专利名称：诱导间充质干细胞和脂肪干细胞分化为神经元的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养方法及其专用培养基，特别是涉及一种诱导间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)和脂肪干细胞分化为神经元的方法及其专用培养基。
背景技术：
神经元损伤性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默疾病、脑缺血等)是当前困扰人类的重大疾病，目前没有任何药物能治愈神经元损伤性疾病，一些用于治疗该病的药物仅能在某种程度上减轻症状，且长期使用还会产生毒副作用。近年来，利用干细胞移植治疗神经元损伤性疾病得到了医学界的广泛关注。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因易于获取，免疫原性低，增殖能力强，具有多向分化的潜能性，且伦理学争议少而被寄予厚望。
神经元限制性沉默因子(Neuronal restrictive silencer factor，NRSF)是一种分子质量为116kD的Cys2/His2型锌指蛋白，属于Gli-Kruppel样转录因子家族。整个蛋白分子包含N端阻遏结构域RD-1、近N端锌指结构、DNA结合区域(含7个排列成簇的锌指结构)、赖氨酸富含区、脯氨酸富含区和C端阻遏结构域RD-2(含一个锌指结构)。NRSF在抑制神经元特异性基因在非神经元细胞中的表达，以及防止神经元前体细胞过早向神经元分化等过程中起到关键作用，NRSF表达的下调是保证神经元正确分化的重要基础，也是神经元表型维持所必需的。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。研究发现，利用携带有RNA聚合酶III启动子的质粒载体操纵一段小的发夹shRNA在哺乳动物细胞中表达同样能够引起特定靶基因的沉默。
慢病毒载体(lentiviral vectors)系统具有如下特点病毒不具备自身复制能力，具有自身灭活机制；宿主范围广，人、鼠等多种属多类型细胞都能被高效感染；在稳定整合宿主基因组的基础上增加了高效感染静止期细胞，高效表达外源蛋白，同时还能逃避甲基化抑制的特点。慢病毒载体系统的这些特点使得其在分子生物学、细胞生物学等多学科、多领域均得到广泛应用，如在慢病毒载体的基础上改造出来的慢病毒干涉载体能够在细胞内对靶基因产生长期稳定的干涉效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于诱导间充质干细胞和脂肪干细胞分化为神经元的专用培养基。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于诱导间充质干细胞和脂肪干细胞分化为神经元的培养基(简称神经元诱导培养基)，是添加有体积/体积(V/V)百分比浓度8-12％胎牛血清的DMEM培养基。
所述神经元诱导培养基中的胎牛血清的浓度优选为10％；DMEM培养基包括高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基，优选为低糖DMEM培养基。
所述培养基中还添加有青-链霉素和/或四环素。
本发明的第二个目的是提供一种诱导间充质干细胞和脂肪干细胞分化为神经元的方法。
本发明所提供的诱导间充质干细胞和脂肪干细胞分化为神经元的方法，包括以下步骤 1)合成抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA或构建携带有抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体； 2)将步骤1)获得的抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA或携带有抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体转化或转染间充质干细胞和脂肪干细胞，使细胞内的神经元限制性沉默因子基因NRSF的表达水平下调或沉默，然后将重组间充质干细胞和重组脂肪干细胞置于所述神经元诱导培养基中，在36-38℃下培养，得到神经元。
在上述诱导间充质干细胞和脂肪干细胞分化为神经元的方法中，步骤1)中可按常规方法设计并合成抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA，如正义链为序列表中序列1，反义链为序列表中序列2的双链RNA序列。
将上述双链RNA序列命名为siRNA-NRSF，其反义链与NRSF mRNA(GenBank号NM_005612)的665-683位置序列5’-GCTACAATACTAATCGATA-3’互补。序列表中序列1由19个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列2由19个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。
