专利名称：一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，具体涉及一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法。
背景技术：
培养细胞的完全培养基由基础培养基(如MEM)和添加剂(如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子)组成。仅仅用基础培养基进行细胞培养时，绝大多数细胞都不会存活较长时间，为了促进它们的存活和生长，必须添加额外的因子，比如激素、转运蛋白和一些痕量元素。一般来说，都选择血清来提供这些因子。但是血清成分复杂，存在许多未知因素，有时会干扰实验结果，掩盖培养细胞潜在的生理功能。此外，生理状况下，由于 血一脑屏障的存在，神经组织并不直接暴露于血浆的大部分成分中。因此，培养液中的血清成分可能干扰神经细胞正常的功能活动。血清中还含有一定的细胞毒物质和抑制物质，对细胞有去极化作用，影响细胞的功能的正常表达。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，解决了现有技术中血清培养方法存在干扰、影响观察的问题。本发明的一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，以胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠无血清培养基进行胎鼠皮层神经元的培养，用神经元特异性烯醇化酶染色，来鉴定胎鼠皮层神经元。优选的，所述胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠无血清培养基中含有O. 5g/L胰岛素、O. 5g/L转铁蛋白和O. 5mg/L亚硒酸钠。本发明的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，具体培养步骤如下
步骤I)试剂的配制
基培液取 DMEM 高糖培养基 10g/L 15g/L、NaHCO3 2g/L 3g/L、HEPES 3g/L 5g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽滤除菌，置于一 25°C 一 15°C保存；
种植液按体积比计，DMEM高糖培养基90%，胎牛血清10% ；
饲养液按体积比计，DMEM高糖培养基99%，胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠1% ； 步骤2)原代细胞的培养
培养板的处理24孔塑料培养板，每孔加入O. lmg/ml的多聚赖氨酸200μ ，静置30分钟后除去，用灭菌三蒸水进行冲洗后吸净，于35°C 40°C下过夜烤干，备用，接种前用基培液再灌洗一遍；
然后，取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于无菌条件下取出胎鼠，剥除胎膜放入装有基培液的无菌皿中，取胎鼠大脑皮层；
解剖镜下去除胎鼠大脑皮层的皮层外膜及血管组织，基培液中洗净血污，剪碎，置于体积比为O. 125%的胰蛋白酶溶液中，35°C 40°C下消化IOmin 20min，吸除消化液，用含血清的培养基终止消化，加完全培养基反复吹打制成单细胞悬液；
用200目不锈钢筛网进行过滤，使细胞充分分离；
取IOPL细胞悬液与等量体积比为4%的台盼蓝混匀后计数活细胞数，调整细胞密度至4Χ 106/mL，接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板，每孔加50μ 细胞悬液,再分别加450μ 完全培养基，使细胞接种密度为4 X 105/mL ；
培养板置恒温培养箱中，以37°C的环境温度、5%C02，饱和湿度条件下进行开放培
养;
24h后，全量换体积比为1%的胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠的无血清培养液；以后每隔2-3d进行1/2量换液； 选取不同时间点神经元在相差显微镜下观察其形态变化并进行显微摄影；
步骤3)免疫组化染色培养至第7天的细胞，进行神经元特异性烯醇化酶抗体免疫组化染色鉴定，光镜下观察神经元特异性烯醇化酶表达阳性细胞，计算阳性细胞百分率并进行显微摄影。优选的，所述步骤I)中，所述DMEM高糖培养基为13. 4g/L，NaHCO3为2. 2g/L，HEPES为3. 75g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽滤除菌，置于一 20°C保存。优选的，所述步骤2)中，培养板的处理中，过夜烤干的环境温度是37°C。优选的，所述步骤2)中，置于体积比为O. 125%的胰蛋白酶溶液中，是在37°C的温度下消化15min。优选的，所述步骤2)中，是用200目的不锈钢筛网进行过滤，使细胞充分分离。有益效果本发明的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，用无血清培养方法，建立了 Wistar胎鼠的皮层神经元体外分散培养模型，并对其进行了形态学观察，为今后的相关研究奠定了基础。
