专利名称：人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的一种人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化为神经元样细胞诱导方法，特别涉及一种应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞的方法。
背景技术：
人羊膜间充质干细胞(humanamnion membrane mesenchymal stemcelIs, hAMSCs)维持了原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性，拥有更大的多向分化潜能。hAMSCs理论上可以分化成各种组织细胞，同时因羊膜获得方便且回避了伦理学争议，有潜力成为未来临床应用的干细胞来源之一。但hAMSCs移植后神经细胞转化率在体内仅为3% 10%，而且在 体内环境下分化为神经胶质细胞的比率较大而分化为神经元样细胞的比率较小，这无疑会给神经系统功能的恢复带来不利因素。如果能将hAMSCs在体外分化为神经元样细胞，再行细胞移植会有事半功倍的效果。中胚层来源的骨髓间充质干细胞(BMSCs)向外胚层来源的神经元分化的研究正处于起步阶段。全反式维甲酸是维生素A的衍生物，能够明显增加神经细胞的数量并呈剂量依赖效应，能调节EGF (表皮生长因子)反应的神经干细胞分化，增加神经元细胞和星形胶质细胞的合成。将其与神经营养因子和细胞因子联合用于诱导胚胎干细胞向神经干细胞方向分化，同体内发育过程相似，且可以部分模拟体内环境，因此日益受到重视。但是，这些研究多停留在诱导后hAMSCs具有神经元形态特征和表达神经细胞标记物水平上，而缺乏具有神经细胞生理学特性的证据，因此许多学者认为这类细胞被称为“神经元样细胞”更为妥当。
发明内容
本发明提供一种人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化为神经元样细胞诱导方法，其是应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白，所述方法具体包括以下步骤:hAMSCs分离，hAMSCs原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs细胞免疫表型的检测，hAMSCs诱导分化为神经元样细胞以及细胞免疫荧光染色。其中，所述的hAMSCs分离的步骤包括无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约Imm3碎块，加入2. 5g/L胰蛋白酶37°C消化10分钟；加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后用200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入1. Og/LII型胶原酶消化液，37°C消化O. 5小时；加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；在1000转/分钟条件下离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为I X 106/ml，接种至25cm2培养瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培养基；置37°C、饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液I次，并摄片记录；待细胞汇合度达80%后，用O. 25%胰蛋白酶-O. 02% EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于37°C消化2_3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟下离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以IXlOVml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70%瓶底重复以上步骤；·
所述的hAMSCs的原代培养步骤包括将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000转/分钟进行15分钟离心，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用O. OlM PBS 30mL吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟离心，洗涤2次，收集细胞；接种细胞前吸取FBS 3mL加入T75cm2型细胞培养瓶，置37°C，5% CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20% FBS,4ng/ml表皮生长因子的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1. OX IO6细胞/ml，接种于包被后的T75cm2型细胞培养瓶中，置于37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次；观察细胞贴壁生长至80-90%汇合时，以O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，所得细胞为原代细胞。所述的hAMSCs的传代培养与扩增步骤包括观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取IOmlO. OlM PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化液1. 0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入1. Oml FBS中止胰酶消化；加入IOml O. OlM PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟进行10分钟离心；弃去上清液，加入10mlDMEM/F12重悬细胞，按1: 2-1 : 3比例传代培养；置371，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第I代(Pl)hAMSCs，待细胞生长至80-90%汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩增。所述hAMSCs细胞免疫表型的检测步骤包括取培养第2或第3代细胞，首先用O. 25 %的胰蛋白酶消化后，然后用含I %小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至I X IO7/ml ;分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、0)44^^、0)105411'(、0)106411'(、!11^-01 - 11'(，置41孵育半小时，？83洗 I 次，进行流式细胞仪检测分析。所述的hAMSCs诱导分化为神经元样细胞的步骤包括取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60%时，换成诱导培养基；37°C、5% CO2，饱和湿度静置培养。所述的细胞免疫荧光染色步骤包括培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。本发明应用全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilament acidicprotein,GFAP);提示BMSCs仍然保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法的步骤流程图。
具体实施例方式如图1所示的本发明的人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞诱导方法的步骤流程图，其是应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞所述方法具体包括以下步骤S1、人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离 无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约Imm3碎块，加入
2.5g/L胰蛋白酶37°C消化10分钟；加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后用200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入1. Og/L II型胶原酶消化液，37°C消化O. 5小时；加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；在1000转/分钟条件下离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为I X 106/ml，接种至25cm2培养瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培养基；置37°C、饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液I次，并摄片记录；待细胞汇合度达80%后，用O. 25%胰蛋白酶-O. 02% EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于37°C消化2_3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟下离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以I X IOVml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70%瓶底重复以上步骤。S2、hAMSCs 的原代培养将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000转/分钟进行15分钟离心，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用O. OlM PBS 30mL吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟离心，洗涤2次，收集细胞；接种细胞前吸取FBS 3mL加入T75cm2型细胞培养瓶，置37°C，5%C02，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20% FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0父106细胞/1111，接种于包被后的175(^2型细胞培养瓶中，置于371，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次；观察细胞贴壁生长至80-90%汇合时，以O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，所得细胞为原代细胞。S3、hAMSCs的传代培养与扩增观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80-90 %汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取IOml O. OlM PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化液1. 0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起；加入1. Oml FBS中止胰酶消化；加入IOml O. OlM PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟进行10分钟离心；弃去上清液，加入IOml DMEM/F12重悬细胞，按1:2-1:3比例传代培养；培养体系为20% FBS,4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶。置37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第I代(passagel，Pl)hAMSCs，待细胞生长至80-90%汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩
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>曰OS4、hAMSCs细胞免疫表型的检测取培养第2或第3代细胞，首先用O. 25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至IXlOVml ;分别加入下列鼠抗人单克隆抗体⑶34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置 4°C孵育半小时，PBS洗I次，进行流式细胞仪检测分析；流式细胞仪检测显示，BMSCs表达CD29、CD44 和 CD 106。 S5、hAMSCs诱导分化为神经元样细胞取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60 %时，换成诱导培养基(DMEM+10% FBS+lymol/L ATRA+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF) ;37°C、5% CO2，饱和湿度静置培养；加入诱导液2小时后细胞形态即明显变化，光镜下BMSCs的细胞质向核收缩，呈典型的核周体形态；3 5小时后多数细胞能形成神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网，但细胞数目无明显增加；3天后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态，伸出突触(类似轴突或树突)，部分细胞之间拉成网状。S6、细胞免疫荧光染色培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。贴壁细胞去培养基，用PBS洗3次，经4 %的多聚甲醛固定30分钟，PBS洗涤3次，O. 3% TritonX-1OO处理20分钟，PBS漂洗3次，10%羊血清室温封闭20分钟，吸出血清，分别加入兔抗人NSE(1 500)、GFAP(1 1000)，37°C孵育2小时，然后PBS洗3次，加入羊抗鼠-FITCd 500)孵30分钟，染色可见50-70% NSE,25-50% GFAP阳性，Nestin阳性细胞在48h时下降为1. 6%0本发明应用全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导人羊膜间充质干细胞(human amnionmembrane mesenchymal stem cells,hAMSCs)分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，而且表达神经细胞标志蛋白，提示BMSCs仍然保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1.一种人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞诱导方法，其特征在于，其应用全反式维甲酸联合bFGF、EGF诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞，所述方法包括以下步骤hAMSCs分离，hAMSCs原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs细胞免疫表型的检测，hAMSCs诱导分化为神经元样细胞以及细胞免疫荧光染色；其中， 所述的hAMSCs分离的步骤包括无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约Imm3碎块，加入2.5g/L胰蛋白酶37°C消化10分钟；加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后用200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入1. Og/L II型胶原酶消化液，37°C消化O. 5小时；加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；在1000转/分钟条件下离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为IX IO6/ml，接种至25cm2培养瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培养基；置37。。、饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液I次，并摄片记录；待细胞汇合度达80%后,用O. 25%膜蛋白酶-O. 02% EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于37°C消化2_3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟下离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以I X IOVml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70%瓶底重复以上步骤； 所述的hAMSCs的原代培养步骤包括将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000转/分钟进行15分钟离心，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用O. OlM PBS 30mL吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟离心，洗涤2次，收集细胞；接种细胞前吸取FBS 3mL加入T75cm2型细胞培养瓶，置37°C，5% CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20% FBS，4ng/ml表皮生长因子的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1. OX IO6细胞/ml，接种于包被后的T75cm2型细胞培养瓶中，置于37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次；观察细胞贴壁生长至80-90%汇合时，以O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，所得细胞为原代细胞； 所述的hAMSCs的传代培养与扩增步骤包括观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取IOmlO. OlM PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入O. 25 %胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化液1. 0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入1. Oml FBS中止胰酶消化；加入IOml O. OlM PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟进行10分钟离心；弃去上清液，加入IOml DMEM/F12重悬细胞，按1: 2-1 : 3比例传代培养；置371，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第I代(Pl)hAMSCs，待细胞生长至80-90%汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩增； 所述hAMSCs细胞免疫表型的检测步骤包括取培养第2或第3代细胞，首先用O. 25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至IXlOVml ;分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置4°C孵育半小时，PBS洗I次，进行流式细胞仪检测分析； 所述的hAMSCs诱导分化为神经元样细胞的步骤包括取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60%时，换成诱导培养基；37°C、5% CO2，饱和湿度静置培养；以及所述的细胞免疫荧光染色步骤包括培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。
2.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞诱导方法，其特征在于，所述hAMSC s诱导分化为神经元样细胞的步骤中的诱导培养基为DMEM+10 %FBS+1 μ mol/LATRA+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF。
全文摘要
本发明提供一种应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化为神经元样细胞的方法，所述方法包括以下步骤hAMSCs分离，hAMSCs原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs细胞免疫表型的检测，hAMSCs诱导分化为神经元样细胞以及细胞免疫荧光染色。本发明的诱导方法应用全反式维甲酸联合bFGF、EGF诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白，实现了间充质细胞跨胚层分化为非间充质细胞的能力，使其有可能成为今后临床应用更为理想的种子细胞。
文档编号C12N5/0793GK103013917SQ20121050524
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者陆华 申请人:陆华