此外，可抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA的编码基因均可用于所述干涉载体的构建。其中，所述抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA分子siRNA-NRSF的编码基因可为正义链(有义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列3的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列4的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列的双链核苷酸序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
将上述双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA-NRSF，编码siRNA-NRSF。序列表中序列3由55个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列4由59个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。
用于构建本发明携带有抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体的出发载体可为普通干涉载体、腺病毒干涉载体或慢病毒干涉载体等任意一种干涉载体，优选为慢病毒干涉载体；所述慢病毒干涉载体可为pSicoR(载体参考文献Andrea V，Alexander M，Christopher P.D，et al.Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.PNAS，2004，101(28)10380-10385.)、pMA1(该载体参考文献(Amendola M，et al.Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carryingsynthetic bidirectional promoters.Nat Biotechnol，2005，23(1)108-116))等任意一种慢病毒载体系统中的目的基因转移载体。
其中，以pSicoR为出发载体，构建的携带有上述抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA编码基因siDNA-NRSF的重组慢病毒干涉载体可为pSicoR-NRSF。
步骤2)中的间充质干细胞的来源是广泛的，可来源于离体的脐带血、脂肪、肋骨骨髓、髂骨骨髓或胎盘等。
可采用常规的方法，如脂质体介导法、磷酸钙转染法或电转染等方法将抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA或携带有抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体转化或转染间充质干细胞和脂肪干细胞。其中，将携带有抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒干涉载体转染间充质干细胞的方法可为将所述重组慢病毒干涉载体与慢病毒载体系统中的两种包装质粒和包膜蛋白质粒按4.5-5.5∶3.7-4.7∶1.5-2.5∶2.3-3.3的重量份数比混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒，再将携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒转染间充质干细胞和脂肪干细胞；所述慢病毒载体系统中的两种包装质粒可为pLP1和pLP2(均购自Invitrogen公司)，该包装质粒主要起到病毒包装作用，其转录表达后形成病毒衣壳结构蛋白及酶蛋白；包膜蛋白质粒可为pLP/VSVG(购自Invitrogen公司)，该包膜蛋白质粒转录表达后形成病毒包膜蛋白；慢病毒包装细胞可为293-FT细胞(购自Invitrogen公司)。
此外，步骤2)中将抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA或携带有抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体转化或转染间充质干细胞和脂肪干细胞前，可先对间充质干细胞和脂肪干细胞进行体外扩增，扩增培养方法可为将细胞置于添加有体积/体积(V/V)百分比浓度8-12％胎牛血清的DMEM-F12培养基(DMEM培养基和DF-12培养基按1∶1体积比混合后得到)中，在36-38℃下培养，得到大量间充质干细胞和脂肪干细胞。所述用于对间充质干细胞和脂肪干细胞进行体外扩增的培养基中还可添加有青-链霉素和/或四环素等抗生素，以防受到杂菌污染。