具体实施例方式实施例I
准备材料
DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、HEPES购自GIBCO公司；
多聚赖氨酸、胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠无血清培养基(ITS)购自Sigma公司；神经元特异性烯醇化酶(NSE )、即用型HIGH — SABC免疫组化试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。本发明的一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，具体步骤如下
步骤I)试剂的配制
DMEM高糖培养基13.4g/L、NaHCO; 2g/L、HEPES 3. 75g/L，依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽滤除菌，置于一 20°C保存；
种植液按体积比计，DMEM高糖培养基90%，胎牛血清10% ；
饲养液按体积比计，DMEM高糖培养基99%，胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠无血清培
养基1%。步骤2)原代细胞培养
(I)培养板的处理24孔塑料培养板，每孔加入O. lmg/ml的多聚赖氨酸200μ ，静置30分钟后除去，灭菌三蒸水冲洗，吸净，37°C过夜烤干，备用；接种前用培养基再灌洗一遍。
(2)取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于无菌条件下取出胎鼠，剥除胎膜放入装有基培液的无菌皿中，取胎鼠大脑皮层；
解剖镜下去除皮层外膜及血管组织，基培液中洗净血污，剪碎，置O. 125%胰蛋白酶溶液中37°C消化15min，吸除消化液，用含血清的培养基终止消化，加完全培养基反复吹打制成单细胞悬液；
用200目不锈钢筛网进行过滤，使细胞充分分离；
取ΙΟμ 细胞悬液与等量4%台盼蓝混匀后计数活细胞数，调整细胞密度至4XlOVmL,接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板，每孔加50μ 细胞悬液，再分别加450μ 完全培养基，使细胞接种密度为4Χ 105/mL ；·
培养板置恒温培养箱中37°C，5%C02，饱和湿度条件下进行开放培养；
24h后，全量换1%ITS的无血清培养液；
以后每隔2-3d进行1/2量换液；
选取不同时间点神经元在相差显微镜下观察其形态变化并进行显微摄影。步骤3)免疫组化染色
培养至第7天的细胞，进行神经元特异性烯醇化酶抗体免疫组化染色鉴定，光景下观察NSE表达阳性细胞，计算阳性细胞百分率并进行显微摄影。观察
在倒置相差显微镜下观察，刚接种的皮层神经元最初呈圆形，体积小，透亮，无突起。在培养12 24h后观察可见大部分细胞贴壁，贴壁细胞多为圆形或椭圆形，偶见突起，周围出现光晕。培养2-3d后可见，胞体增大，突起增多延长。培养6-7d后，神经元细胞体大而饱满，神经细胞突起分支增多，以双极神经元居多。细胞突起增长，有的细胞突起相互连接，神经细胞胞体呈圆形或椭圆形及多边形不等。培养IOd后，神经细胞开始减少并退化，表现为细胞体积缩小，胞浆内出现大小不等的空泡，突起萎缩减少。第7天的细胞，NSE免疫组化染色(DAB显色)，胞浆和突起被染成棕褐色而胞核不被染色的为阳性细胞。NSE是糖酵解过程中的一种二聚体同功酶，是神经元分化成熟的特异性标志酶，它分布在神经元的胞体、轴突和树突部分。使用NSE特异性抗体的免疫细胞化学染色方法，能够鉴定体外无血清培养体系中的神经元及其纯度，而且能反映神经元的生长发育情况。染色后在显微镜下进行观察并拍照，以三个视野中阳性神经元的数目占细胞的比例为神经元纯度,经鉴定神经元纯度达96. 7%左右。结论
以胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠无血清培养基进行胚胎大鼠皮层神经元的培养，镜下观察结果显示细胞生长状态良好。同时，用神经元特异性烯醇化酶染色来鉴定神经元，以免疫化学染色，结果显示神经元胞体饱满，胞浆内颗粒明显，细胞生长状态良好，而且纯度达96. 7%左右。胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠无血清培养基中含有O. 5g/L胰岛素、O. 5g/L转铁蛋白、O. 5mg/L亚硒酸钠。胰岛素可以促进细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取，对大多数类型细胞的存活和生长有重要作用。铁是一种营养细胞的必需的微量元素，为防止铁离子的细胞毒性，通常铁以化合物转铁蛋白的形式提供。硒是有助于水解过氧化物和超氧化物。结果表明ITS无血清培养基可以满足胎鼠皮层神经元生长发育需求的营养，且该方法相对于有血清培养法具有一定的优越性，值得推广应用。上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的 普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，其特征在于，以胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠无血清培养基进行胎鼠皮层神经元的培养，用神经元特异性烯醇化酶染色，来鉴定胎鼠皮层神经元。
