方法为
0mg/L
L
L
硫酸铜 氯化钴
9. 0-15. 0mg/L 14. 5-28. 0mg/L
硫酸锌 19. 5-32. 5mg/L 氯化锰 190. 5-265. 0mg/L
加蒸馏水至IL
日常添加营养液母液的配制方法 溶液A
硝酸钠 280-320g/L 微量元素 0. 5-2ml/L 其中微量元素配方为
硫酸铜 氯化钴
l-3g/L 3-5g/L
硫酸锌 氯化锰
4-6g/L 30-50g/L
加水定容至1L。 溶液B :
磷酸二氢钠 180-220g/L 溶液C:
三氯化铁 6-10g/L 乙二胺四乙酸二钠4-9g/L 若非特指，本发明培养基配方中所述的化学成分，均为分析纯的市售商品。 应用本发明所提供的FN17培养基诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法包括如下步
步骤1 配制FN17培养基以及日常添加的营养液A、B、C ； 步骤2 微拟球藻-X57生物量积累，按照微拟球藻-X57与培养基体积比为 10的比例将微拟球藻-X57接种到培养基中，温度18-30°c，pH值6_9，光照 5000-250001UX，光照时间10-16小时/天，每天需向微藻培养液中加入溶液A、B、C的混
5-1合液，溶液A B C按照10 1 10-25 1 25的比例混合，加入量为0. 6-aiil/L， 培养5-8天即可达到对数生长期末期；其中微拟球藻-X57生物量积累较好的培养条件为 微拟球藻-X57与培养基体积比为1 6-1 9，培养温度为2248°C，pH值为7-8，光照为 12000-200001ux，光照时间为 11-14 小时 / 天，溶液 A、B、C 按照 12 1 12-20 1 20 的比例混合，每天加入量为0.6-1. 5ml/L，培养6-8天。最好的培养条件为微拟球藻-X57 与培养基体积比为1 8，温度为^-28°C，光照为15000-180001UX，光照时间14小时/天， 溶液A B C按照18 1 18的比例混合，每天加入量为O.aiil/L，培养8天。步骤3 诱导脂肪积累，使用超声生物促进生长仪对培养至对数生长期末期的 微藻培养液以15-35kHz的频率，2-8w的功率，进行超声处理，处理时间10_60s，处理1_3 次，每次处理时间间隔为10s，然后向微藻培养液中以0. 5-2. 5L/min的流量通入浓度为 2%-6%的CO2，溶液A B按照10 1-20 1的比例混合，每天补充量为0. 5-100 μ 1/L， 溶液C每天的加入量为0. 5-aiil/L，在诱导培养2天时，再以10-20kHz的频率，l_5w的功率， 处理时间5-15s，处理1-2次，每次处理时间间隔为10s，共诱导培养4天。其中较好的诱导 脂肪积累条件超声频率为15-20kHz，功率为2-6w的、处理时间为10_30s，处理1_2次，每 次时间间隔为10s，然后以0. 8-1. 5L/min的流量通入浓度为3% -6%的CO2，溶液A B按 照12 1-18 1的比例混合，加入量为0. 5-60 μ 1/L，溶液C的加入量为0. 5-1. 5ml/L, 在诱导培养2天时，再以10-15kHz的频率，l-3w的功率，处理5_10s，处理1次。最好的诱 导脂肪积累条件超声频率18kHz，功率为#，处理时间为15s，处理2次，然后以1. 2L/min 的流速通入浓度为5 %的CO2，溶液A B按照15 1的比例混合，加入量为30 μ 1/L,溶液 C的加入量为l.anl/L，在诱导培养2天时，再以IOkHz的频率，3w的功率，处理8s，处理1 次。本发明所提供的微拟球藻-X57的培养基及诱导脂肪积累的方法，使用超声波 处理和改变培养基中碳源、氮源、磷源和铁元素的浓度相结合的方法，非常有利于微拟球 藻-X57脂肪的积累，其油脂的含量比氮源限制的单一诱导方法提高了 40% -65%，同时可 使微拟球藻-X57快速利用培养基的营养成分，促进细胞加速分裂，生长周期比通用培养基 缩短了 2-3天，其生物量积累是通用培养基的1. 5-2. 0倍。由于本发明是以通入CO2的形 式补充碳源诱导微拟球藻-X57的脂肪积累，故本发明可利用工业废气进行大规模的微拟 球藻-X57养殖并完成诱导脂肪积累的过程，在诱导微拟球藻-X57脂肪积累的同时完成工 业废气的处理，对节能减排、保护环境具有重要的意义。另外在当今世界面临能源日益溃乏 的情况下，用本发明方法培养的微拟球藻-X57由于能大幅度提高其脂肪积累，因此适合作 为生物柴油的原料，可为解决目前的能源危机作出积极的贡献。