本发明提供了一种诱导间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)和脂肪干细胞分化为神经元的方法及其专用培养基。该方法是利用骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞的生物学特性，通过慢病毒干涉载体或小干扰RNA等稳定干涉细胞内源神经元限制性沉默因子(Neuronal restrictive silencer factor，NRSF)基因的表达，从而实现体外定向分化为神经元的方法。本发明所提供的将MSCs和脂肪干细胞高效分化为神经元的方法为神经元损伤缺失后的补充来源提供了保障，也为用干细胞移植替代临床治疗神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默疾病和脑缺血损伤等疾病奠定了基础。本发明将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1A为经纯化及传代培养的人髂骨骨髓的间充质干细胞的细胞形态 图1B为293-FT细胞的多细胞合胞体的光学显微镜观察结果 图1C为经包装的293-FT细胞的荧光显微镜观察结果 图2A为分别转染有慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target的Hela细胞内NRSF表达水平的半定量RT-PCR检测结果 图2B为分别转染有慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target的Hela细胞内NRSF表达水平的Western blotting检测结果 图2C为分别转染有慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target的Hela细胞内NRSF表达水平的免疫组化检测结果 图3为分别转染有慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target的MSCs细胞内部分神经元基因表达水平的免疫组化检测结果 图4为分别转染有慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target的MSCs细胞内部分神经元基因表达水平的RT-PCR检测结果
具体实施例方式 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，ColdSpring Harbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
所用引物及DNA序列均由上海英骏合成。
实施例1、将间充质干细胞诱导分化为神经元 以来源于髂骨骨髓的间充质干细胞为例，检测本发明方法的诱导分化效果。骨髓间充质干细胞的获取可以采用以下步骤一中的操作，也可以从干细胞库中直接获取。
一、骨髓间充质干细胞的分离、纯化及原代、传代培养 获取来源于外科手术弃除的髂骨骨髓，或在无菌条件下抽取健康自愿捐献者的髂骨骨髓，或从骨髓库中获得骨髓，加入DMEM-F12培养液(将高糖DMEM培养基和DF-12培养基(Sigma公司产品，Cat#D0547)按1∶1体积比混合后得到)中充分混合，离心，弃上清及脂肪层，将骨髓细胞沉淀与DMEM-F12培养基充分混匀后，将骨髓液轻轻叠加到密度为1.073g/mL的Percoll分离液(购自AmershamBiosciences)上，900g离心30分钟(室温下)，取白细胞膜层以上的部分，加入含10％胎牛血清的DMEM-F12培养液(预先加入青-链霉素100U/mL)中充分混匀，离心，弃上清，洗涤细胞沉淀，得到经纯化的骨髓间充质干细胞，备用。
将分离的骨髓间充质干细胞按2×105/cm2的浓度接种于装有DMEM-F12培养液的50mL塑料培养瓶中，置于37℃、5％CO2和饱和湿度的孵箱中进行培养，培养48h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每隔2-3天换液一次。待细胞长到80％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞进行传代培养，用细巴斯德吸管将消化细胞吹打成单细胞悬液后，以1×105/mL的浓度接种于新的DMEM-F12培养液中，每隔2-3天换液一次，细胞传代，细胞形态如图1A所示。
二、抑制抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的慢病毒干涉载体的构建以及慢病毒的包装 1、构建抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的慢病毒干涉载体和脱靶载体 1)抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA的设计根据神经元限制性沉默因子基因NRSFmRNA序列(GenBank号NM_005612)及常规的小干扰RNA的设计规则，选取位于NRSF mRNA序列转录起始位点aug下游665-683处长度为19bp的序列，将获得的抑制NRSF表达的小干扰RNA命名为siRNA-NRSF，序列如下 正义链5’-GCUACAAUACUAAUCGAUA-3’(序列表中序列1)； 反义链5’-UAUCGAUUAGUAUUGUAGC-3’(序列表中序列2)。
经Blast比对后排除非特异性同源序列。siRNA-NRSF的反义链与上述NRSF mRNA的665-683位置序列5’-GCTACAATACTAATCGATA-3’互补。