2.根据权利要求I所述的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，其特征在于，所述胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠无血清培养基中含有O. 5g/L胰岛素、O. 5g/L转铁蛋白和O. 5mg/L亚硒酸钠。
3.根据权利要求I所述的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，其特征在于，具体步骤如下 步骤I)试剂的配制 基培液取 DMEM 高糖培养基 10g/L 15g/L、NaHCO3 2g/L 3g/L、HEPES 3g/L 5g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽滤除菌，置于一 25°C 一 15°C保存； 种植液按体积比计，DMEM高糖培养基90%，胎牛血清10% ； 饲养液按体积比计，DMEM高糖培养基99%，胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠1% ； 步骤2)原代细胞的培养 培养板的处理24孔塑料培养板，每孔加入O. lmg/ml的多聚赖氨酸200μ ，静置.30分钟后除去，用灭菌三蒸水进行冲洗后吸净，于35°C 40°C下过夜烤干，备用，接种前用基培液再灌洗一遍； 然后，取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于无菌条件下取出胎鼠，剥除胎膜放入装有基培液的无菌皿中，取胎鼠大脑皮层； 解剖镜下去除胎鼠大脑皮层的皮层外膜及血管组织，基培液中洗净血污，剪碎，置于体积比为O. 125%的胰蛋白酶溶液中，35°C 40°C下消化IOmin 20min，吸除消化液，用含血清的培养基终止消化，加完全培养基反复吹打制成单细胞悬液； 用200目不锈钢筛网进行过滤，使细胞充分分离； 取IOPL细胞悬液与等量体积比为4%的台盼蓝混匀后计数活细胞数，调整细胞密度至4XlOVmL,接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板，每孔加50μ 细胞悬液，再分别加450μ 完全培养基，使细胞接种密度为4Χ 105/mL ； 培养板置恒温培养箱中，以37°C的环境温度、5%C02，饱和湿度条件下进行开放培养；24h后，全量换体积比为1%的胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠的无血清培养液；以后每隔2-3d进行1/2量换液； 选取不同时间点神经元在相差显微镜下观察其形态变化并进行显微摄影； 步骤3)免疫组化染色 培养至第7天的细胞，进行神经元特异性烯醇化酶抗体免疫组化染色鉴定，光景下观察神经元特异性烯醇化酶表达阳性细胞，计算阳性细胞百分率并进行显微摄影。
4.根据权利要求I所述的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，.其特征在于，所述步骤I)中，所述DMEM高糖培养基为13. 4g/L，NaHCO3为2. 2g/L，HEPES为3. 75g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽滤除菌，置于一 20°C保存。
5.根据权利要求I所述的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，培养板的处理中，过夜烤干的环境温度是37°C。
6.根据权利要求I所述的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，置于体积比为O. 125%的胰蛋白酶溶液中，是在37°C的温度下消化15min。
7.根据权利要求I所述的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，是用200目的不锈钢筛网进行过滤，使细胞充分分离。·
全文摘要
本发明公开了一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法,以胰岛素－转铁蛋白－亚硒酸钠无血清培养基进行胎鼠皮层神经元的培养，用神经元特异性烯醇化酶染色，来鉴定胎鼠皮层神经元。本发明的胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，用无血清培养方法，建立了Wistar胎鼠的皮层神经元体外分散培养模型，并对其进行了形态学观察，为今后的相关研究奠定了基础。
文档编号C12N5/0793GK102839151SQ20111016444
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者叶蓓 申请人:苏州卫生职业技术学院