图1为微拟球藻-X57在FN17培养基中每天添加不同体积的溶液A、B、C的混合液 以及在通用培养基中的生长曲线。图2为超声波与培养条件多条件诱导和氮元素单一条件诱导脂肪积累微拟球 藻-X57的生长曲线图3为诱导脂肪积累阶段加入高浓度的氮源和磷源，高强度的超声处理时微拟球 藻-X57的生长曲线
6
图4为诱导脂肪积累阶段加入极低浓度的氮源和磷源，较弱的超声处理时微拟球 藻-X57的生长曲线图5为诱导阶段加入较高浓度的氮源和磷源，中强度的超声处理时微拟球藻的生 长曲线
具体实施例方式实施例1UFN17培养基的配方如下氯化钠 35g/L 硝酸钠160mg/L三氯化铁 4. 5mg/L 乙二胺四乙酸二钠2. 5mg/L磷酸二氢钠12. Omg/L 微量元素lml/L其中微量元素的配制方法为取硫酸铜llmg、硫酸锌25mg、氯化钴22. 5mg、氯化锰 220mg加蒸馏水至1L。
硫酸锌 氯化锰
4. 5g/L 35g/L
溶液A
硝酸钠 290g/L 微量元素 lml/L 其中微量元素配方为 硫酸铜 1. 5g/L 氯化钴 3g/L 加水定容至IL 溶液B :
磷酸二氢钠 190g/L 溶液C:
三氯化铁 7g/L 溶液A B C按照18
1 18的比例混合，每天的加入量分别为6ml/L、8ml/ L和10ml/L。将上述物质溶解，用蒸馏水定容至1L，121°C高压灭菌20min。2、通用培养基配方如下首先配制人工海水，配方为氯化钠 18g/L 七水硫酸镁氯化钾 0. 6g/L 硝酸钠二水氯化钙0. 3g/L 磷酸二氢钾三羟甲基胺基甲烷3.03g/L氯化铵0.027g/L微量元素 IOml铁储存液其中微量元素的配方为乙二胺四乙酸二钠 lg/L硼酸1. 14g/L六水合三氯化铁 0. 049g/L 一水合硫酸锰0. 164g/L七水合硫酸锌0.022g/L 六水合氯化钴0. 0048g/L加水定容至1L，冰箱保存铁储存液的配制方法为
2. 6g/L lg/L 0. 05g/L
Iml
乙二胺四乙酸二钠 20g/L 六水合三氯化铁 1.62g/L0. lmol/L 的盐酸 900ml/L加水定容至1L，冰箱保存。以配制好的人工海水为基础，向人工海水中加入下面营养成分硝酸钠 0. 15g/L 二水合磷酸二氢钠 0. 011g/L微量元素 Iml乙二胺四乙酸铁盐 0.01g/L其中微量元素配制方法四水氯化锰 0. 22g/L 六水氯化钴 0. llg/L五水硫酸铜 0. 02g/L 七水硫酸锌 0. 044g/L二水钼酸钠 0. 012g/L加水定容至1L。将上述物质溶解，用蒸馏水定容至1L，121°C高压灭菌20min，在250ml摇瓶中加 入100mlFN17培养基和通用培养基，接种浓度为4X IO5个细胞/毫升，在温度^°C、光 暗=14 10，光强lOOOOlux，摇床转速140r/min等条件下进行培养。经7天培养，微拟球 藻-X57的最大生物量能达到4. 2X IO8个细胞/毫升(见图1)。根据上述不同培养结果可以得知，使用本发明提供的FN17培养基，日常加入溶液 A B C按照18 1 18的比例混合，加入量为8ml/L时，其生物量的积累是使用通用 培养基的2倍，同时克服了通用培养基配制繁琐，成本较高的缺陷。实施例21.