2)抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的小干扰RNA编码基因的获得 再根据siRNA-NRSF作用的靶序列和siDNA设计方案设计能够产生siRNA-NRSF的siDNA序列，命名为siDNA-NRSF，具体序列如下(下划线碱基序列为针对NRSF mRNA的靶序列) siDNA-NRSF正义链 5’-TGCTACAATACTAATCGATATTCAAGAGATATCGATTAGTATTGTAGCTTTTTTC-3’ (单下划线标注为针对NRSF mRNA的靶序列，序列表中序列3)； siDNA-NRSF反义链 3’-TCGAGAAAAAAGCTACAATACTAATCGATATCTCTTGAATATCGATTAGTATTGTAGCA-5’ (单下划线标注为针对NRSF mRNA的靶序列，序列表中序列4)。
同时，还设计了作为阴性对照与NRSF无关的脱靶对照序列，命名为siDNA-Ctrol，序列如下 siDNA-Ctrol正义链 5’-TTGTCAAGTAACACATAATCTTCAAGAGAGATTATGTGTTACTTGACATTTTTTC-3’； siDNA-Ctrol反义链 3’-TCGAGAAAAAATGTCAAGTAACACATAATCTCTCTTGAAGATTATGTGTTACTTGACAA-5’。
3)抑制神经元限制性沉默因子基因NRSF表达的慢病毒干涉载体的获得 将步骤2)合成的siDNA-NRSF和siDNA-Ctrol的正义链和反义链，分别两两退火成为双链DNA，20μl复性反应体系为正义链1μl，反义链1μl，20×SSC(sigma公司，Cat.S6639)1μl，水17μl。反应条件为95℃加热10min。取出，室温下冷却1h，稀释至浓度为40ng/μl。然后对两双链核苷酸片段用T4单核苷酸磷酸化酶进行磷酸化处理，反应体系为T4PNK 1μl，10×T4 ligase buffer 2μl，ATP(2mM)10μl，退火双链产物5μl，去离子水2μl。反应条件为37℃反应30分钟，然后70℃10分钟。再将经磷酸化处理的siDNA-NRSF和siDNA-Ctrol片段用限制性内切酶Hpa I和Xba I进行双酶切后与经相同酶双酶切处理的慢病毒载体系统中的目的基因转移载体pSicoR(由Andrea Ventura教授馈赠，Andrea Ventura，AlexanderMeissner，Christopher P.Dillon，et al.Cre-lox-regulated conditional RNAinterference from transgenes.PNAS，2004，101(28)10380-10385.)用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，挑取长出的单克隆，摇菌，提质粒，用限制性内切酶Xho I和Xba I进行双酶切鉴定，对双酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，经酶切产生大小约400bp DNA片断的质粒为阳性克隆质粒，再用测序方法做进一步鉴定，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的重组慢病毒载体，将携带有siDNA-NRSF的慢病毒干涉载体命名为pSicoR-NRSF，将携带有siDNA-Ctrol的脱靶载体命名为pSicoR-off-target。
2、慢病毒包装 培养293-FT(购自Invitrogen公司)慢病毒包装细胞，培养基为添加10％FBS，0.1mmol/L NEAA，2mmol/L L-谷氨酰胺，1％青-链霉素，500μg/mL G418的高糖DMEM培养基(Sigma公司产品，Cat#D5648)。用步骤1构建的慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target分别和包装质粒pLP1(购自Invitrogen公司)、pLP2(购自Invitrogen公司)及包膜蛋白质粒pLP/VSVG(购自Invitrogen公司)按5ug4.2ug2ug2.8ug的比例混合后加入1.5mL无血清Opti-MEMI培养基(购自Invitrogen公司)中，轻轻混匀，在另一个无菌的5mL管中将42uL lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)稀释于1.5mL的无血清Opti-MEMI培养基中，室温静置5分钟，混合以上两种液体，室温孵育20分钟以形成DNA-lipofectamine 2000复合物。用0.25％胰酶(Gibco公司产品，Cat# 25200-056)消化收集培养的293-FT细胞，计数约6×106个细胞，将其重悬到5mL不含抗生素的生长培养基(在高糖DMEM培养基(Sigma公司产品，Cat#D5648)的基础上添加10％胎牛血清(FBS)(Biochrom公司产品，cat#S0115)，0.1mmol/L非必需氨基酸(Non-Essential Amino Acids，NEAA)(购自HyClone公司)和2mmol/L L-谷氨酰胺)中，再将293-FT包装细胞悬液与3mL含有DNA-lipofectamine 2000复合物的培养基混匀后加入到含有5mL不含抗生素的生长培养基的10cm细胞培养皿中，混匀，放于37℃、5％CO2孵箱中培养，次日用含有1mmol/L丙酮酸钠的完全培养基(在高糖DMEM培养基的基础上添加10％胎牛血清，0.1mmol/L非必需氨基酸，2mmol/L L-谷氨酰胺，1％青-链霉素和1mmol/L丙酮酸钠)更换含有DNA-lipofectamine 2000复合物的培养基进行包装，并分别在包装24、72小时后取样，对经包装的293-FT细胞在荧光显微镜下进行观察，结果包装24小时后即可见到293-FT细胞内有绿色荧光蛋白eGFP表达(eGFP基因为慢病毒干涉载体pSicoR携带)，表达绿色荧光蛋白eGFP的细胞超过95％，如图1B所示(放大倍数100×)，表明包装效率很高，且伴随着包膜质粒pLP/VSVG中VSVG基因的表达，逐渐出现293-FT细胞的多细胞合胞体(见图1C，放大倍数100×)，包装72小时后培养上清为淡黄色，此时收集病毒液上清于15mL的无菌离心管中，4℃、3000rpm离心15min去除细胞碎片，用0.45μm滤膜过滤后，用水平转头如Beckman SW41t转头于4℃ 26000rpm超速离心90min收集沉淀以浓缩病毒，将病毒上清冻存于-70℃备用。经检测，病毒滴度达2×108CFU/mL。
三、慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF的干涉效果验证 1、慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target感染Hela细胞 病毒感染前一天于六孔板中接种hela细胞，细胞密度为3×105细胞/孔。感染时，每孔加入1mL步骤二获得的病毒上清和终浓度为8μg/mL的聚凝胺(polybrene)，晃动培养瓶使病毒液能接触到所有细胞。3小时后加入3mL含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，再过3小时，更换培养基。将感染有慢病毒干涉载体和脱靶载体的细胞分别命名为hela-siNRSF和hela-off-target。此后，按照正常细胞培养方法对细胞进行培养。
2、转染Hela细胞内NRSF表达水平的RT-PCR及real time PCR检测 RT-PCR及real time PCR检测步骤1获得的hela-siNRSF和hela-off-target转染细胞内NRSF的表达水平，具体方法为用TRIZOL(invitrogen)试剂并参照试剂盒说明书提取hela-siNRSF和hela-off-target细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为模板，反转录其中的mRNA为cDNA，20μl反转录体系为5×AMV反转录缓冲液4μl，dNTPs(10mM)2μl，RNAse抑制剂1μl，AMV反转录酶0.5μl，mRNA 2μl，重蒸水11.5μl。然后以合成的cDNA为模板，在引物P1(正向引物)5’-ACGCGTCGACCCAGCAACAAAGAAAAGTAGTCG-3’和P2(反向引物)5’-CCGCTCGAGATCAGTTCTGCCATCTGTCT-3’的引导下进行PCR扩增，20μl PCR反应体系为10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(2.5mM)1.6μl，正、反向引物各1μl，模板1μl，rTaq酶0.2μl，重蒸水13.2μl。同时，以人β-actin基因为参照，用于扩增人β-actin基因的引物序列为P3(正向引物)5’-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3’和P4(反向引物)5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2A所示，与转染有对照脱靶载体pSicoR-off-target的hela-off-target细胞相比，转染有本发明慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF的hela-siNRSF细胞内NRSF的表达水平显著下调。
同时，用real time PCR法确定pSicoR-off-target的hela-off-target细胞内准确的NRSF的干涉效率，所用仪器为bio-rad公司的opticon 2，20μl反应体系为10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(2.5mM)1.6μl，正、反向引物各1μl，模板1μl，rTaq酶0.2μl，syberGREEN 0.5μl，重蒸水12.7μl。反应独立重复3次，以消除系统误差。结果从RNA水平看，步骤二构建的慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF对NRSF的干涉效率为50％，效果显著，且未引发脱靶效应。