超声波与培养条件多条件诱导在300L小型光反应器系统中，加入FN17培养基，微拟球藻-X57与培养基体积比 为1 8的比例接种，接种浓度为2. IXlO5个细胞/毫升，培养温度为2648°C，光照为 15000-180001UX，光照时间为14小时/天，每天加入溶液A、B、C的混合液0. 8ml/L (溶液 A B C按照18 1 18的比例混合)，培养8天后，以18kHz的频率，物的功率，处理时 间15s，超声处理2次，每次时间间隔为10s，然后以1. 0-1. 5L/min的流速通入浓度为5%的 CO2,每天添加溶液A、B的混合液(溶液A B按照15 1的比例混合)，加入量为30 μ 1/ L，一次性加入溶液C的量为l.aiil/L，诱导培养2天后，再以IOkHz的频率，3w的功率，处理 时间8s，超声处理1次，共诱导脂肪积累4天。2.氮源限制的单一诱导方法在300L小型光反应器系统中，加入FN17培养基，微拟球藻-X57与培养基体积比 为1 8的比例接种，接种浓度为2. IXlO5个细胞/毫升，培养温度为2648°C，光照为 15000-180001ux,光照时间为14小时/天，每天加入FNl7培养液原液0. 8ml/L,培养8天 后，每天添加硝酸钠含量为16mg/L的FN17培养液，加入量为0. 8ml/L，诱导培养4天。结果表明，用多条件诱导培养微拟球藻-X57时，其生长迅速，培养第3天即进入 指数生长期，培养可达到的最大细胞密度为4. 71 X IO8个细胞/毫升(见图幻，诱导脂肪积 累后干重为2. 58g/L，高出氮缺乏单因素诱导所得细胞干重的11%，经过超声波等多条件 诱导后，其脂肪占藻体干重的百分含量可达到37%，总脂肪的产量为955mg/L，其脂肪占藻 体干重的百分比是氮缺乏单条件诱导的1. 7倍，如表1 表1.超声波与培养条件相结合的多条件诱导与氮缺乏单条件诱导的各指标比较
权利要求
1. 一种微拟球藻-X57的培养基，其配方为 氯化钠 18.0-40. Og/L 硝酸钠 三氯化铁 2.5-6.5mg/L 乙二胺四乙酸 磷酸二氢钠7. 0-18. Omg/L 微量元素120.0-220. Omg/L 钠 1. 0-6. Omg/L 0. 5-2. 0ml/L其中微量元素的配制方法为硫酸铜 5. 5-22. 5mg/L 硫酸锌 14. 0-56. 5mg/L 氯化钴 11. 5-45. 5mg/L 氯化锰 113. 5-453. 0mg/L 加蒸馏水至IL日常添加营养液母液的配制方法 溶液A 硝酸钠 280-320g/L 微量元素 0. 5-2ml/L其中微量元素配方为硫酸铜 l_3g/L 硫酸锌 4-6g/L氯化钴 3-5g/L 氯化锰 30-50g/L加水定容至1L。溶液B :磷酸二氢钠 180-220g/L 溶液C:三氯化铁 6-10g/L 乙二胺四乙酸二钠4-9g/L。
2.如权利要求1所述的微拟球藻-X57的培养基，其较好的配方为 氯化钠20. 0-35. 0g/L 硝酸钠150. 0-200. 0mg/L 三氯化铁 3.5-5. 5mg/L 乙二胺四乙酸二钠2. 0-3. 5mg/L 磷酸二氢钠 9.0-14.0mg/L 微量元素 0. 5-2.0ml/L 其中微量元素的配制方法为硫酸铜 9. 0-15. 0mg/L 硫酸锌 19. 5-32. 5mg/L 氯化钴 14. 5-28.0mg/L 氯化锰 190. 5-265.0mg/L 加蒸馏水至1L。
3.一种诱导如权利要求1所述的微拟球藻-X57脂肪积累的方法，其特征在于包括如下 步骤(1)配制培养基以及日常添加的营养液母液A、B、C;(2)将微拟球藻-X57与培养基按1 5-1 10的体积比接种，每天向微藻培养液中加 入营养液母液A、B、C的混合液，培养5-8天，此过程是微拟球藻-X57积累生物量的阶段；(3)使用超声仪对生物量积累后的微拟球藻-X57培养液进行超声处理，然后向微藻培 养液中通入CO2、由于加入到微拟球藻-X57培养液中的营养液母液A B的浓度需降低，母 液C的浓度需增加，因此分别加入营养液母液A B的混合液和母液C进行诱导脂肪积累 的培养。