3、转染Hela细胞内NRSF蛋白表达水平的Western blotting及immunochemistry验证 1)Western blotting验证 各取107hela-siNRSF和hela-off-target细胞，用细胞核蛋白提取试剂盒(pierce)并参照试剂盒说明书提取细胞核蛋白，用BCA法测定蛋白浓度为5100μg/mL。然后，取等量的hela-siNRSF和hela-off-target细胞核蛋白进行不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再用半干式转印的方法将蛋白质转移至PVDF膜，接着用5％脱脂奶粉封闭2小时，一抗分别为兔来源抗NRSF抗体(购于santa cruz公司)或兔来源抗β-actin抗体(购于中杉金桥生物技术有限公司)，4℃孵育过夜(12-24小时)，TBST洗膜3次，每次10分钟，然后加入辣根过氧化物酶偶连的抗兔二抗(购于中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时后，用TBST洗膜4次。最后，用ECL化学发光检测试剂盒(购自SantaCruz公司，Cat#SC-2048)于暗室自显影，以检测目的条带及干涉效果。hela-siNRSF和hela-off-target细胞内NRSF表达水平的Western blotting检测结果如图2B所示，与转染有对照脱靶载体pSicoR-off-target的hela-off-target细胞相比，转染有本发明慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF的hela-siNRSF细胞内NRSF蛋白的表达水平显著下调。
2)免疫组化(immunochemistry)验证 将hela-siNRSF和hela-off-target细胞接种于96孔板中，细胞密度为104细胞/孔。用4％多聚甲醛固定细胞半小时，然后用1％皂素破膜15分钟，3％H2O2处理5～10分钟，正常山羊血清封闭，一抗为兔来源抗NRSF抗体(购于santacruz公司)，4℃孵育过夜(12-24小时)，PBS洗膜3次，每次5分钟，然后二抗(购于北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时后PBS洗涤3次，每次5分钟，DAB或cy3偶连三抗显色。hela-siNRSF和hela-off-target细胞内NRSF表达水平的Western blotting检测结果如图2C所示(hela-off-target(左)和hela-si-NRSF(右)免疫组化染色结果，上图为DAB显色，下图为cy3显色)，与转染有对照脱靶载体pSicoR-off-target的hela-off-target细胞相比，转染有本发明慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF的hela-siNRSF细胞内NRSF蛋白的表达水平显著下调。
四、慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target感染间充质干细胞并观察其分化行为 1、感染间充质干细胞及细胞培养 病毒感染前一天于六孔板中接种步骤一扩培的MSCs，细胞密度为2×105细胞/孔。感染时，每孔加入1mL步骤二获得的病毒上清和终浓度为8μg/mL的聚凝胺(polybrene)，晃动培养瓶使病毒液能接触到所有细胞。3小时后加入3mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，再过3小时，更换培养基。将感染慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF和脱靶载体pSicoR-off-target的细胞分别命名为MSC-siNRSF和MSC-off-target。此后，按照正常细胞培养方法(37℃、5％CO2)对细胞进行培养。14天后MSCs分化为神经元细胞。
2、分化细胞的鉴定 1)免疫组化染色鉴定 用与步骤三中相同的immunochemistry染色方法对分化细胞进行免疫组化染色鉴定，以检测神经元的诱导分化情况，所用抗体包括GFAP，NSE，NF-200，nestin和β-tubulin III(均购自北京中杉生物技术有限公司)。部分抗体的检测结果如图3所示(NF-200表示神经丝蛋白，TH表示酪氨酸羟化酶，Tuj1表示βtubulinIII；从左到右，第一纵列细胞为分化细胞经免疫荧光染色后的红色荧光表达情况，第二纵列细胞为分化细胞的EGFP表达情况，第三纵列细胞为分化细胞红色荧光和EGFP的融合)，表明通过干涉MSCs内源NRSF基因的表达，能够高效分化MSCs为神经元，证明本发明的方法可用于干细胞-神经元的诱导分化。
2)RT-PCR鉴定 用与步骤三中相同的RT-PCR方法对步骤1中的MSC-siNRSF(感染7天、14天)和MSC-off-target分化细胞内的部分神经元基因进行mRNA表达水平鉴定，鉴定基因包括GFAP(检测引物序列为5’-ACATCGAGATCGCCACCTAC-3’和5’-ACATCCTTGTGCTCCTGCTT-3’)，SCG10(检测引物序列为5’-AGCTGTCCATGCTGTCACTG-3’和5’-TGCAGCCTCCAGTTTCTTCT-3’)，NSE(检测引物序列为5’-TGACAGTGACCAACCCAAAA-3’和5’-CCAGGTCAGCAATGAATGTG-3’)，synaptophysin(SYP)(检测引物序列为5’-GCCACAGACCCAGAGAACAT-3’和5’-GTAGCCTTGCTGCCCATAGT-3’)，neurogenin1(NGN1)(检测引物序列为5’-CGCTTCGCCTACAACTACATC-3’和5’-AGGCTTGGGAAGGAGAAAAC-3’)和BDNF(检测引物序列为5’-AAACATCCGAGGACAAGGTG-3’和5’-AGAAGAGGAGGCTCCAAAGG-3’)。检测结果如图4所示，与转染有对照脱靶载体pSicoR-off-target的MSC-off-target细胞相比，转染有本发明慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF的MSC-siNRSF细胞内的神经元基因显著表达，特别是转染14天后表达水平明显上调，进一步证明本发明的方法可用于干细胞-神经元的诱导分化。
实施例2、将脂肪干细胞诱导分化为神经元 以脂肪干细胞为例，检测本发明方法的诱导分化效果。脂肪干细胞的获取可以采用以下步骤一中的操作，也可以从干细胞库中直接获取。
一、脂肪干细胞的分离、纯化及原代、传代培养 1)使用吸脂术中弃离的脂肪或采用吸脂术方法从健康志愿者吸取脂肪，用PBS冲洗，加入4倍体积的0.1％胶原酶、1倍体积的2％BSA和双抗，然后放入50mL离心管，37℃消化45min，并不时摇动。
2)将消化成糊状的脂肪组织先用80目筛网过滤，然后用200目再过滤一遍，余下的脂肪组织加入胶原酶继续消化重复上述动作。将过滤液800rpm离心10min，吸出上清，加入少许含血清的培养基，用吸管轻轻吹打，使成悬液。加入红细胞裂解液，室温10min。
3)1200rpm离心5min，PBS洗2遍，用含10％FBS的低糖-DMEM培养基重悬细胞团，接种于培养瓶中，37℃、5％CO2，饱和湿度培养。24h后换液，PBS洗1遍。加入含10％FBS的低糖-DMEM培养基继续培养。采用0.25胰酶-0.02％EDTA，消化传代。
二、慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target感染脂肪干细胞并观察其分化行为及分化细胞鉴定 将实施例1构建的慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF以及脱靶载体pSicoR-off-target感染脂肪干细胞，感染细胞及分化培养鉴定方法与实施例1基本相同，其中，所用培养基为含8％胎牛血清的低糖DMEM培养液，为防止污染，可以适量添加抗生素青-链霉素和/或四环素。分化细胞的鉴定方法如下 1、分化细胞的鉴定 1)免疫组化染色鉴定 用与实施例1中相同的immunochemistry染色方法对分化细胞进行免疫组化染色鉴定，以检测神经元的诱导分化情况，所用抗体包括GFAP，NSE，NF-200，nestin和β-tubulin III。检测结果表明通过干涉脂肪干细胞内源NRSF基因的表达，能够高效分化脂肪干细胞为神经元，证明本发明的方法可用于干细胞-神经元的诱导分化。
2)RT-PCR鉴定 用与实施例1中相同的RT-PCR方法对分化细胞内的部分神经元基因进行mRNA表达水平鉴定，鉴定基因包括GFAP(检测引物序列为5’-ACATCGAGATCGCCACCTAC-3’和5’-ACATCCTTGTGCTCCTGCTT-3’)，SCG10(检测引物序列为5’-AGCTGTCCATGCTGTCACTG-3’和5’-TGCAGCCTCCAGTTTCTTCT-3’)，NSE(检测引物序列为5’-TGACAGTGACCAACCCAAAA-3’和5’-CCAGGTCAGCAATGAATGTG-3’)，synaptophysin(SYP)(检测引物序列为5’-GCCACAGACCCAGAGAACAT-3’和5’-GTAGCCTTGCTGCCCATAGT-3’)，neurogenin1(NGN1)(检测引物序列为5’-CGCTTCGCCTACAACTACATC-3’和5’-AGGCTTGGGAAGGAGAAAAC-3’)和BDNF(检测引物序列为5’-AAACATCCGAGGACAAGGTG-3’和5’-AGAAGAGGAGGCTCCAAAGG-3’)。检测结果表明转染有本发明慢病毒干涉载体pSicoR-NRSF的脂肪干细胞内的神经元基因显著表达，特别是转染14天后表达水平明显上调，进一步证明本发明的方法可用于干细胞-神经元的诱导分化。
序列表
<160>4
<210>1
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gcuacaauac uaaucgaua
19
<210>2
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
uaucgauuag uauuguagc
19
<210>3
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
tgctacaata ctaatcgata ttcaagagat atcgattagt attgtagctt ttttc
55
<210>4
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
tcgagaaaaa agctacaata ctaatcgata tctcttgaat atcgattagt attgtagca
59
权利要求
1.用于诱导间充质干细胞或脂肪干细胞分化为神经元的培养基，是添加有体积/体积百分比浓度8-12％胎牛血清的DMEM培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述胎牛血清的浓度为10％；DMEM培养基为低糖DMEM培养基。
3.一种诱导间充质干细胞或脂肪干细胞分化为神经元的方法，包括以下步骤
1)合成抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA或构建携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体；