4.如权利要求3所述的诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法，其特征在于微拟球 藻-X57是在温度为18-30°C，pH值为6-9，光照为5000_250001ux，光照时间为10-16小时 /天的条件下进行生物量的积累，溶液A B C按照10 1 10-25 1 25的比例混合，加入量为每天0. 6-2ml/L0
5.如权利要求4所述的诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法，其特征在于较好的生物 量积累条件为培养温度22-28°C、pH值7-8、光照12000-200001ux、光照时间11-14小时/ 天，营养液母液A、B、C比例为12 1 12-20 1 20，每天加入量为0. 6-1. 5ml/L，培养 6-8 天。
6.如权利要求4所述的诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法，其特征在于最好的生物量 积累条件为营养液母液A、B、C比例为18 1 18，每天加入量为0.8ml/L，培养8天。
7.如权利要求3所述的诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法，其特征在于进行超声处理时的频率为15-35kHz，功率为2-8w，处理1_3次，每次间隔为10s，处理时 间为10-60s/次，再向微藻培养液通入CO2、并加入营养液母液A B及C的条件下，诱导培 养2天，再以10-20kHz的频率，l-5w的功率，处理1-2次，每次间隔IOs,处理5_15s/次，共 诱导培养4天。
8.如权利要求7所述的诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法，其特征在于较好的脂肪诱 导条件为超声频率为15-20kHz，功率为2-6w的、处理时间为10_30s，处理1_2次，每次时 间间隔为10s，诱导培养2天时，再以10-15kHz的频率，l_3w的功率，处理1次，处理时间为 5-10s。
9.如权利要求3、7所述的诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法，其特征在于向微 藻培养液中通入0)2的浓度为2%-6%、流量为0.5-2.5L/min，营养液母液A B按照 10 1-20 1比例混合，每天补充量为0. 5-100μ 1/L，溶液C的加入量为0. 5-2ml/L。
10.如权利要求9所述的诱导微拟球藻-X57脂肪积累的方法，其特征在于向微藻 培养液中通入CO2的浓度为3%-6%，流量为0.8-1. 5L/min，营养液母液A B按照 12 1-18 1的比例混合，加入量为0. 5-60μ 1/L，溶液C的加入量为0. 5-1. 5ml/L。
全文摘要
一种高效诱导微拟球藻脂肪积累的培养方法，包括配制培养基及日常添加的营养液，对微拟球藻进行5-8天的生物量积累的培养，然后向微拟球藻培养液中通入CO2、调整加入日常营养液的浓度，并使用超声仪在一定的频率下，对微藻培养液进行超声处理，处理1-3次，每次间隔为10s，处理时间为5-60s/次，诱导微拟球藻脂肪积累，用本发明方法培养的微拟球藻，其生物量是现有技术的1.5-2倍，油脂的含量可比现有技术提高40％-65％，生长周期缩短了2-3天，且本发明是以通入CO2的形式补充碳源，在大规模生产微拟球藻诱导脂肪积累的过程中，吸收大量的工业生产过程所产生的CO2废气，对节能减排、保护环境具有重要的意义。
文档编号C12R1/89GK102071143SQ20101026353
公开日2011年5月25日 申请日期2010年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者单东杰, 苏娇娇 申请人:北京芳能科技有限公司