2)将步骤1)获得的抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA或携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体转化或转染间充质干细胞或脂肪干细胞，然后将重组间充质干细胞或重组脂肪干细胞置于权利要求1或2所述的神经元诱导培养基中，在36-38℃下培养，得到神经元。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤1)中抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA的正义链为序列表中序列1，反义链为序列表中序列2的双链RNA序列；所述抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA的编码基因为正义链具有序列表中序列3的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中序列4的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列的双链核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于用于构建携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体的出发载体为普通干涉载体、腺病毒干涉载体或慢病毒干涉载体；所述慢病毒干涉载体为pSicoR或pMA1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于以pSicoR为出发载体构建的携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒干涉载体为pSicoR-NRSF。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的间充质干细胞来源于离体的脐带血、脂肪、肋骨骨髓、髂骨骨髓或胎盘。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于将所述携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒干涉载体转染间充质干细胞和脂肪干细胞的方法为将所述重组慢病毒干涉载体与慢病毒载体系统中的两种包装质粒和包膜蛋白质粒按4.5-5.5∶3.7-4.7∶1.5-2.5∶2.3-3.3的重量份数比混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒，再将携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒转染间充质干细胞和脂肪干细胞；所述慢病毒载体系统中的两种包装质粒为pLP1和pLP2；包膜蛋白质粒为pLP/VSVG；慢病毒包装细胞为293-FT细胞。
9.根据权利要求3-8任一项所述的方法，其特征在于所述步骤2)中将抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA或携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体转化或转染间充质干细胞和脂肪干细胞前，先对间充质干细胞和脂肪干细胞进行体外扩增，扩增培养方法为将间充质干细胞和脂肪干细胞置于添加有体积/体积百分比浓度8-12％胎牛血清的DMEM-F12培养基中，在36-38℃下培养，间充质干细胞和脂肪干细胞获得扩增。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述用于对间充质干细胞和脂肪干细胞进行体外扩增的培养基中还添加有青-链霉素和/或四环素。
全文摘要
本发明公开了一种诱导间充质干细胞和脂肪干细胞分化为神经元的方法及其专用培养基。该培养基是添加有体积/体积百分比浓度8-12％胎牛血清的DMEM培养基。该方法步骤1)合成抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA或构建携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体；2)将抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA或携带有抑制神经元限制性沉默因子基因表达的小干扰RNA编码基因的干涉载体转化或转染间充质干细胞或脂肪干细胞，然后将重组间充质干细胞或重组脂肪干细胞置于所述神经元诱导培养基中，在36-38℃下培养，得到神经元。本发明将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/85GK101117625SQ20071011872
公开日2008年2月6日 申请日期2007年7月12日 优先权日2007年7月12日
发明者裴雪涛, 杨印祥, 李艳华, 刘庆斌, 琳 陈, 管利东, 洋 吕 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所